专利名称：抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯残留量的测定方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯残留量的测定方法。
背景技术：
抗毒素/抗血清(Antitoxin/Antiserum)是指采用特定的抗原免疫动物后,再收集高效价免疫血清，并经过提取、纯化后，制备出含完整抗体(IgG)或抗体片段[F(ab’)2]的免疫球蛋白制品；以用于预防和治疗各相应疾病引起的感染。由于抗毒素/抗血清原料来源于马匹，而马匹又饲养在开放的环境中，其可能携带的病毒较多，因而该制品存在生物安全性问题。为了保证该制品的安全性，除要控制免疫马匹饲养环境和原料血浆质量外，在抗毒素/抗血清生产过程中，如何有效除去或灭活原料血浆中的病毒，是获得安全可靠的抗毒素/抗血清等血液制品的关键问题。目前国内外较为成熟的病毒灭活/去除方法有巴氏消毒法、干热法、有机溶剂/ 去污剂法、纳米膜过滤法、光化学法等，但对于动物源性生化提取制品，尤其是规模化生产的抗毒素/抗血清的灭活病毒工艺，国内外至今未见报道。有机溶剂/去污剂法是利用有机溶剂和去污剂的配伍，破坏病毒的脂质包膜，使其失去传染性，从而达到灭活病毒的目的。参照欧洲药品管理局(EMEA)和我国国家食品药品监督管理局发布的针对人血液制品的相关技术法规在马破伤风免疫球蛋白(F(ab’)2)生产工艺中增加有机溶剂/去污剂处理病毒灭活步骤，有机溶剂选用磷酸三丁酯，去污剂选用Triton X-100。该方法有很好的蛋白质兼容性，能有效灭活病毒，且对蛋白的结构和功能的影响甚微。但如何从制品中除去加入的有机溶剂和去污剂，则是该方法最大的难点。抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯的残留量超过规定的限度会影响人体的健康中，因此，经有机溶剂/去污剂(磷酸三丁酯/ Triton X-100)灭活的马破伤风免疫球蛋白(F(ab’)2)中磷酸三丁酯的残留量测定是涉及其安全性方面的关键指标之一。然而磷酸三丁酯在抗毒素/抗血清中的残留量极低，处于ppm极，在测定前的预处理过程中容易损失，容易影响测定的准确性。国内盛凤仙《冻干人纤维蛋白胶制品中磷酸三丁酯残留量的气相色谱法测定》(中国医药工业杂志，2002年，33卷第3期)，介绍了一种冻干人纤维蛋白胶中磷酸三丁酯残留的测定方法，但在抗毒素/抗血清制品中相关磷酸三丁酯残留测定方法未见应用。
发明内容
为解决对抗毒素/抗血清制品中磷酸三丁酯残留量的测定，本发明的目的是提供一种经有机溶剂/去污剂法灭活后的抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯残留量的测定方法，该方法能准确地测定抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯残留量，并且准确、简便、快速。本发明通过下列技术方案实现一种抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯残留量的测定方法，包括分别吸取对照品溶液和供试品溶液，采用常规气相色谱法进行测定，再将所得结果按现有技术中的常规内标法计算，即得到抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯的残留量，其特征在于所述对照品溶液和供试品溶液的制备经过下列各步骤
(1)将内标物磷酸三丙酯溶解于正己烷中，制成每ImL正己烷中含磷酸三丙酯300 500 μ g的内标物溶液；
(2)将对照品磷酸三丁酯溶解于正己烷中，制成每ImL正己烷中含磷酸三丁酯500 700 μ g的溶液；分别取该溶液 ομ L、20y L、40y L、60y L、80y L，然后分别在每一溶液中加水3. OmL、加步骤(I)所得内标物溶液50 μ L以及浓度为I. 5mol/L的高氯酸溶液O. 75mL, 振汤I分钟后，直于37 C下保持10分钟，再分别加入正己烧4mL,振汤2分钟；最后在2000 转/分的转速下离心分离20分钟，分离出的各上层溶液即为五个对照品溶液；
(3)取供试品抗毒素/抗血清3.OmL，加入步骤(I)所得内标物溶液50 μ L以及浓度为I. 5mol/L的高氯酸溶液O. 75mL，振荡I分钟后，置于37°C下保持10分钟，再加入正己烷 4mL,振荡2分钟；最后在2000转/分的转速下离心分离20分钟，分离出的上层溶液即为供试品溶液。所述供试品抗毒素/抗血清是经过有机溶剂/去污剂法灭活后的抗毒素、抗血清。所述采用气相色谱法进行测定的色谱条件为气相色谱柱，酸改性聚乙二醇 (20M)毛细管柱，柱温140°C，进样系统温度190°C，进样体积为I 2yL，采用火焰离子化检测器或氮磷检测器，检测器温度为210°C。所述酸改性聚乙二醇(20M)毛细管柱为HP-FFAP或DA-FFAP，规格为 25mX O. 320mmX O. 50 μ m。所述正己烷和高氯酸均为分析纯。本发明能对破伤风抗毒素、抗狂犬病血清、抗蛇毒血清等抗毒素/抗血清制品中的磷酸三丁酯残留量进行测定。本发明的优点和有益效果是样品加入酸溶液，并经保温，再加入正己烷离心萃取，能除去大分子蛋白及杂质，有效成分被萃取到了正己烷中，而正己烷不经浓缩处理，直接进样分析，能避免浓缩过程中的损失，也保证了仪器的灵敏度，从而评价抗毒素/抗血清制品的质量。本发明提供的测定抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯的残留量的方法，具有准确、 快速、简便等特点。
具体实施例方式通过以下的实施例对本发明做进一步阐述，但本发明保护的范围并不限于下列实施例所述内容。实施例I
破伤风抗毒素中磷酸三丁酯残留量的测定
仪器1、Aglient 7890A气相色谱仪,配有高纯氮气、氢气发生器、空气发生器、氢离子火焰检测器(FID)和ChemStaions工作站；Feb_80型离心机，Xff-80型旋涡混合器。2、 Mettler AE 240 电子天平。试剂与试药磷酸三丁酯分析标准品(上海晶纯试剂有限公司，批号L0T9289);磷酸三丙酯(SIGMA-ALDRICH，含量99%，批号255327_5G 02524BH)。正己烷及高氯酸均为分析纯。
经过下列各步骤
(1)将内标物磷酸三丙酯溶解于正己烷中，制成每ImL正己烷中含磷酸三丙酯400μ g 的内标物溶液；
(2)将对照品磷酸三丁酯溶解于正己烷中，制成每ImL正己烷中含磷酸三丁酯600μ g 的溶液；再分别取该溶液 ο μ L、20 μ L、40 μ L、60 μ L、80 μ L，然后分别在每一溶液中加水
3.OmL、加步骤(I)所得内标物溶液50 μ L以及浓度为I. 5mol/L的高氯酸溶液O. 75mL，振荡 I分钟后，直于37 C下保持10分钟后，再分别加入正己烧4mL,振汤2分钟；最后在2000转 /分的转速下离心分离20分钟，分离出的各上层溶液即为五个对照品溶液；
(3)取经过常规有机溶剂/去污剂法灭活后的破伤风抗毒素3.OmL，加入步骤(I)所得内标物溶液50 μ L以及浓度为I. 5mol/L的高氯酸溶液O. 75mL,振荡I分钟后，置于37°C下保持10分钟后，再加入正己烷4mL，振荡2分钟；最后在2000转/分的转速下离心分离20 分钟，分离出的上层溶液即为供试品溶液；
(4)分别吸取步骤(2)所得五个对照品溶液和步骤(3)所得供试品溶液，采用常规气相色谱法进行测定，以各磷酸三丁酯对照品与内标物的峰面积之比，对磷酸三丁酯对照品浓度做直线回归，求得直线回归方程，再将供试品的测定结果代入回归方程进行计算，最终得出供试品破伤风抗毒素中的磷酸三丁酯含量为2. 2 μ g/mL。其中气相色谱法的色谱条件为气相色谱柱，酸改性聚乙二醇(20M)毛细管柱，柱温140°C，进样系统温度190°C，进样体积为2 μ L，采用火焰离子化检测器，检测器温度为210°C;其中，酸改性聚乙二醇(20M)毛细管柱为HP-FFAP，规格为25mX0. 320mmX0. 50 μ m ;理论板数按磷酸三丁酯峰计算应不低于 5000，磷酸三丁酯峰与磷酸三丙酯峰的分离度应不小于I. 5。实施例2
抗狂犬病血清中磷酸三丁酯残留量的测定
仪器1、岛津2010气相色谱仪，配有高纯氮气、氢气发生器、空气发生器、氮磷检测器 (NPD)和 LCsolution 工作站;Feb_80 型离心机，Xff-80 型旋涡混合器。2、Mettler AE 240 电子天平。试剂与试药磷酸三丁酯分析标准品(上海晶纯试剂有限公司，批号L0T9289);磷酸三丙酯(SIGMA-ALDRICH，含量99%，批号255327_5G 02524BH)。正己烷及高氯酸均为分析纯。经过下列各步骤
(1)将内标物磷酸三丙酯溶解于正己烷中，制成每ImL正己烷中含磷酸三丙酯300μ g 的内标物溶液；
(2)将对照品磷酸三丁酯溶解于正己烷中，制成每ImL正己烷中含磷酸三丁酯500μ g 的溶液；再分别量取该溶液 ο μ L、20 μ L、40 μ L、60 μ L、80 μ L，然后分别在每一溶液中加水3. OmL、加步骤(I)所得内标溶液50 μ L以及浓度为I. 5mol/L的高氯酸溶液O. 75mL,振汤I分钟后，直于37 C下保持10分钟后，再分别加入正己烧4mL,振汤2分钟；最后在2000 转/分的转速下离心分离20分钟，分离出的各上层溶液即为五个供试品溶液；
(3)取经过常规有机溶剂/去污剂法灭活后的抗狂犬病血清3.OmL，加入步骤(I)所得内标物溶液50 μ L以及浓度为I. 5mol/L的高氯酸溶液O. 75mL，振荡I分钟后，置于37°C下保持10分钟后，再加入正己烷4mL，振荡2分钟；最后在2000转/分的转速下离心分离20分钟，分离出的上层溶液即为供试品溶液；
(4)分别吸取步骤(2)所得五个对照品溶液和步骤(3)所得供试品溶液，采用常规气相色谱法进行测定，以各磷酸三丁酯对照品与内标物的峰面积之比，对磷酸三丁酯对照品浓度做直线回归，求得直线回归方程，再将供试品的测定结果代入回归方程进行计算，最终得出供试品抗狂犬病血清中磷酸三丁酯残留量为I. 8 μ g/mL。其中采用气相色谱法的色谱条件为气相色谱柱，酸改性聚乙二醇(20M)毛细管柱，柱温140°C，进样系统温度190°C，进样体积为2 μ L，采用氮磷检测器，氮磷检测器温度为210°C;其中，酸改性聚乙二醇(20Μ)毛细管柱为DA-FFAP，规格为25mX0. 320mmX0. 50 μ m ;理论板数按磷酸三丁酯峰计算应不低于 5000，磷酸三丁酯峰与磷酸三丙酯峰的分离度应不小于I. 5。实施例3
抗蛇毒血清中磷酸三丁酯残留量的测定
仪器1、Aglient 7890A气相色谱仪,配有高纯氮气、氢气发生器、空气发生器、氢离子火焰检测器(FID)和ChemStaions工作站；Feb_80型离心机，Xff-80型旋涡混合器。2、 Mettler AE 240 电子天平。试剂与试药磷酸三丁酯分析标准品(上海晶纯试剂有限公司，批号L0T9289);磷酸三丙酯(SIGMA-ALDRICH，含量99%，批号255327_5G 02524BH)。正己烷及高氯酸均为分析纯。经过下列各步骤
(1)将内标物磷酸三丙酯溶解于正己烷中，制成每ImL正己烷中含磷酸三丙酯500μ g 的内标物溶液；
(2)将对照品磷酸三丁酯溶解于正己烷中，制成每ImL正己烷中含磷酸三丁酯700μ g 的溶液；再分别量取该溶液 ο μ L、20 μ L、40 μ L、60 μ L、80 μ L，然后分别在每一溶液中加水3. OmL、加步骤(I)所得内标物溶液50 μ L以及浓度为I. 5mol/L的高氯酸溶液O. 75mL，振汤I分钟后，直于37 C下保持10分钟后，再分别加入正己烧4mL,振汤2分钟；最后在2000 转/分的转速下离心分离20分钟，分离出的各上层溶液即为五个对照品溶液；
(3)取经过常规有机溶剂/去污剂法灭活后的抗毒素、抗血清3.OmL，加入步骤(I)所得内标物溶液50 μ L以及浓度为I. 5mol/L的高氯酸溶液O. 75mL,振荡I分钟后，置于37°C 下保持10分钟后，再加入正己烷4mL，振荡2分钟；最后在2000转/分的转速下离心分离 20分钟，分离出的上层溶液即为供试品溶液；
(4)分别吸取步骤(2)所得五个对照品溶液和步骤(3)所得供试品溶液，采用常规气相色谱法进行测定，以各磷酸三丁酯对照品与内标物的峰面积之比，对磷酸三丁酯对照品浓度做直线回归，求得直线回归方程，再将供试品的测定结果代入回归方程进行计算，最终得出供试品抗蛇毒血清中磷酸三丁酯残留量为2. 8 μ g/mL。其中采用气相色谱法的色谱条件为气相色谱柱，酸改性聚乙二醇(20M)毛细管柱，柱温140°C，进样系统温度190°C，进样体积为I 2μ L，采用火焰离子化检测器，火焰离子化检测器温度为210°C;其中，酸改性聚乙二醇(20M)毛细管柱为HP-FFAP，规格为25mX0. 320mmX0. 50 μ m ;理论板数按磷酸三丁酯峰计算应不低于5000，磷酸三丁酯峰与磷酸三丙酯峰的分离度应不小于I. 5。
权利要求
1.一种抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯残留量的测定方法，包括分别吸取对照品溶液和供试品溶液，采用常规气相色谱法进行测定，再将所得结果按常规内标法计算，即得到抗毒素、抗血清中磷酸三丁酯的残留量，其特征在于所述对照品溶液和供试品溶液的制备经过下列各步骤(1)将内标物磷酸三丙酯溶解于正己烷中，制成每ImL正己烷中含磷酸三丙酯300 500 μ g的内标物溶液；(2)将对照品磷酸三丁酯溶解于正己烷中，制成每ImL正己烷中含磷酸三丁酯500 700 μ g的溶液；分别取该溶液 ομ L、20y L、40y L、60y L、80y L，然后分别在每一溶液中加水3. OmL、加步骤(I)所得内标物溶液50 μ L以及浓度为I. 5mol/L的高氯酸溶液O. 75mL, 振荡I分钟后，置于37°C下保持10分钟后，再分别加入正己烷4mL，振荡2分钟；最后在 2000转/分的转速下离心分离20分钟，分离出的各上层溶液即为五个对照品溶液；(3)取供试品抗毒素/抗血清3.OmL，加入步骤(I)所得内标物溶液50 μ L以及浓度为I.5mol/L的高氯酸溶液O. 75mL，振荡I分钟后，置于37°C下保持10分钟后，再加入正己烷 4mL,振荡2分钟；最后在2000转/分的转速下离心分离20分钟，分离出的上层溶液即为供试品溶液。
2.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于所述采用气相色谱法的色谱条件为 气相色谱柱，酸改性聚乙二醇(20M)毛细管柱，柱温140°C，进样系统温度190°C，进样体积为I 2μ L，采用火焰离子化检测器或氮磷检测器，检测器温度为210°C。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于所述酸改性聚乙二醇(20M)毛细管柱为 HP-FFAP 或 DA-FFAP，规格为 25mX O. 320mmX0. 50 μ m。
4.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于所述正己烷和高氯酸均为分析纯。
5.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于所述供试品抗毒素、抗血清是经过有机溶剂/去污剂法灭活后的抗毒素、抗血清。
全文摘要
本发明提供一种抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯残留量的测定方法，先配制内标溶液、对照品溶液、供试品溶液；再将对照品溶液和供试品溶液，采用常规气相色谱法进行测定；所得结果按现有技术中的常规内标法计算，即得到磷酸三丁酯残留量。本发明能除去大分子蛋白及杂质，有效成分被萃取到了正己烷中，而正己烷不经浓缩处理，直接进样分析，能避免浓缩过程中的损失，也保证了仪器的灵敏度；本发明能准确、快速、简便测定出抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯的残留量，从而评价制品质量。
文档编号G01N30/06GK102590388SQ20121004373
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者吴笛, 杨冬, 罗靖雄 申请人:玉溪九洲生物技术有限责任公司