专利名称：马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法。
背景技术：
马铃薯纺锤块茎类病毒病是威胁我国马铃薯生产的检疫性病害，但该病害在我国却普遍存在，因此，准确的检验技术和方法对于防治马铃薯纺锤块茎类病毒病至关重要。然而，无论采用哪种技术，都必须有标准物质，即阴性对照和阳性对照，没有这些标准物质，检测工作就无法进行。然而目前马铃薯纺锤块茎类病毒的标准物质主要采用繁殖阳性或阴性植株的方式来获得，这种方式进行活体保存非常不方便，需要不断的繁殖，费时、费力。
发明内容
本发明是要解决现有马铃薯纺锤块茎类病毒的标准物质的保存非常不方便，需要不断的繁殖，费时、费力的问题，提供马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法。本发明马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法，按以下步骤进行一、采用常规的马铃薯纺锤块茎类病毒检验方法对马铃薯植物组织进行检验，将感染了马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯植物组织作为阳性组织，将没有感染马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯植物组织作为阴性组织；二、将阳性组织在常温下自然干燥至恒重，之后进行粉碎至80 目，得到阳性标准物质；将阴性组织在常温下自然干燥至恒重，之后进行粉碎至80目，得到阴性标准物质；将阳性标准物质和阴性标准物质进行密封，于室温、干燥条件下保存，即完成马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备。步骤一所述常规的马铃薯纺锤块茎类病毒检测方法为聚丙烯酰胺往返电泳 (R-PAGE)、核酸斑点杂交(NASH)或 RT-PCR。本发明的马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质在使用时所取用量为待检新鲜样品所取质量的1/5 1/2，其他使用方法与待检新鲜样品相同。本发明创造以非常简洁的方式研制出了马铃薯纺锤块茎类病毒的标准物质，该标准物质制作简单，保存和使用都很方便，对于防治马铃薯纺锤块茎类病毒必不可少。本发明制备的标准物质保存容易，保存时间长，在室温、干燥条件下保存I年后仍可以使用。常规的马铃薯类病毒标准物质的制备一般采用组织培养继代或种植保存法，这些方法消耗大量的人力、物力、财力和空间，而且，一旦操作不当，隔离控制不严格还容易是病原外流，传染健康的马铃薯，对生产造成威胁。本发明的制备过程极为简单，无需高端设备，使用方便，准确性好，保存和运输方便，填补了我国没有马铃薯纺锤块茎类病毒标准物质的空白。
图I为传统标准物质与具体实施方式
一制备的标准物质进行核酸斑点杂交的检测结果；图2为传统标准物质与具体实施方式
一制备的标准物质进行聚丙烯酰胺往返电泳的检测结果。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法， 按以下步骤进行一、采用常规的马铃薯纺锤块茎类病毒检验方法对马铃薯植物组织进行检验，将感染了马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯植物组织作为阳性组织，将没有感染马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯植物组织作为阴性组织；二、将阳性组织在常温下自然干燥至恒重，之后进行粉碎至80目，得到阳性标准物质；将阴性组织在常温下自然干燥至恒重，之后进行粉碎至80目，得到阴性标准物质；将阳性标准物质和阴性标准物质进行密封，于室温、干燥条件下保存，即完成马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备。为验证马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的使用效果，进行以下实验(一)核酸斑点杂交I、类病毒样品RNA的提取取O. 2g传统马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质(即感染纺锤块茎类病毒的马铃薯)和O. 04g O. Ig本实施方式制备的标准物质，分别进行以下操作放于研样袋中， 加入O. 3mL提取缓冲液，磨碎，转入1.5mL离心管中，37°C孵育15min，加入等体积的氯仿 (O. 3mL)，振荡离心管，直至出现乳状液，短暂离心至溶液分离，吸出上清液即为RNA样品， 4°C保存，备用。2、点样及固定吸取2 μ L受检样品RNA提取液，点在尼龙膜的方块格中，将点样后的膜放在紫外交联仪上正反面各交联lmin，能量为1200。3、杂交取5mL的杂交液，加入I μ L探针，混匀，将固定好的膜放入杂交管中，排除气泡， 68。。，8 15rpm杂交过夜。4、洗膜a.用镊子取出膜，放入装有20mL 2 X SSC, O. 1% SDS溶液的平皿中，在室温下振荡洗漆2次，每次5min。b.用镊子将膜转入杂交管，加入适量O. I X SSC, O. 1% SDS溶液(先55°C预热)， 在杂交管中用最大转速洗漆2次,每次15min, 55 °C。c.将膜取出转入装有20mL洗涤缓冲液的平皿中振荡洗涤5min。5、孵育(在15 25 °C下搅拌进行)I)在20 30mL阻断液中孵育30min ；2)在IOmL抗体液中孵育30min ；3)在20 30mL洗涤液中洗涤2 X 15min ；4)在15mL检测缓冲液中平衡2 5min ；6、信号检测将膜夹在两层保鲜膜中间，将上层保鲜膜提起，在膜上均匀涂上新鲜配制的NBT/BCIP显色液，然后避光存放，显色，当达到所需的点强度后(约30min)，照相或复印备存。7、结果尼龙膜上出现蓝紫色斑点者为马铃薯纺锤块茎类病毒阳性样品。检测结果如图I 所示，图中I和2为传统马铃薯纺锤块茎类病毒检测的阳性标准物质，3和4为本实施方式制备的阳性标准物质。可以看出两者的检测效果相当。( 二)聚丙烯酰胺往返电泳I、样品粗提液制备取传统马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质O. 5g(5cm以上的试管苗)和O. Ig O. 25g本实施方式制备的标准物质，分别进行以下操作放入冷冻后的研钵中，加入少许皂土和SDS进行研磨。研碎后向研钵中加入ImL核酸提取缓冲液，ImL Tris饱和酹，ImL氯仿， 10 μ L巯基乙醇,充分研磨。4°C, 10000r/min离心15min,将上层水相转移到另一清洁的离心管中，约400 μ L。加入150 μ L NaAc，lmL冷无水乙醇，静置于-20°C的冰箱中I. 5h以上。2、核酸提取将冻存的离心管取出，4°C、10000r/min离心15min，弃上清，控干。待水吸干后，向离心管中加75%冷乙醇，加入量是离心管容积的1/3，清洗3次，将剩余乙醇全部挥发掉。3、试样获得将TAE缓冲液300 μ L加入到盛有核酸的I. 5mL离心管中进行溶解，_20°C备用。4、测定步骤4. I制板取洁净电泳槽，琼脂糖溶液封底，注入聚丙烯酰胺凝胶，加样梳插入做成泳道。4. 2加样取核酸提取物10 20 μ L，与5 10 μ L指示剂混匀加入样品孔。4. 3正向电泳加入TBE电泳缓冲液工作液，进行从负极到正级电泳，电泳仪电压调到200V。当示踪染料迁移到凝胶底部时，停止正向电泳。将电泳槽中缓冲液倒入烧杯，把电泳槽置于电热烘箱中75°C变性15min，向电泳槽中加入75°C的TBE缓冲液工作液。4. 4反向电泳在烘箱中进行从正极到负极的反向电泳，电泳仪电压调至100 200V，当二甲苯兰示踪染料带迁移到距胶板上方2cm左右时停止电泳，取出凝胶片进行染色。4. 5固定把凝胶片放在置有500mL核酸固定液的培养皿中，轻轻振荡IOmin,固定
O.5 lh，然后用50mL注射器吸掉固定液。4. 6染色向培养皿中加入300mL染色液，轻轻振荡lOmin，染色30 60min，然后吸出染色液。4. 7漂洗用蒸馏水清洗凝胶板，以除掉残留的染色液，共冲洗三次，每次用水 200 400mL，每次冲洗15S。4. 8显影加入核酸显影液200 400mL，轻轻摇荡，直到核酸带显现清楚为止，吸出显影液，将凝胶放入固定液中拍照或放入增色液中。4. 9增色吸出显影液,加入增色液200 400mL,增色5min,吸掉增色液，自来水终止，拍照。5、结果出现特异性条带的为阳性结果。检测结果如图2所示，图中泳道a和b为传统马铃薯纺锤块茎类病毒检测的阳性标准物质，泳道c和d为本实施方式制备的阳性标准物质。 可以看出两者的检测效果相当。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一所述常规的马铃薯纺锤块茎类病毒检测方法为聚丙烯酰胺往返电泳、核酸斑点杂交或RT-PCR。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一所述马铃薯植物组织为马铃薯块茎、叶片或茎杆。其它与具体实施方式
一相同。
权利要求
1.马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法，其特征在于马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法，按以下步骤进行一、采用常规的马铃薯纺锤块茎类病毒检验方法对马铃薯植物组织进行检验，将感染了马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯植物组织作为阳性组织，将没有感染马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯植物组织作为阴性组织；二、将阳性组织在常温下自然干燥至恒重，之后进行粉碎至80目，得到阳性标准物质；将阴性组织在常温下自然干燥至恒重，之后进行粉碎至80目，得到阴性标准物质；将阳性标准物质和阴性标准物质进行密封，于室温、干燥条件下保存，即完成马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备。
2.根据权利要求I所述的马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法，其特征在于步骤一所述常规的马铃薯纺锤块茎类病毒检测方法为聚丙烯酰胺往返电泳、核酸斑点杂交或RT-PCR。
3.根据权利要求I所述的马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法，其特征在于步骤一所述马铃薯植物组织为马铃薯块茎、叶片或茎杆。
全文摘要
马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法，涉及一种马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法。是要解决现有马铃薯纺锤块茎类病毒的标准物质的保存非常不方便，需要不断的繁殖，费时、费力的问题。方法采用常规的马铃薯纺锤块茎类病毒检验方法对马铃薯植物组织进行检验，将感染了马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯植物组织作为阳性组织，将没有感染马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯植物组织作为阴性组织；将阳性组织和阴性组织在常温下自然干燥至恒重，之后进行粉碎至80目，于室温、干燥条件下保存，即完成。本发明的方法简洁，制备的标准物质保存容易，保存时间长。
文档编号G01N1/28GK102607909SQ20121005359
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者刘尚武, 吕典秋, 宿飞飞, 张抒, 李勇, 王文重, 王绍鹏, 白艳菊, 董学志, 邱彩玲, 魏琪 申请人:黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所