专利名称：尿层粘连蛋白在制备诊断膀胱癌的医疗器械中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及尿层粘连蛋白的应用，具体地说，是尿层粘连蛋白在制备诊断膀胱癌的医疗器械中的应用，以及一种膀胱癌诊断试纸及其应用。
背景技术：
膀胱尿路上皮癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，是男性第6、女性第10高发肿瘤。首次治疗后复发率高达80%。因此，术后随访是治疗的重要内容。目前膀胱癌的诊断主要依靠尿道膀胱镜+尿脱落细胞检查。但膀胱镜检查创伤大、费用高，有一定的并发症，能坚持按照医嘱检查的只有患者40%左右；且膀胱镜检查不易发现早期、特殊部位的膀胱癌病灶。尿脱落细胞检查虽然是一种无创性检查，但其诊断的灵敏度只有30%左右，且受检查者的影响因素较大，并不是一种理想的诊断方法。临床上迫切需要一种灵敏度和特异度较高的无创性诊断方法。肿瘤微环境是肿瘤发生、发展过程中所处的环境，主要由细胞外基质(ECM)、成纤维细胞、血管内皮细胞和免疫细胞组成。肿瘤微环境提供了肿瘤快速生长所需要的“土壤”；同时肿瘤侵袭、浸润和转移过程中伴随着肿瘤微环境成分及结构的变化。基膜(basallamina, BM)是由多种纤维蛋白构成的复杂的细胞外结构，位于上皮细胞基底面与结缔组织的膜状结构，是ECM的重要组成部分。BM不仅对组织细胞起支持连接作用，同时具有渗透性屏障的作用，是物质通透的半透膜，并调节多种分子及细胞的活动。基膜是由不同蛋白纤维组成的网状结构，主要成分有层粘连蛋白(laminin，LN)、IV型胶原、巢蛋白、肌腱蛋白、钙结合蛋白、硫酸肝素糖蛋白等。LN在基膜的形成中起重要作用，因为LN具有许多不同的结构域，其中具有与其他蛋白复合物结合的特殊位点。此外，LN能够同细胞表面受体结合，也能够同其他的LN分子以及同其他的糖蛋白，包括基膜中其他的一些成份结合。更重要的是，LN同IV型胶原结合，形成分隔的交联网状结构，形成的基膜通过LN与细胞表面受体紧密结合，将基膜与覆盖的细胞紧密结合起来。因此，LN不仅是基膜的主要成分，也是基膜的组织者，而IV型胶原则是基膜的网状钢架。层粘连蛋白(laminin, LN)主要存在于基膜结构中，是基膜所特有的非胶原糖蛋白，相对分子质量为820kDa，含13-15%的糖，有三个亚单位，即重链(a链，400kDa)和^ I (215kDa)、^ 2 (205kDa)两条轻链。结构上呈现不对称的十字形，由一条长臂和三条相似的短臂构成。这四个臂均有棒状节段和球状的末端域。P I和P2短臂上有两个球形结构域，a链上的短臂有三个球形结构域，其中有一个结构域同IV型胶原结合，第二个结构域同肝素结合，还有同细胞表面受体结合的结构域。正是这些独立的结合位点使LN作为一个桥梁分子，介导细胞同基膜结合。
LN的主要功能就是作为基膜的主要结构成分对基膜的组装起关键作用，在细胞表面形成网络结构并将细胞固定在基膜上。LN还有许多其他的作用，如在细胞发育过程中刺激细胞粘着、细胞运动。LN还能够刺激胚胎中神经轴的生长，并促进成年动物的神经损伤后重生长和再生。如同纤粘连蛋白，细胞外的LN能够影响细胞的生长、迁移和分化。LN在原生殖细胞的迁移中起关键作用。基膜与肿瘤的关系比较复杂。基膜存在于上皮基底部及肿瘤细胞间，支持和营养肿瘤组织，同时参与肿瘤细胞及血管内皮细胞的黏附增殖，与肿瘤的生长及恶化密切相关。肿瘤细胞和内皮细胞内LN的表达明显上调，但LN也能促进间质金属蛋白酶(MMP)的表达， MMP能降解基膜成分，从而有利于肿瘤细胞向周围组织的浸润及血管芽的新生。有研究发现，膀胱癌进展过程中伴随基膜的破坏，膀胱癌组织中基膜的破坏与肿瘤的侵袭和转移密切相关，基膜中LN和IV型胶原的表达可作为肿瘤生物学特性的预后指标。因为膀胱癌细胞及内皮细胞中LN表达上调，同时伴随肿瘤进展、基膜破坏，LN降解增多，我们认为，膀胱癌病人尿液中LN水平可能增高，尿LN有可能成为膀胱癌肿瘤标记物。中国专利文献CN101634655A公开了一种快速诊断膀胱癌的FN试纸及其应用，包括底板、样品垫、金胶垫、硝酸纤维膜层和吸水纸层，所述的金胶垫中含有胶体金与抗尿纤维连接蛋白抗体结合的金标抗体复合物，用于快速诊断膀胱癌。孙方浒等采用免疫组化方法观察膀胱移行细胞癌中组织蛋白酶D和层粘连蛋白(LN)的表达，提出LN表达可作为肿瘤生物学特性的预后指标(详见孙方浒等.组织蛋白酶D和层粘连蛋白在膀胱癌中的表达及意义.中华泌尿外科杂志，2002，23(4): 237-237.)。但是关于尿层粘连蛋白在制备诊断膀胱癌的医疗器械中的应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种尿层粘连蛋白LNl的应用。本发明的第二个目的是，提供一种诊断膀胱癌的LNl试纸。本发明的第三个目的是，提供一种诊断膀胱癌的LNl试纸的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是尿层粘连蛋白LNl在制备诊断膀胱癌的医疗器械中的应用。所述的膀胱癌是膀胱尿路上皮癌，所述的医疗器械是诊断试纸或试剂盒，所述的医疗器械的诊断样品是尿液。所述的医疗器械的诊断闕值是尿LNl浓度10-100ng/ml。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种诊断膀胱癌的LNl试纸，包括底板、样品垫、金胶垫、硝酸纤维膜层和吸水纸层，所述的底板上依次覆盖样品垫、金胶垫、硝酸纤维膜层和吸水纸层，所述的硝酸纤维膜上含有牛血清白蛋白-尿LNl偶联物的测试线和抗鼠二抗的质控线，所述的金胶垫上含有胶体金与抗尿LNl抗体结合形成的金标抗尿LNl抗体复合物。所述的试纸的诊断样品是尿液，所述的试纸的检测闕值为尿LNl浓度IO-IOOng/ml o所述的硝酸纤维膜上有两条测试线，所述的测试线一靠近金胶垫，测试线一的检测阈值为尿LNl浓度10-40ng/ml，测试线二的检测阈值为尿LNl浓度40_100ng/ml。所述的试纸上具有至少一条质控线，其显色表示试纸有效。所述的金胶垫由玻璃纤维和固定其上的金标抗体组成，所述的样品垫为吸水性玻璃纤维层。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是所述的试纸在制备诊断膀胱癌的医疗器械中的应用。本发明优点在于
1、本发明提供了尿层粘连蛋白的新用途，为膀胱癌的大规模人群筛查、膀胱癌术后病人的自我检测提供方便、可靠、无创、价廉的方法，减少膀胱癌术后病人有创性检查方法一膀胱镜检查的次数，有助于浸润性膀胱癌的诊断，有助于判断和预测浅表非浸润性膀胱癌向浸润性膀胱癌发展的风险，指导膀胱癌的治疗；
2、本发明的试纸检测快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便、无需任何仪器设备，而且结果判断直观可靠、易于掌握，同时也方 便病人对病情自我监测；
3、通过采用两条测试线，增加了试纸的灵敏度，也提高了其特异度，既可以用于在高危人群中的筛查，又可以用于在膀胱癌术后病人的随访，应用范围比较广泛。
附图I是膀胱癌尿层粘连蛋白LNl诊断试纸的结构示意图。附图2是膀胱癌尿层粘连蛋白LNl诊断试纸的检测结果示意图。附图3是膀胱癌尿层粘连蛋白LNl诊断试纸的检测过程示意图。附图4是膀胱癌尿层粘连蛋白LNl半定量诊断试纸的结构示意图。附图5是膀胱癌尿层粘连蛋白LNl半定量诊断试纸的检测结果示意图。附图6是膀胱癌尿层粘连蛋白LNl半定量诊断试纸的检测过程示意图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。附图中涉及的附图标记和组成部分如下所示
I.底板2.样品垫
3.金胶垫4.硝酸纤维膜层
5.吸水纸层6.尿样
7.层析方向 实施例I
目前已知共有15种不同的LN亚型，LN1-15。(详见Julia Tzu, MD and M. PeterMarinkovich, MD. BRIDGING STRUCTURE WITH FUNCTION: STRUCTURAL, RE⑶LATORY, ANDDEVELOPMENTAL ROLE OF LAMININS. 7/ ^ J Biochem Cell Biol. 2008 ; 40(2): 199 -214.)本发明检测了其中LNl和LN5两种临床上常用的亚型。总体共182例，其中膀胱尿路上皮癌病例组92例；泌尿系其他疾病组72例；健康对照人群18例。采用人层粘连蛋白定量酶联检测试剂盒分别检测其中LNl和LN5两种亚型，检测步骤参照人层粘连蛋白定量酶联检测试剂盒使用说明书(上海森雄科技实业有限公司)。一、LN5亚型的ELISA检测结果
I 膀胱癌组24.24±21.872.膀胱癌术后组13. 48 ±7. 79
3.泌尿系其他疾病组:25.15±8. 10
4.健康对照组17. 40 ±6. 57
膀胱癌组高于膀胱癌术后组(P〈0. 001)和健康对照组(p=0. 022)，但膀胱癌与泌尿系其他疾病组无差异(P=O. 999)。ROC面积LN5=0. 482 (0. 409-0. 555)〈O. 50，说明LN5对膀胱癌没有诊断价值。二、LNl亚型的ELISA检测结果
I.膀胱癌组高于其它两组(71. 91±78. 02 vs. 31.72±11.12 vs. 33. 44±6. 95 ng/ml, P<0. 001, 0. 001)，而其他疾病组与健康人群组无差异(P=0. 802)。2.病理分期肌层浸润组(T2_4，46例)高于非肌层浸润组(Ta，Tl,46例)，其差异接近有统计学意义(87. 57±90. 44 vs. 56. 24±60. 25 ng/ml, P=O. 054)；
3.病理分级高级别组(32例)高于低级别组(60例)，差异有显著的统计学意义(110. 94±112. 28 vs. 51.08±38. 70 ng/ml ;P=0. 006)。表I尿LNl诊断膀胱尿路上皮癌的诊断价值
权利要求
1.尿层粘连蛋白LNl在制备诊断膀胱癌的医疗器械中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的膀胱癌是膀胱尿路上皮癌，所述的医疗器械是诊断试纸或试剂盒，所述的医疗器械的诊断样品是尿液。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的医疗器械的诊断闕值是尿LNl浓度10-100ng/ml。
4.一种诊断膀胱癌的LNl试纸，包括底板、样品垫、金胶垫、硝酸纤维膜层和吸水纸层，所述的底板上依次覆盖样品垫、金胶垫、硝酸纤维膜层和吸水纸层，其特征在于，所述的硝酸纤维膜上含有牛血清白蛋白-尿LNl偶联物的测试线和抗鼠二抗的质控线，所述的金胶垫上含有胶体金与抗尿LNl抗体结合形成的金标抗尿LNl抗体复合物。
5.根据权利要求4所述的试纸，其特征在于，所述的试纸的诊断样品是尿液，所述的试纸的检测闕值为尿LNl浓度10-100ng/ml。
6.根据权利要求4所述的试纸，其特征在于，所述的硝酸纤维膜上有两条测试线，所述的测试线一靠近金胶垫，测试线一的检测阈值为尿LNl浓度10-40ng/ml，测试线二的检测阈值为尿LNl浓度40-100ng/ml。
7.根据权利要求4所述的试纸，其特征在于，所述的试纸上具有至少一条质控线，其显色表示试纸有效。
8.根据权利要求4所述的试纸，其特征在于，所述的金胶垫由玻璃纤维和固定其上的金标抗体组成，所述的样品垫为吸水性玻璃纤维层。
9.根据权利要求4-8任一所述的试纸在制备诊断膀胱癌的医疗器械中的应用。
全文摘要
本发明涉及尿层粘连蛋白LN1在制备诊断膀胱癌的医疗器械中的应用。本发明还提供一种诊断膀胱癌的LN1试纸及其应用。本发明优点在于提供了尿层粘连蛋白的新用途，为膀胱癌的大规模人群筛查、膀胱癌术后病人的自我检测提供方便、可靠、无创、价廉的方法；试纸检测快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便、无需任何仪器设备，而且结果判断直观可靠、易于掌握，同时也方便病人对病情自我监测；增加了试纸的灵敏度，也提高了其特异度，既可以用于在高危人群中的筛查，又可以用于在膀胱癌术后病人的随访，应用范围比较广泛。
文档编号G01N33/574GK102621307SQ20121006325
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者周春洪, 张敏光, 沈周俊 申请人:周春洪, 张敏光, 沈周俊