专利名称：一种适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法。
背景技术：
自20世纪90年代荧光蛋白(GFP)及其衍生物(XFPs)被发现并作为一种新型标记物应用到动物学，植物学、生物学及药学等领域后，生命科学得到了突飞猛进的发展。利用现代分子遗传技术，可将XFPs与任意感兴趣的蛋白质连接起来，然后通过观察其荧光，从而能观察到被标记蛋白的空间位置，运动及相互作用。不仅如此，借助XFPs标记技术，还能特异性标记各种细胞，如神经元在脑内的三维空间分布及连接关系，对研究生物体的结构和功能关系具有重要作用。在早期的研究中，一般采用普通荧光显微镜对XFPs标记的生物样品成像，但由于受成像景深的限制只能获得薄切片样本的二维图像。后来，共聚焦和双光子显微镜技术的应用显著增加了对荧光样品的成像深度，但由于受组织散射等光学参数的限制，其最大成像深度仍小于I毫米，仍无法用于获取厘米尺寸大生物样品的三维数据。近十年来，为了能对大尺寸生物样品进行高精度三维成像，国内外发展了一系列通过机械薄切片提高样本轴向分辨率及成像范围的新型光学成像技术，如显微光学断层成像系统(MOST)，刀锋扫描成像系统(KESM)等。这些技术为了保证生物样品能进行超薄切片，基本上都是采用电镜的包埋方法，即采用树脂包埋生物样品。电镜中使用的树脂一般可以分为两类，一类是环氧类树脂，如Spurr和812等，具有疏水特性，使用前需要样品完全脱水；另一类是丙烯酸类树脂，如LR White, LR Gold及Lowicryl等，具有亲水特性，使用前容许样品含有一定量的水分。有文献报道，一些极端的理化条件，如高温，强氧化还原剂，强酸强碱及完全脱水等，均会导致XFPs的荧光强度降低甚至淬灭，所以需要样品完全脱水的环氧类树脂不适合用于制备XFPs标记的生物样品。近几年有研究者开始尝试在超低温条件下用亲水性的丙烯酸树脂来包埋XFPs标记的生物样品，如GFP或RFP标记的细胞，斑马鱼胚胎，线虫等等，所得样品可进行超薄切片并能用于获取突光图像，如文献“Fluorescence-integrated transmission electron microscopyimages !integrating fluorescence microscopy with transmission electronmicroscopy. (Sims，P. A. and J. D. hardin, Methods Mol Biol 369(2007)291-308)，，、“A Single Method for Cryofixation and Correlative Light， Electron Microscopyand Tomography of Zebrafish Embryos. (Nixon, S. J.，R. I. Webb, et al. Traffic10 (2009) 131—136)'“Correlated fluorescence and 3D electron microscopy withhigh sensitivity and spatial precision. (Kukulski，W.，M. Schorb, et al. TheJournal of Cell Biology 192 (2011) 111-119) ,Protein localization in electronmicrographs using fluorescence nanoscopy. (Watanabe, S. et al. Nature Methods8(2011)80-84)”等。然而，上述这些文献中提供的荧光样品制备方法仍存在如下局限(1)使用了快速高压冷冻仪和冷冻替代仪等昂贵设备，无法在普通实验室推广；(2)快速高压冷冻仪仅用于处理小于200微米厚度的组织，所以基于此设备的样本制备方法也只能用于处理尺寸小于200微米的生物样品；(3)使用了醋酸铀或四氧化饿等重金属类固定液，不仅具有很大毒性，而且还会降低XFPs的荧光；(4)所得生物样品仍存在一定量的荧光损失，有的甚至高达40%以上；(5)所有操作均需要在_90°C至_20°C的超低温环境下进行，且操作繁琐，只有经过专业训练的人员才能掌握。
鉴于显微光学断层成像系统(MOST)等新型三维成像方法能够对厘米级大尺寸的生物样品进行连续超薄切片和成像，而且是在切片过程中对运动的切片实时成像，所以要求样本的荧光信号比较高，而现有的荧光样品制备方法都不能同时满足制备大尺寸生物样品，且完全保持荧光的要求。因此，发展一种工艺简单、适合于超薄切片和荧光成像的大尺寸生物样品制备方法是很有必要的。
发明内容
本发明的目的是为解决上述问题而提供了一种适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法。该方法能保持生物样品的荧光信号，而且成本低廉，操作步骤简单，适合在一般实验室推广使用。本发明所采用的技术方案是一种适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，包括以下步骤(I)将生物样品用冰水预冷却的浓度为4%的多聚甲醛固定液固定6 24小时；(2)将步骤(I)得到的生物样品用冰水预冷却的漂洗液清洗3 24小时，其间更换新鲜漂洗液3次； (3)将步骤(2)得到的生物样品依次放入冰水预冷却的浓度为50%，70%和95%乙醇溶液中进行梯度脱水，每次15分钟到2小时；(4)将步骤(3)得到的生物样品依次放入冰水预冷却的浓度为70%，85%和100%的乙二醇甲基丙烯酸酯(GMA)水溶性包埋液中进行梯度渗透，每次渗透I 3小时，随后再次放入新鲜的浓度为100%的GMA水溶性包埋液中渗透6 12小时，最后在预聚的GMA水溶性包埋液中渗透I 3天；(5)将步骤(4)得到的生物样品放入充满预聚的GMA水溶性包埋液的包埋模具中隔氧包埋，然后置入58°C 60°C烘箱中聚合36 60小时。优选地，所述步骤(I)中的固定液由浓度为4%多聚甲醛粉末，2. 5%蔗糖和
0.01M0L/L PBS 配制而成。进一步地，所述步骤(I)中生物样品若是对缺氧敏感的组织，可先通过动物心脏灌流固定，再取出所需组织放入冰水预冷却的浓度为4 %的固定液进行固定。更进一步地，所述步骤(I)中若生物样品的尺寸若过大，先切成2厘米见方的组织块后再后固定。优选地，所述步骤(2)中漂洗液由浓度为0. 38%甘氨酸、2. 5%蔗糖和0. 01M0L/LPBS配制而成。优选地，所述步骤⑷浓度为100%的GMA水溶性包埋液由67克GMA单体，3克水，30克甲基丙烯酸丁酯和0. 6克过氧化苯甲酰配制而成。
进一步地，所述步骤(4)和(5)中的GMA水溶性包埋液中添加有NaOH溶液，使GMA水溶性包埋液的PH值为8 9. 5。因为GMA水溶性包埋液是低酸性的，会降低生物样品的荧光，为了提高荧光强度，所以添加NaOH溶液调节其PH值。所添加NaOH的量根据不同荧光蛋白最大荧光强度对应的PH值来确定。优选地，所述步骤⑷和(5)中的预聚的GMA水溶性包埋液配制方法为取浓度为100%的GMA水溶性包埋液放入锥形瓶中，用称量纸和橡皮筋封口后插入一根水银温度计，并接触瓶底，将锥形瓶放到加热磁力搅拌器上加热搅拌，当水银温度计指示温度至115°C 120°C时迅速将锥形瓶放入冰水浴中，并大力摇动，直至溶液温度降至冰浴的温度。
优选地，所述步骤(5)中包埋模具为具有隔氧功能的包埋模具，所述具有隔氧功能的包埋模具可以为凝胶胶囊和BEEM胶囊。进一步地，所述(5)中若没有隔氧功能的包埋模具，也可以在无氧条件下包埋生物样品，然后将包埋模具放入密闭的盒子中，最后再放入烘箱中聚合。优选地，所述生物样品可以为任何荧光蛋白标记的动物组织。本发明具有以下优点(I)该方法能包埋厘米尺寸的生物样品；(2)该方法能满足样本硬度适合连续超薄切片的要求；(3)该方法能完全保持样本的荧光信号；(4)本方法步骤简单，成本低廉，使用的仪器，试剂及温度等实验条件都是普通实验室的常规配置，一般技术人员都可以掌握。所得包埋的生物样品结合超薄切片三维成像技术，可用于获取荧光蛋白标记组织的精细三维荧光分布，继而进行相关结构和功能研究。
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。图I为本发明实施例I提供的一种适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法制备的成年Thyl-eYFP-H小鼠全脑样本的I微米切片荧光图像。图2为本发明实施例2提供的一种适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法制备的成年Thyl-eYFP-H小鼠I毫米厚度脑片的0. 5微米切片荧光图像。图3为本发明实施例3提供的一种适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法制备的幼年GFP-M转基因小鼠全脑样本的I微米切片荧光图像。
具体实施例方式实施例I成年的Thyl-eYFP-H转基因小鼠用I %戊巴比妥钠麻醉后，通过心脏左心室灌注37°C的0. 01M0L/L PBS溶液3分钟，待血液冲洗干净后，立即灌注冰水预冷却的浓度为4%多聚甲醛固定液，并持续I小时。然后，取出小鼠全脑，再次放入冰水预冷却的浓度为4%多聚甲醛固定液中后固定24小时。其中固定液的配方为4克多聚甲醛粉末，2. 5克蔗糖和100 毫升 0. 01M0L/L PBS 溶液。固定结束后，将全脑样本放入冰水预冷却的漂洗液中漂洗24小时，其间更换新液3次，以彻底清洗掉残余的多聚甲醛固定液。漂洗液的配方为0. 38克甘氨酸，2. 5克蔗糖和100 毫升 0. 01M0L/L PBS 溶液。接着，将全脑样本依次放入冰水预冷却的浓度为50%，70%和95%乙醇溶液中进行梯度脱水，每次2小时。脱水结束后，将全脑样本依次放入浓度为70%，85%，100%的GMA包埋液中进行梯度渗透，每次3小时。其中70%和85% GMA包埋液的溶剂为95%乙醇。接着再次放入新鲜的100% GMA包埋液中渗透12小时，最后放入预聚的GMA包埋液中渗透3天。所有渗透液都先用冰水浴预冷却。为了保持鼠脑YFP荧光，在所有浓度的GMA包埋液均添加NaOH 溶液调节其PH至9.5。100% GMA包埋液的配方为67克GMA单体，3克水，30克甲基丙烯酸丁酯，0.6克过氧化苯甲酰。预聚的GMA包埋液配制方法为取30毫升浓度为100% GMA包埋液放入150毫升锥形瓶中，用称量纸和橡皮筋封口后插入一根水银温度计，并接触瓶底。将锥形瓶放到加热磁力搅拌器上加热搅拌。当水银温度计指示温度至120°C时迅速将锥形瓶放入冰水浴中，并大力摇动，直至溶液温度降至冰浴的温度。将小鼠全脑放入凝胶胶囊中，加入预聚的GMA包埋液至顶部，静置约10分钟直至胶囊中的气泡完全消失，然后盖上胶囊盖子。将胶囊包埋的小鼠全脑垂直放在胶囊支架上，然后一起放入60°C烘箱中聚合60小时，得到所需的全脑包埋样本。对所得全脑样本进行连续I微米薄切片和YFP荧光成像，所得切片荧光图像参照图I。实施例2成年Thyl-eYFP-H转基因小鼠用I %戊巴比妥钠麻醉后，通过心脏左心室灌注37°C的0. 01M0L/L PBS溶液5分钟，待血液冲洗干净后，立即灌注冰水预冷却的浓度为4%多聚甲醛固定液，并持续I小时。然后，取出小鼠全脑，切成I毫米厚的脑片，再次放入冰水预冷却的浓度为4%多聚甲醛固定液中后固定6小时。其中固定液的配方为4克多聚甲醛粉末，2. 5克蔗糖和100毫升0. 01M0L/L PBS溶液。固定结束后，将脑片样本放入冰水预冷却的漂洗液中漂洗3小时，其间更换新液3次，以彻底清洗掉残余的多聚甲醛固定液。漂洗液的配方为0. 38克甘氨酸，2. 5克蔗糖和100 毫升 0. 01M0L/L PBS 溶液。接着，将脑片样本依次放入冰水预冷却的浓度为50%，70%和95%乙醇溶液中进行梯度脱水，每次15分钟。脱水结束后，将脑片样本依次放入浓度为70%，85%，100%的GMA包埋液中进行梯度渗透，每次I小时。其中浓度为70%和85% GMA包埋液的溶剂为95%乙醇。接着再次放入新鲜的浓度为100% GMA包埋液中渗透6小时，最后放入预聚的GMA包埋液中渗透I天。所有渗透液都先用冰水浴预冷却。为了保持鼠脑YFP荧光，在所有浓度的GMA包埋液均添加NaOH溶液调节其PH至9. 5。浓度为100% GMA包埋液的配方为67克GMA单体，3克水，30克甲基丙烯酸丁酯，0. 6克过氧化苯甲酰。预聚的GMA包埋液配制方法为取30毫升浓度为100% GMA包埋液放入150毫升锥形瓶中，用称量纸和橡皮筋封口后插入一根水银温度计，并接触瓶底。将锥形瓶放到加热磁力搅拌器上加热搅拌。当水银温度计指示温度至115°C时迅速将锥形瓶放入冰水浴中，并大力摇动，直至溶液温度降至冰浴的温度。
将脑片放入凝胶胶囊中，加入预聚的GMA包埋液至顶部，静置约10分钟直至胶囊中的气泡完全消失，然后盖上胶囊盖子。将胶囊包埋的脑片垂直放在胶囊支架上，然后一起放入58°C烘箱中聚合36小时，得到所需的脑片包埋样本。所得脑片样本进行连续0. 5微米薄切片和荧光成像，所得荧光图像参照图2。实施例3 出生后20天的GFP-M转基因小鼠用I %戊巴比妥钠麻醉后，通过心脏左心室灌注37°C的0. 01M0L/L PBS溶液5分钟，待血液冲洗干净后，立即灌注冰水预冷却的浓度为4%多聚甲醛固定液，并持续I小时。然后，取出小鼠全脑，再次放入冰水预冷却的浓度为4%多聚甲醛固定液中后固定24小时。其中固定液的配方为4克多聚甲醛粉末，2. 5克蔗糖和100 毫升 0. 01M0L/L PBS 溶液。固定结束后，将全脑样本放入冰水预冷却的漂洗液中漂洗12小时，其间更换新液3次，以彻底清洗掉残余的多聚甲醛固定液。漂洗液的配方为0. 38克甘氨酸，2. 5克蔗糖和100 毫升 0. 01M0L/L PBS 溶液。接着，将全脑样本依次放入冰水预冷却的浓度为50%，70%和95%乙醇溶液中进行梯度脱水，每次I小时。脱水结束后，将全脑样本依次放入浓度为70%，85%，100%的GMA包埋液中进行梯度渗透，每次I. 5小时。其中浓度为70%和85% GMA包埋液的溶剂为浓度为95%的乙醇。接着再次放入新鲜的100% GMA包埋液中渗透12小时，最后放入预聚的GMA包埋液中渗透2天。所有渗透液都先用冰水浴预冷却。为了保持鼠脑YFP荧光，在所有浓度的GMA包埋液均添加NaOH溶液调节其PH至8。100% GMA包埋液的配方为67克GMA单体，3克水，30克甲基丙烯酸丁酯，0. 6克过氧化苯甲酰。预聚的GMA包埋液配制方法为取30毫升浓度为100% GMA包埋液放入150毫升锥形瓶中，用称量纸和橡皮筋封口后插入一根水银温度计，并接触瓶底。将锥形瓶放到加热磁力搅拌器上加热搅拌。当水银温度计指示温度至117°C时迅速将锥形瓶放入冰水浴中，并大力摇动，直至溶液温度降至冰浴的温度。将小鼠全脑放入凝胶胶囊中，加入预聚的GMA包埋液至顶部，静置约10分钟直至胶囊中的气泡完全消失，然后盖上胶囊盖子。将胶囊包埋的小鼠全脑垂直放在胶囊支架上，然后一起放入59°C烘箱中聚合48小时，得到所需的全脑包埋样本。所得全脑样本进行连续I微米薄切片和荧光成像，所得荧光图像参照图3。最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)将生物样品用冰水预冷却的浓度为4%的多聚甲醛固定液固定6 24小时； (2)将步骤(I)得到的生物样品用冰水预冷却的漂洗液清洗3 24小时，其间更换新鲜漂洗液3次； (3)将步骤(2)得到的生物样品依次放入冰水预冷却的浓度为50%，70%和95%乙醇溶液中进行梯度脱水，每次15分钟到2小时； (4)将步骤(3)得到的生物样品依次放入冰水预冷却的浓度为70%，85%和100%的乙二醇甲基丙烯酸酯(GMA)水溶性包埋液中进行梯度渗透，每次渗透I 3小时，随后再次放入新鲜的浓度为100%的GMA水溶性包埋液中渗透6 12小时，最后在预聚的GMA水溶性包埋液中渗透I 3天； (5)将步骤(4)得到的生物样品放入充满预聚的GMA水溶性包埋液的包埋模具中隔氧包埋，然后置入58°C 60°C烘箱中聚合36 60小时。
2.根据权利要求I所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中的固定液由浓度为4%多聚甲醛粉末，2. 5%蔗糖和0.01 MOL/L PBS配制而成。
3.根据权利要求I所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中若生物样品的尺寸若过大，先切成2厘米见方的组织块后再后固定。
4.根据权利要求I所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中漂洗液由浓度为0. 38%甘氨酸、2.5%蔗糖和0.0謹0171 PBS配制而成。
5.根据权利要求I所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述步骤⑷浓度为100%的GMA水溶性包埋液由67克GMA单体，3克水，30克甲基丙烯酸丁酯和0. 6克过氧化苯甲酰配制而成。
6.根据权利要求I所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述步骤(4)和(5)中的GMA水溶性包埋液中添加有NaOH溶液，使GMA水溶性包埋液的PH值为8 9. 5。
7.根据权利要求I所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述步骤(4)和(5)中的预聚的GMA水溶性包埋液配制方法为取浓度为100%的GMA水溶性包埋液放入锥形瓶中，用称量纸和橡皮筋封口后插入一根水银温度计，并接触瓶底，将锥形瓶放到加热磁力搅拌器上加热搅拌，当水银温度计指示温度至115°C 120°C时迅速将锥形瓶放入冰水浴中，并大力摇动，直至溶液温度降至冰浴的温度。
8.根据权利要求I所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中包埋模具为具有隔氧功能的包埋模具，所述具有隔氧功能的包埋模具可以为凝胶胶囊和BEEM胶囊。
9.根据权利要求I所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述(5)中若没有隔氧功能的包埋模具，在无氧条件下包埋生物样品，然后将包埋模具放入密闭的盒子中，最后再放入烘箱中聚合。
10.根据权利要求I至9任一项所述的适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，其特征在于，所述生物样品可以为荧光蛋白标记的动物组织。
全文摘要
本发明涉及一种适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法，属于生物工程技术领域。本发明采用4％多聚甲醛对荧光蛋白标记的生物组织进行固定，样品经0.01mol/L PBS溶液漂洗后，用乙醇溶液进行递度脱水，但脱水浓度不超过95％。之后，样品用改良后的乙二醇甲基丙烯酸酯(GMA)进行渗透及包埋。该方法所得包埋的生物样品具备进行连续超薄切片的硬度且能同时保持荧光信号。本发明方法成本低廉，操作步骤简单，适合在一般实验室推广使用。
文档编号G01N1/36GK102620966SQ20121009266
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者李安安, 杨中琴, 骆清铭, 龚辉 申请人:华中科技大学