专利名称：一种用于诊断肝纤维化和早期肝硬化的血液标志物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于诊断肝纤维化和早期肝硬化的血液标志物半乳糖凝集素3，属于生物医学领域。
背景技术：
肝纤维化是包括病毒性肝炎，酒精性肝炎，脂肪肝，药物性肝损伤等不同原因的肝组织损伤向肝硬化转变的共同病理过程。肝硬化是不可逆转的肝组织病变，但在肝纤维化尚未发展成为肝硬化的过程中，及时的进行药物干预，可实现纤维化过程的抑制和肝组织是正常修复，避免肝硬化的发生。然而，目前对肝纤维化的诊断，依然需要依靠肝组织穿刺活检，该过程是创伤性的，有可能引起致命性的并发症。同时，早期肝纤维化并无明显的生 理不适应，对病人进行周期性的肝组织穿刺活检以判断纤维化的发生是不现实的，因此临床上急需新型的，以血液为检测样本的方式，以方便对肝纤维化发生的早期诊断。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于诊断肝纤维化和早期肝硬化的血液标志物半乳糖凝集素3。本发明中所述的半乳糖凝集素3，英文名galectin-3，血液中半乳糖凝集素3的检测可以通过成熟的酶连免疫技术进行检测。本发明的前期研究发现，肝纤维化发生过程中起关键作用的异常活化的肝星形细胞，大量表达半乳糖凝集素3，其表达量与肝星形细胞的活化程度相关。同时，我们还注意到，在肝纤维化小鼠动物模型的血清中，半乳糖凝集素的
含量显著升高。为检测血清样本中的半乳糖凝集素3，本发明提供了ー种通过酶联免疫法检测血液样本中半乳糖凝集素3的实验方法。上述的酶联免疫法的实验方法如下将抗半乳糖凝集素3的抗体包被于酶标板，样本加入酶标板，孵育一定时间后，充分洗板，加入亲和素标记的半乳糖凝集素3的抗体，孵育一定时间后，充分洗板，然后加入生物素标记的辣根过氧化物酶，孵育一定时间后，充分洗板，最后加入辣根过氧化物酶的反应底物，反应一定时间后加入盐酸溶液終止反应，通过酶标仪检测反应后酶标板孔中的光吸收，并与标准品相比较，确定样本中半乳糖凝集素的含量。本发明通过酶联免疫反应分析血液中的半乳糖凝集素3的浓度进行肝纤维化和早期肝硬化的检测分析评估。血液样本的收集处理方法包括但不局限于下述步骤通过负压抗凝管收集血液样本,通过500g离心5分钟，去除血细胞，获得血浆，即为待测样本。本发明通过对小鼠实验动物模型的研究进行例证。此处的动物包括但是不限于小鼠，大鼠，驯养动物例如但是不限于猫，狗，以及其他一些动物例如但是不限于牛，羊，猪，马和灵长类动物例如但是不限于猴子和人。小鼠肝纤维化实验模型的体内检测是被广泛认可和接受的给其他生物例如但是不限于人作为參考的体内药物活性检测的模型。
具体实施例方式实施例I
小鼠四氯化碳肝纤维化小鼠模型的制备
取四周龄ICR小鼠，腹腔注射溶于棕榈油的四氯化碳，剂量为lmg/kg体重，每周两次，连续四周，可获得显著肝组织纤维化的动物模型。对照组动物注射相同体积，相同次数，相同时间的棕榈油。模型制备完毕后，通过眼球取血的方式，在造模的第一周，第二周，第三周，第四周获取血液样本，并进ー步通过离心获得血浆样本，待用。实施例2
通过酶联免疫反应检测实验模型血浆样本中的半乳糖凝集素3
I.包被用O. 05M PH9. O碳酸盐包被缓冲液将抗体(购自美国Abcam公司)稀释至蛋白质含量为I IOyg / ml ο在姆个聚苯こ烯板的反应孔中加O. lml, 4°C过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，毎次3分钟。(简称洗涤，下同)。2.加样加一定稀释的待检样品O. Iml于上述已包被之反应孔中，置37°C孵育I小吋。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。3.加亲和素标记抗体于各反应孔中，加入新鮮稀释的亲和素标记的抗体(购自美国abeam公司)(经滴定后的稀释度)O. lml。37°C孵育O. 5 I小时，洗涤。4.加生物素标记的辣根过氧化物酶于各个反应孔中，加入新鲜稀释的生物素标记的辣根过氧化物酶(购自美国sigma公司)O. Iml0 37°C孵育O. 5小时，洗涤。5.加底物液显色于各反应孔中加入临时配制的TMB底物(购自美国sigma公司)溶液O. Iml, 370C 10 30分钟。6.终止反应于各反应孔中加入2M盐酸O. 05ml。7.结果判定可于白色背景上，直接用肉眼观察结果反应孔内顔色越深，阳性程度越強，阴性反应为无色或极浅，依据所呈顔色的深浅，以“ + 号表示。也可测O · D值在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O · D值，若大于规定的阴性对照OD值的2. I倍，即为阳性。8.通过在反应孔中加入梯度稀释的半乳糖凝集素3 (购自美国sigma公司)来制作标准曲线，根据标准曲线，计算各个样本中的半乳糖凝集素3的量。检测结果如下表所示
I对照组半乳糖凝集素3浓度(pg/ml)I模型组半乳糖凝集素3浓度(pg/ml)
第 O 周 O. 26±0. 03O. 23±0. 04:
第 I周 0·23±0·050·58±0·07:
第 2 周 0·28±0·083·67±0·33:
第 3 周 0·19±0·0216·71±2·03:
第 4 周を.24±0. 01[37.91±6. 03
结果分析实验组和对照组每个时间点，包含10只小鼠，通过t检验，两组之间的P值为O. 0021，具有显著性差异。通过酶联免疫反应可以方便的检测血清中的半乳糖凝集素3，发生肝纤维化的动物血液中的半乳糖凝集素3的含量明显高 于正常动物。
权利要求
1.一种用于诊断肝纤维化和早期肝硬化的血液标志物，所述血液标志物为半乳糖凝集素3。
2.应用权利要求I所述的血液标志物通过酶联免疫反应分析血液中的半乳糖凝集素3的浓度进行肝纤维化和早期肝硬化的分析评估。
全文摘要
本发明公开了一种用于诊断肝纤维化和早期肝硬化的血液标志物，所述血液标志物为半乳糖凝集素3，应用该血液标志物通过酶联免疫反应分析血液中的半乳糖凝集素3的浓度进行肝纤维化和早期肝硬化的分析评估。本发明以血液为检测样本的方式，能够实现方便快速对肝纤维化和早期肝硬化发生的早期诊断。
文档编号G01N33/68GK102645540SQ20121009472
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者董磊 申请人:安徽四正医药科技有限公司