专利名称：基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接elisa检测方法
技术领域：
本发明涉及生物制品制备技术及应用领域，尤其是涉及一种基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法。
背景技术：
甲鱼，学名中华鳖，历来是药膳及滋补佳品。20世纪80年代，温室养殖的兴起，使原本奉为稀珍的甲鱼的广量大幅提闻，随之而起的是疾病的肆意流行。2007年以来，在浙江地区，尤以杭州、宁波地区甲鱼生态养殖场暴发一种系统性败血症，主要症状为系统性出血性败血，研究人员经流行病学调查、组织切片与超薄切片观察和人工感染试验等研究，确定一种新型球状病毒是其原发性致病因子，该新型球状病毒为甲鱼系统性败血症球状病毒(Turtle systemic sepsis spherical virus TSSSV),该病毒具有较强的传染性和高达 90-100%的致死性，而且这种疾病潜伏期较长，初期表现出来的病症如白底板等容易和以往发现的一些细菌性疾病的病症相似，容易造成误诊，贻误治疗时机，因此建立一种便捷、灵敏的病毒检测方法颇为重要。目前，甲鱼系统性败血症球状病毒的实验室诊断方法主要为RT-PCR方法，但该方法需要进行核酸的提取等步骤，样品制备繁琐，在检测大批量样品时容易发生交叉污染。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有操作简单、敏感性、高快速、易标准化等优点，适合于大规模的样品检测。鸡卵黄免疫球蛋白G抗体又称为IgY (Yolk Immunoglobulin)是存在于免疫后母鸡卵黄中的一种7S免疫球蛋白，它具有产率高、稳定性好、特异性强等优点，是一种易于生产、廉价的抗体，免疫I只鸡所收集到的仅I个鸡蛋中含有的特异性IgY的量(约200mg)远远高于免疫I只兔所收集到的全部血清中的抗体量，IgY具有较强的耐酸、耐碱、耐热能力。但是，目前国内外还没有关于基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定性、特异性和灵敏度高、免疫干扰小、背景低的基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，包括以下步骤
(I)抗原预包被
将甲鱼系统性败血症球状病毒抗原用.01 M的pH为9. 6的碳酸盐缓冲液稀释至O. Ing/ul,按IOOul/孔加于聚苯乙烯96孔反应板中，4 °0放置过夜,次日倾去孔内液体,将孔用PBS-T洗涤液洗涤3次后，每孔加入I %牛血清白蛋白(BSA)封闭液，37 °C低速振荡温育I h进行封闭,封闭结束后,吸走孔内牛血清白蛋白封闭液；(2)检测反应
将孔用PBS-T洗涤液清洗后，加入倍比稀释的甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体IOOul，每梯度设I平行，同时设立空白对照和阴性对照，加盖37 °C温育I h后，用PBS-T洗涤液洗3次，再在每孔中加入IOOul的预先用1%牛血清白蛋白封闭液按I :10000比例稀释的辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鸡IgG，37 °C温育I h后，PBS-T洗涤液清洗5次，蒸馏水洗3次后，每孔加入新配置好的邻苯二胺底物溶液IOOul，37 1暗处显色15 min,每孔加50ul的2M H2SO4终止反应；
(3)结果判定
在酶标仪上读取各孔492 nm波长处的吸光度值，测定孔吸光度值大于阴性对照孔均值 2. I倍以上者判为阳性。步骤(I)中所述的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原的制备过程如下选取患病甲鱼，取甲鱼内脏置于预先冰浴过的TNE缓冲液中，匀浆直至完全碎裂，将匀浆液在4°C，6000g条件下离心IOmin后，取上清液在4°C，8000g条件下离心20min，取再次离心所得上清液于4°C，35000g离心I. 5h后获取一次沉淀物，将一次沉淀物的沉淀上层疏松部分用TM缓冲液小心冲洗掉，沉淀下层白色部分重悬于Iml的TM缓冲液中，4°C冰浴过夜；次日将过夜处理的沉淀重新悬浮起来，4°C下3500g条件下离心5min后,取上清液于4°C, 38000g条件下离心I. 5h获取二次沉淀物，将二次沉淀物的沉淀上层疏松部分小心去掉后，下层白色沉淀用少量TM缓冲液重悬后制成病毒悬浮液，即为甲鱼系统性败血症球状病毒抗原。步骤(2)中所述的甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体的制备过程如下 a.蛋鸡免疫并收集免疫鸡蛋
将蛋鸡进行I次基础免疫和2 3次加强免疫，所述的基础免疫为在所述的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，所述的加强免疫为在所述的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，注射用量为每千克母鸡注射500mg甲鱼系统性败血症球状病毒抗原，每次免疫间隔时间为15天，完成免疫后10天，开始收集鸡蛋，于4°C冰箱保存；
b.特异卵黄抗体的提取将上述得到的免疫鸡蛋用酒精擦拭蛋壳并分离卵黄，吸取卵黄液，然后在卵黄液中加入卵黄液10倍体积的O. 05 M的pH为5. O的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀后于4 °C冰箱静置过夜处理，将过夜处理后的混合液于4 0C，IOOOOg的条件下离心20 min后取上清液，在上清液中加入饱和的(NH4)2SO4使其终浓度为40%，4 °C静置10h，再IOOOOg离心20 min后取沉淀，将沉淀用140g/L的Na2SO4稀释至100 ml，再次于4°C静置10 h后，10000 g离心20 min，沉淀用O. OlM的pH为7. 2的PBS重悬，最后用截留量为100KD的透析袋透析除盐得到甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体。所述的TNE缓冲液的pH为 . 5，配制终浓度如下50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl,5mM乙二胺四乙酸分(EDTA)，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)。所述的TM缓冲液的pH为 . 5，配制终浓度如下50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2，ImM PMSF。 所述的PBS-T洗涤液为吐温-20与PBS缓冲液按体积比1:2000的比例混合得到，所述的PBS缓冲液浓度为O. I M，pH为7. 4。所述的甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体的稀释倍比为I :640，1 =1280,1 2560，I5120,I:10240。所述的邻苯二胺底物溶液的配制浓度为每100 ml邻苯二胺底物溶液含柠檬酸
O.73 g，Na2HPO4 · 2H20 I. 186 g，邻苯二胺 O. 04 g，30% H2O2 150 ul。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明首次公开了基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，本发明以纯化的TSSSV为抗原免疫蛋鸡获得了特异性的抗TSSSV-IgY，制备的特异性抗TSSSV-IgY可用于TSSSV间接ELISA检测，与兔源、鼠源的抗体相比，IgY具有物理性质稳定，制备简单，产量高，成本低，可明显降低假阳性出现率等优点，利用TSSSV-IgY进行ELISA检测诊断具有稳定性、特异性和灵敏度高、免疫干扰小、背景低等优点，同时TSSSV-IgY制备简单，不需要取血等操作对动物造成伤害，母鸡在经20-30mg高度保守的抗原进行免疫后可引起高效价的IgY长时间的分泌，这为用IgY 进行ELISA检测方法进行市场化和商业化提供了基础。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例I
甲鱼系统性败血症球状病毒抗原的制备
选取患病甲鱼，取甲鱼内脏置于预先冰浴过的TNE缓冲液中，匀浆直至完全碎裂，将匀浆液在4°C，6000g条件下离心IOmin后，取上清液在4°C，8000g条件下离心20min，取再次离心所得上清液于4°C，35000g离心I. 5h后获取一次沉淀物，将一次沉淀物的沉淀上层疏松部分用TM缓冲液小心冲洗掉，沉淀下层白色部分重悬于Iml的TM缓冲液中，4°C冰浴过夜；次日将过夜处理的沉淀重新悬浮起来，4°C下3500g条件下离心5min后，取上清液于4°C，38000g条件下离心I. 5h获取二次沉淀物，将二次沉淀物的沉淀上层疏松部分小心去掉后，下层白色沉淀用少量TM缓冲液重悬后制成病毒悬浮液，即为甲鱼系统性败血症球状病毒抗原。其中TNE缓冲液的pH为7. 5，配制终浓度如下50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 5mMEDTA, ImM PMSF ;TM 缓冲液的 pH 为 7. 5，配制终浓度如下50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2，ImM PMSF。上述甲鱼系统性败血症球状病毒(Soft-shelledturtle systemic septicemiaspherical virus，STSSSV)，毒株为 P1015 株，保藏号为 CGMCC No. 5378，于 2011 年 10 月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。实施例2
抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体的制备
a.蛋鸡免疫并收集免疫鸡蛋
将蛋鸡进行I次基础免疫和2 3次加强免疫，所述的基础免疫为在所述的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，所述的加强免疫为在所述的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，注射用量为每千克母鸡注射500mg甲鱼系统性败血症球状病毒抗原，每次免疫间隔时间为15天，完成免疫后10天，开始收集鸡蛋，于4°C冰箱保存；
b.特异卵黄抗体的提取将上述得到的免疫鸡蛋用酒精擦拭蛋壳并分离卵黄，吸取卵黄液，然后在卵黄液中加入卵黄液10倍体积的O. 05 M的pH为5. O的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀后于4 °C冰箱静置过夜处理，将过夜处理后的混合液于4 0C，IOOOOg的条件下离心20 min后取上清液，在上清液中加入饱和的(NH4)2SO4使其终浓度为40%，4 °C静置10h，再IOOOOg离心20 min后取沉淀，将沉淀用140g/L的Na2SO4稀释至100 ml，再次于4°C静置10 h后，10000 g离心20 min，沉淀用O. OlM的pH为7. 2的PBS重悬，最后用截留量为100KD的透析 袋透析除盐得到甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体。实施例3
特异性抗TSSSV-IgY用于TSSSV间接ELISA检测，具体步骤如下
1、抗原预包被
将甲鱼系统性败血症球状病毒抗原(具体制备过程如上述实施例I所述)用.01 M的pH为9. 6的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至O. I ng/ul，按IOOul/孔加于聚苯乙烯96孔反应板中，4°C放置过夜，次日倾去孔内液体，将孔用PBS-T洗涤液洗涤3次后，每孔加入1%牛血清白蛋白封闭液，37 °C低速振荡温育I h进行封闭，封闭结束后，吸走孔内牛血清白蛋白封闭液；其中PBS-T洗涤液为吐温-20与PBS缓冲液按体积比1:2000的比例混合得到，所述的PBS缓冲液浓度为O. I M，pH为7. 4 ;
2、检测反应
将孔用PBS-T洗涤液清洗后，每孔加入预先用PBS按I 640,1 :1280，I =2560,1 :5120，I 10240倍比稀释的甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体(TSSSV-IgY具体制备过程如上述实施例2所述)100ul，每梯度设I平行，另设未经任何病原免疫的鸡蛋的蛋白透析液为阴性对照，PBS为空白对照，，加盖37 °C温育I h后，用PBS-T洗涤液洗3次，再在每孔中加入IOOul的预先用1%牛血清白蛋白封闭液按I :10000比例稀释的辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鸡IgG，37 °C温育I h后，PBS-T洗涤液清洗5次，蒸馏水洗3次后，每孔加入新配置好的邻苯二胺底物溶液100ul，37 1暗处显色15 min，每孔加50ul的2M H2SO4终止反应；
其中邻苯二胺底物溶液的配制浓度为每100 ml邻苯二胺底物溶液含柠檬酸O. 73 g，Na2HPO4 · 2H20 I. 186 g，邻苯二胺 O. 04 g, 30% H2O2 150 ul ；
3、结果判定
在酶标仪上读取各孔492 nm波长处的吸光度(A)值，测定孔吸光度值大于阴性对照孔均值2. I倍以上者判为阳性，阳性反应的最大稀释度即为待测样品的效价。效价检测结果见表1，说明了本发明涉及的抗TSSSV-IgY效价很高，为I :10240，可以用于间接ELISA检测。表I
权利要求
1.一种基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，其特征在于包括以下步骤 (1)抗原预包被 将甲鱼系统性败血症球状病毒抗原用.01 M的pH为9. 6的碳酸盐缓冲液稀释至O. Ing/ul，按IOOul/孔加于聚苯乙烯96孔反应板中，4°C放置过夜，次日倾去孔内液体，将孔用PBS-T洗涤液洗涤3次后，每孔加入I %牛血清白蛋白封闭液，37 °C低速振荡温育I h进行封闭，封闭结束后,吸走孔内牛血清白蛋白封闭液； (2)检测反应 将孔用PBS-T洗涤液清洗后，加入倍比稀释的甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体IOOul，每梯度设I平行，同时设立空白对照和阴性对照，加盖37 °C温育I h后，用PBS-T洗涤液洗3次，再在每孔中加入IOOul的预先用1%牛血清白蛋白封闭液按I :10000比例稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鸡IgG，37 °C温育I h后，PBS-T洗涤液清洗5次，蒸馏水洗3次后，每孔加入新配置好的邻苯二胺底物溶液IOOul，37 1暗处显色15 min，每孔加50ul的2M H2SO4终止反应； (3)结果判定 在酶标仪上读取各孔492 nm波长处的吸光度值，测定孔吸光度值大于阴性对照孔均值2. I倍以上者判为阳性。
2.根据权利要求I所述的基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，其特征在于步骤(I)中所述的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原的制备过程如下选取患病甲鱼，取甲鱼内脏置于预先冰浴过的TNE缓冲液中，匀浆直至完全碎裂，将匀浆液在40C，6000g条件下离心IOmin后，取上清液在4°C，8000g条件下离心20min，取再次离心所得上清液于4°C，35000g离心I. 5h后获取一次沉淀物，将一次沉淀物的沉淀上层疏松部分用TM缓冲液小心冲洗掉，沉淀下层白色部分重悬于Iml的TM缓冲液中，4°C冰浴过夜；次日将过夜处理的沉淀重新悬浮起来，4°C下3500g条件下离心5min后,取上清液于4°C, 38000g条件下离心I. 5h获取二次沉淀物，将二次沉淀物的沉淀上层疏松部分小心去掉后，下层白色沉淀用少量TM缓冲液重悬后制成病毒悬浮液，即为甲鱼系统性败血症球状病毒抗原。
3.根据权利要求2所述的基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体的制备过程如下 a.蛋鸡免疫并收集免疫鸡蛋 将蛋鸡进行I次基础免疫和2 3次加强免疫，所述的基础免疫为在所述的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，所述的加强免疫为在所述的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，注射用量为每千克母鸡注射500mg甲鱼系统性败血症球状病毒抗原，每次免疫间隔时间为15天，完成免疫后10天，开始收集鸡蛋，于4°C冰箱保存； b.特异卵黄抗体的提取 将上述得到的免疫鸡蛋用酒精擦拭蛋壳并分离卵黄，吸取卵黄液，然后在卵黄液中加入卵黄液10倍体积的O. 05 M的pH为5. O的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀后于4 °C冰箱静置过夜处理，将过夜处理后的混合液于4 V，IOOOOg的条件下离心20 min后取上清液，在上清液中加入饱和的(NH4)2SO4使其终浓度为40%，4 °C静置10h，再IOOOOg离心20 min后取沉淀，将沉淀用140g/L的Na2SO4稀释至100 ml，再次于4°C静置10 h后，10000 g离心20 min，沉淀用O. OlM的pH为7. 2的PBS重悬，最后用截留量为100KD的透析袋透析除盐得到甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体。
4.根据权利要求3所述的基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，其特征在于所述的TNE缓冲液的pH为7. 5，配制终浓度如下50 mM Tris-HCl, 200mM NaCl, 5mM乙二胺四乙酸分，ImM苯甲基磺酰氟。
5.根据权利要求3所述的基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，其特征在于所述的TM缓冲液的pH为7. 5，配制终浓度如下50 mM Tris-HCl，10 mMMgCl2 , ImM苯甲基磺酰氟。
6.根据权利要求I所述的基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，其特征在于所述的PBS-T洗涤液为吐温-20与PBS缓冲液按体积比1:2000的比例混合得到，所述的PBS缓冲液浓度为O. I M，pH为7. 4。
7.根据权利要求I或3所述的甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于所述的甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体的稀释倍比为I :640，1 :1280，I 2560,1 :5120，I :10240。
8.根据权利要求I所述的基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，其特征在于所述的邻苯二胺底物溶液的配制浓度为每100 ml邻苯二胺底物溶液含柠檬酸 O. 73 g，Na2HPO4 · 2H20 I. 186 g，邻苯二胺 O. 04 g, 30% H2O2 150 ul。
9.根据权利要求I所述的基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，其特征在于所述的阴性对照为未经任何病原免疫的鸡蛋的蛋白透析液，所述的空白对照为PBS缓冲液。
全文摘要
本发明公开了基于卵黄抗体的甲鱼系统性败血症球状病毒间接ELISA检测方法，特点是包括将0.1ng/ul的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原按100ul/孔加于聚苯乙烯96孔反应板中进行预包被，并采用牛血清白蛋白封闭液进行封闭的步骤；将每孔加入倍比稀释的甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体，并加入辣根过氧化酶标记的羊抗鸡IgG和邻苯二胺底物溶液显色反应的步骤；最后在酶标仪上读取各孔492nm波长处的吸光度值，测定孔吸光度值大于阴性对照孔均值2.1倍以上者判为阳性，优点是具有稳定性、特异性和灵敏度高、免疫干扰小、背景低等效果。
文档编号G01N33/569GK102901816SQ201210107100
公开日2013年1月30日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者李登峰, 彭娇, 周永强, 刘联国, 陈炯, 顾晓英 申请人:宁波大学