专利名称：Lc-ms非靶向性烟草代谢组学样品提取方法
技术领域：
本发明涉 及烟草代谢组学样品提取方法，本发明以LC-MS为分析平台，对影响烟草提前效果的四个因素在三个水平上进行正交设计，分别采用了 ESI (+，_)离子模式，分析出最佳的适合烟草叶片的最佳提取方法。
背景技术：
代谢物作为生物体中的终产物，在很多时候其差异比生物体相应的转录和蛋白质水平显示的差异要大，是代谢组学分析较之其他“组学”的优势之一(漆小泉，王玉兰，陈晓亚，2011，植物代谢组学-方法与应用，P58-60，化学工业出版社)。同时也正是因为生物代谢途径对外界环境扰动的敏感，造成不同生物个体之间的代谢物组成及含量差异很大。已经有研究表明，即便是在严格控制的生长条件下，分析样品之间代谢组的生物差异也要高于其他系统差异好几倍(Roessner et al.，2000)。所以在样品取材、提取方法及分析方法尽量保持一致，以尽量避免引入系统误差。代谢组学研究中最容易引入系统误差的是样品制备过程，标准的植物代谢物样品制备分为组织取样、匀浆、抽提、保存和样品预处理等步骤(Fukusaki and Kobayashi, 2005)。代谢产物通常用水和有机溶剂(如甲醇和乙腈等)分别提取，获得水提取物和有机溶剂提取物，从而把非极性的亲脂相和极性相分开。然而植物代谢物千差万别，其中很多物质稍受干扰，结构就会发生改变，且对其分析鉴定所采用的设备也不同。目前还没有通用所有代谢物的抽提方法，只能根据所要分析的代谢物特性及使用的鉴定手段选择合适的提取方法，同时抽提时间、温度、溶剂成分和质量及实验者的技巧等诸多因素也将影响样品制备的水平。烟草代谢组学研究国内外报道较少，对于其代谢组学样品的提取方法没有统一标准，因此建立高效、快速、重现性好得烟草代谢组学样品提取方法对促进烟草代谢组学研究，加强相关研究者之间进行数据交流具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于建立一种基于LC-MS烟草代谢组学样品提取方法，实现烟草代谢组学样品的快速、高效、快速提取。该技术具有分析方法简单，检测效率高、重现性好得特点。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
本发明的LC-MS非靶向性烟草代谢组学样品提取方法包括以下工艺步骤
1)植物匀质化方法烟草样品液氮冷冻，球磨仪打碎；
2)研磨好样品加入75%酸化(O.1%蚁酸)甲醇，25°C下超声提取20 min ；3)提取完样品室温下(20°0高速(20 OOOg)离心10 min，上清用20 μ m微孔滤膜过滤。在本发明中，所述烟草样品为新鲜组织样品(非调制烟叶或花、根、茎等新鲜组织器官)。液氮冷冻的温度为-196°C，样品需完全浸没在液氮中。本发明具有以下优点
I.提供了一种最适合烟草叶片的最佳提取方法，对促进烟草代谢组学研究、建立统一的提取方法标准、加强相关研究者之间进行数据交流具有重要意义。 2.操作简单、快捷，试剂相对便宜，毒性较小。3.获得代谢物峰数据较大，切对样品重现性较好。
图I为本发明工艺流程图。图2为9种提取方法的实验样本TIC轮廓谱比较。图3为采用本发明方法对烟草白花突变体花瓣进行6次重复的进样分析结果总粒子流色谱图(Total particles chromatogram, TIC)
具体实施例方式本发明以下结合实施例做进一步描述 实施案例
O不同提取方法提取效果比较
表1-1影响代谢物提取效果的因素及各种水平
I提取溶剂I提取方式I提取时间I提取温度
水平I甲醇(O. IFA)_超声 IOmin4°C_
采平甲醇氯仿水5:2:2 —震动 _20min25°C
采平3|乙腈(0. 1FA)I静置 |40min丨50°〇
根据上面的四因素三水平设计正交设计表格
表1-2烟草代谢物提取优化实验正交设计表L9 (34)
_号I提取溶剂I提取方式I提取时间I提取温度
1_溶剂 A (Al)_超声(BI)10 (Cl)_4 (Dl)_
2溶剂 A (Al) 一震摇(B2)20~(C2)25 (D2)
3溶剂 A (Al)-静置(B3)40 (C3)50 (D3)
4B (A2)超声(BI)20 (C2) 一 50 (D3)—
5溶剂 B(A2) _震摇(B2)40 (C3)4 (Dl)
6溶剂 B(A2)-静置(B3)10 (Cl)25 (D2)
7C (A3)超声(BI)40 (C3) 一25 (D2)—
8溶剂 C (A3) 一震摇(B2)~(Cl)50 (D3)
9I溶剂 C (A3)I静置(B3)丨20 (C2)K (Dl)
注=A 甲醇(O. 1% FA)，B:甲醇:氯仿:水 5:2:2，C:乙腈(0. 1% FA)
提取溶剂用量A，B，C按照V/W=3:1比例(单位ml/g)，如0. 5g鲜重，加I. 5mL提取溶剂。萃取分相提取后加入0. 4mL ddH20,使得上层水相体积约I. 5mL。
色谱质谱分析条件进样量5ul，柱温30度。流动相组成A水(O. 1%FA), B乙腈(O. IFA), UPLC梯度洗脱程序如下
表1-3烟草代谢物提取优化实验色谱梯度洗脱参数
权利要求
1.一种LC-MS非靶向性烟草代谢组学样品提取方法，其特征在于包括以下工艺步骤 1)植物匀质化方法烟草样品液氮冷冻，球磨仪打碎； 2)研磨好样品加入75%酸化(0.1%蚁酸)甲醇，25°C下超声提取20 min ； 3)提取完样品室温下(20°C)高速离心10 min,上清用20 y m微孔滤膜过滤。
2.根据权利要求I所述的LC-MS非靶向性烟草代谢组学样品提取方法，其特征在于所述烟草样品为新鲜组织样品。
3.根据权利要求I所述的LC-MS非靶向性烟草代谢组学样品提取方法，其特征在于液氮冷冻的温度为_196°C。
4.根据权利要求I所述的LC-MS非靶向性烟草代谢组学样品提取方法，其特征在于高速离心时离心力20000g。
全文摘要
一种LC-MS非靶向性烟草代谢组学样品提取方法，其特征在于包括以下工艺步骤1)植物匀质化方法烟草样品液氮冷冻，球磨仪打碎；2)研磨好样品加入75%酸化(0.1%蚁酸)甲醇，25℃下超声提取20min；3)提取完样品室温下(20℃)高速(20000g)离心10min，上清用20μm微孔滤膜过滤。本发明具有以下优点1、提供了一种最适合烟草叶片的最佳提取方法，对促进烟草代谢组学研究、建立统一的提取方法标准、加强相关研究者之间进行数据交流具有重要意义。2、操作简单、快捷，试剂相对便宜，毒性较小。3、获得代谢物峰数据较大，且对样品重现性较好。
文档编号G01N30/06GK102636594SQ20121010843
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月14日 优先权日2012年4月14日
发明者周会娜, 曹培健, 李锋, 杨军, 林福呈, 王燃, 罗朝鹏, 翟妞, 许亚龙, 金立锋 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院