专利名称：一种基于热稳定性内切酶检测基因突变和snp位点的试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种基于热稳定性内切酶检测基因突变和SNP位点的试剂盒和方法。
背景技术：
个体化医疗，就是针对病人的特征，因病因人用药，使病人在获得最大利益的同时使毒副作用减少到最轻。目前，基因突变(点突变、缺失突变、插入突变)和单核苷酸多态性(SNP)在个体化医疗中引起广泛关注。
肺癌是严重危害人民生命和健康的常见病。研究表明表皮生长因子受体(EGFR)基因突变与肺癌病人对抗肿瘤药物易瑞莎的敏感性有关，其中以19号外显子内缺失突变以及21号外显子的点突变L858R最为常见。但当用药一段时间后，EGFR基因会发生二次突变，导致耐药产生。EGFR基因耐药主要突变型为Thr790位点的Thr790Met突变，发生C > T突变。此外，若肺癌患者存在K-ras原发性基因突变，即使存在EGFR基因敏感性突变，对易瑞莎等靶向药物也会产生耐药。主要突变型为Glyl2位点的Glyl2Arg、Glyl2Cys、Glyl2Ser、Glyl2Ala、Glyl2Asp、Glyl2Val, Glyl3 位点的 Glyl3Asp、Glyl3Val。因此，在对肺癌患者选择进行靶向药物治疗或对用药肺癌患者进行用药监控时，需对EGFR基因Thr790Met突变和K_ras基因的主要突变型进行检测，以确认是否用药有效。此外，K-ras基因突变与大肠癌等肿瘤患者酪氨酸激酶抑制剂等靶向药物的原发性耐药有关。K-ras基因突变检测做为结直肠癌患者进入个体化靶向治疗疗程之前需要进行的检测，已经被NCCN(美国癌症综合网络)列为《结肠癌临床治疗指南》中必不可少的一项。K-ras基因野生型的患者能从爱必妥(Erbitux,又称西妥昔单抗/Cetuximab)或维克替比(Vectibix,又称帕尼单抗/Panitumumab)治疗中获益,而K_ras基因突变的大肠癌患者治疗效果较差。美国FDA和欧洲药监局明确规定了在使用靶向药物爱必妥和维克替比治疗转移性大肠癌前必须检测K-ras基因。单核苷酸多态性(SNP)是人类基因组中最常见的遗传多态性表达形式，SNP在基因组中分布相当广泛，在人类基因组中每300-1000碱基对就出现一次，SNP总量大概是3 X IO6个。近年的研究表明，SNP位点与个体表型差异、对药物或疾病的易感性相关。因此，SNP位点的研究已广泛用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究中等。SNP位点的检测，在个体化医疗中也具有广泛的应用前景和价值。例如，核苷酸切除修复(NER)和碱基切除修复(BER)是人体内两种极为重要的DNA修复途径，XRCCl和ERCCl基因分别在NER和BER途径中发挥重要作用。XRCCl中Arg399Gln (CAG — CGG)多态性位于蛋白质重要的结构域内，ERCCl中Asnll8Asn多态性(对应于AAC和AAT的无义突变)能够影响到ERCCl蛋白的表达水平，这两个基因的多态性影响到肿瘤细胞对钼类化疗药物的敏感性。有研究表明XRCCl基因中399位GG基因型患者采用钼类药物的疗效更佳，而ERCCl基因中118位密码子CC基因型对钼类药物化疗反应性较好。因此，可通过对SNP位点的检测实现个体化用药指导。目前，DNA测序法仍然是检测SNP位点和基因突变使用最多的方法，但需要获取组织、分离细胞、提取核酸和进行测序，所需时间长、费用高，对取材和技术要求都比较严格，因此应用于临床仍受到一定程度的限制。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明将热稳定性内切酶与Taq酶融合在一个反应体系中，通过在实时荧光定量PCR中对野生型基因进行实时 酶切，从而实现对突变基因和SNP位点的检测，为临床提供一种简便、快速、准确和经济的SNP位点和基因突变分析方法。因此，本发明的一个目的在于提供一种检测基因突变(包括点突变、缺失突变和插入突变)和SNP位点的试剂盒。本发明的另一个目的在于提供一种检测基因突变(包括点突变、缺失突变和插入突变)和SNP位点的方法，利用该方法可以提高检测基因突变的分辨率。根据一个方面，本发明提供一种检测基因突变(包括点突变、缺失突变和插入突变)和SNP位点的试剂盒，其中，所述试剂盒包含酶切野生型基因的热稳定性内切酶。本发明中，所述试剂盒包含扩增引物，优选地，在所述扩增引物中通过错配碱基的方式引入所述热稳定性内切酶的酶切位点，从而使所述热稳定性内切酶在PCR反应的同时酶切野生型PCR产物。更具体而言，根据本发明的一个实施方式，提供了一种检测EGFR基因突变、K-ras基因突变、B-raf基因突变、PI3K基因突变和/或XRCCl基因SNP位点的试剂盒。其中，所述EGFR基因突变选自EGFR基因Thr790Met点突变、Leu858Arg点突变，和EGFR基因 19 号外显子 2235_2249 区域的 2235_2249 del 15、2236_2250 del 15、2236_2253del 18、2237_2251 del 15、2237_2254 del 18、2239_2247 del 9、2239_2253 del 15、2240_2251 del 12、2240_2254 del 15、2235_2252 > AAT、2237_2250 > T、2238_2248 >GC、2238_2252 > GCA、2239_2248 TTAAGAGAAG > C、2239_2251 > C 等 15 种缺失突变中，所述 K-ras 基因突变选自 K-ras 基因 Glyl2Arg> Glyl2Cys> Glyl2Ser> Glyl2Ala> Glyl2Asp>Glyl2Val、Glyl3Asp 和 Glyl3Val 点突变中，所述 B_raf 基因突变为 B_raf 基因 Val600Glu点突变，所述PI3K基因突变选自PI3K基因Glu542Lys和Glu545Lys点突变中，以及所述XRCCl 基因 SNP 位点为 Arg399Gln。本文中“ > ”前表示缺失区域，“ > ”后碱基表示在缺失后又在此区域内插入的碱基。本发明中，所述试剂盒包括以下组分(I)检测EGFR基因Thr790Met突变的组合体a) Thr790Mix 包括 Thr790 上游引物(SEQ ID No. I)、Thr790 下游引物(SEQIDNo. 2)、Thr790 探针(SEQ ID No. 3)；b)热稳定性内切酶Bstn ;和/或(2)检测EGFR基因Leu858Arg突变的组合体
a) Leu858Mix 包括 Leu858 上游引物(SEQ ID No. 4)、Leu858 下游引物(SEQIDNo. 5)、Leu858 探针(SEQ ID No. 6)；b)热稳定性内切酶PspGI ;和/或(3)检测EGFR基因19号外显子15种缺失突变的组合体a) 19del Mix :包括 19del 上游引物(SEQ ID No. 7)、19del 下游引物(SEQ IDNo. 8)、19del 探针(SEQ ID No. 9)；
b)热稳定性内切酶MwoI ;和/或(4)检测K-ras基因Glyl2位点突变的组合体a)Glyl2Mix 包括 Gly 12 上游引物(SEQ ID No. 10)、Gly 12 下游引物(SEQIDNo. 11)、Gly 12 探针(SEQ ID No. 12)；b)热稳定性内切酶PspGI和/或(5)检测K-ras基因Glyl3位点突变的组合体a)Glyl3Mix 包括 Gly 13 上游引物(SEQ ID No. 13)、Gly 13 下游引物(SEQIDNo. 14)、Glyl3 探针(SEQ ID No. 15)；b)热稳定性内切酶PhoI ;和/或(6)检测B-raf基因Val600Glu突变的组合体a) Val600 Mix :包括 Val600 上游引物(SEQ ID No. 16)、Val600 下游引物(SEQIDNo. 17)、Val600 探针(SEQ ID No. 18)；b)热稳定性内切酶TspRI ;和/或(7)检测PI3K基因Glu542Lys突变的组合体a)Glu542 Mix :包括 Glu542 上游引物(SEQ ID No. 19)、Glu542 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu542 探针(SEQ ID No. 21)；b)热稳定性内切酶TspRI ;和/或(8)检测PI3K基因Glu545Lys突变的组合体a)Glu545 Mix :包括 Glu545 上游引物(SEQ ID No. 22)、Glu545 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu545 探针(SEQ ID No. 21)；b)热稳定性内切酶TspRI ;和/或(9)检测XRCCl基因SNP位点Arg399Gln的组合体a)Arg399 Mix :包括 Arg399 上游引物(SEQ ID No. 23)、Arg399 下游引物(SEQIDNo. 24)、Arg399 探针(SEQ ID No. 25)；b)热稳定性内切酶PspGI。在本发明的一个优选实施方式中，本发明所述的试剂盒包括以下组分(I)检测EGFR基因Thr790Met突变的组合体a) Thr790 Mix 包括 Thr790 上游引物(SEQ ID No. I)、Thr790 下游引物(SEQIDNo. 2)、Thr790 探针(SEQ ID No. 3)、Rox 校正液、纯水；b)热稳定性内切酶Bstn ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水；d)质控标准品人基因组DNA标准品；e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和EGFR基因Thr790Met突变型标准品；和/或(2)检测EGFR基因Leu858Arg突变的组合体a) Leu858 Mix :包括 Leu858 上游引物(SEQ ID No. 4)、Leu858 下游引物(SEQIDNo. 5)、Leu858 探针(SEQ ID No. 6)、Rox 校正液、纯水；b)热稳定性内切酶PspGI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水；d)质控标准品人基因组DNA标准品；e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和EGFR基因Leu858Arg突变型标准品；和/或
(3)检测EGFR基因19号外显子15种缺失突变的组合体a) 19del Mix :包括 19del 上游引物(SEQ ID No. 7)、19del 下游引物(SEQ IDNo. 8)、19del 探针(SEQ ID No. 9)、Rox 校正液、纯水；b)热稳定性内切酶MwoI ；c)、Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水；d)质控标准品人基因组DNA标准品；e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和EGFR基因2235_2249 del 15突变型标准品；和/或(4)检测K-ras基因Glyl2位点突变的组合体a) Gly 12 Mix 包括 Gly 12 上游引物(SEQ ID No. 10)、Gly 12 下游引物(SEQIDNo. 11)、Gly 12 探针(SEQ ID No. 12)、Rox 校正液、纯水;b)热稳定性内切酶PspGI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水；d)质控标准品人基因组DNA标准品；e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和K_ras基因Glyl2Arg突变型标准品；和/或(5)检测K-ras基因Glyl3位点突变的组合体a) Gly 13 Mix 包括 Gly 13 上游引物(SEQ ID No. 13)、Gly 13 下游引物(SEQIDNo. 14)、Gly 13 探针(SEQ ID No. 15)、Rox 校正液、纯水；b)热稳定性内切酶PhoI ；c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水；d)质控标准品人基因组DNA标准品；e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和K_ras基因Glyl3Asp突变型标准品；和/或(6)检测B-raf基因Val600Glu突变的组合体a) Val600 Mix :包括 Val600 上游引物(SEQ ID No. 16)、Val600 下游引物(SEQIDNo. 17)、Val600 探针(SEQ ID No. 18)、Rox 校正液、纯水；b)热稳定性内切酶TspRI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水；d)质控标准品人基因组DNA标准品；
e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和B_raf基因Val600Glu突变型标准品；和/或(7 )检测PI3K基因Glu542Lys突变的组合体a)Glu542 Mix :包括 Glu542 上游引物(SEQ ID No. 19)、Glu542 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu542 探针(SEQ ID No. 21)、Rox 校正液、纯水；b)热稳定性内切酶TspRI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水；d)质控标准品人基因组DNA标准品；e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和PI3K基因Glu542Lys突变型标准品；和/或(8)检测PI3K基因Glu545Lys突变的组合体a)Glu545 Mix :包括 Glu545 上游引物(SEQ ID No. 22)、Glu545 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu545 探针(SEQ ID No. 21)、Rox 校正液、纯水；b)热稳定性内切酶TspRI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水；d)质控标准品人基因组DNA标准品；e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和PI3K基因Glu545Lys突变型标准品；和/或(9)检测XRCCl基因SNP位点Arg399Gln的组合体a)Arg399 Mix :包括 Arg399 上游引物(SEQ ID No. 23)、Arg399 下游引物(SEQIDNo. 24)、Arg399 探针(SEQ ID No. 25)、Rox 校正液、纯水；b)热稳定性内切酶PspGI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水；d)质控标准品人基因组DNA标准品；e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和K-ras基因Arg399Gln型标准品。在本发明的优选实施方式中，所述组合体中，引物和探针的比例为I : I 5 : 2，优选为5 4。根据另一个方面，本发明提供了一种用于检测基因突变(包括点突变、缺失突变和插入突变)和SNP位点的方法。本发明的方法的特征在于，在同一个反应体系中采用热稳定性内切酶进行边扩增边酶切野生型PCR产物的反应。在本发明的方法中，优选地，可以包括在扩增引物中通过错配碱基的方式引入一个所述热稳定性内切酶的酶切位点的步骤。在本发明的方法中，优选地，在使所述热稳定性内切酶在PCR反应的同时酶切野生型PCR产物的反应中，使用的热稳定性内切酶在95°C的半衰期为20-120min。更具体而言，根据本发明的一个实施方式，提供了一种检测EGFR基因突变、K-ras基因突变、B-raf基因突变、PI3K基因突变和/或XRCCl基因SNP位点的方法。其中，所述EGFR基因突变选自EGFR基因Thr790Met点突变、Leu858Arg点突变，EGFR基因 19 号外显子 2235_2249 区域的 2235_2249 del 15、2236_2250 del 15、2236_2253del 18、2237_2251 del 15、2237_2254 del 18、2239_2247 del 9、2239_2253del 15、2240_2251del 12、2240_2254 del 15、2235_2252 > AAT、2237_2250 > T、2238_2248 > GC、2238_2252 > GCA、2239_2248TTAAGAGAAG > C,22392251 > C 等 15 种缺失突变中，所述 K_ras 基因突变选自 K_ras 基因 Glyl2Arg、Glyl2Cys、Glyl2Ser、Glyl2Ala、Glyl2Asp、Glyl2Val、Glyl3Asp 和 Glyl3Val 点突变中，所述 B_raf 基因突变为 B_raf 基因Val600Glu点突变，所述PI3K基因突变选自PI3K基因Glu542Lys和Glu545Lys点突变中，以及XRCCl基因SNP位点为Arg399Gln。所述方法包括I)制备检测样本；2)在一个反应体系中进行边扩增边酶切反应，其中，可以在引物中通过错配碱基方式引入酶切位点，使野生型的PCR产物可被内切酶酶切，其中①检测EGFR基因Thr790Met突变的引物和探针的制备EGFR基因Thr790位点在下游引物3’末端第三个碱基通过c/A错配，引入热稳定性内切酶Bstn酶切位点CGCG，引物及探针序列如下EGFR Thr790 上游引物:5，-ACGTGTGCCGCCTGCT-3’ (SEQ ID No. I)EGFR Thr790 下游引物5’ -CCGAAGGGCATGAGCcGC-3’ (SEQ ID No. 2)EGFR Thr790 探针5’ -FAM-CATCTGCCTCACCTCCACCGTGC-BHQ2-3，(SEQ IDNo. 3)；②检测EGFR基因Leu858Arg突变的引物和探针的制备EGFR基因Leu858位点在上游引物3’末端第二个碱基通过c/C错配，引入热稳定性内切酶PspGI酶切位点CCWGG (W = A或者T)，引物及探针序列如下EGFR Leu858 上游引物5’ -GTCAAGATCACAGATTTTGGcC-3’ (SEQ ID No. 4)EGFR Leu858 下游引物5’ -GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3’ (SEQ ID No. 5)EGFR Leu858 探针5， -FAM-TTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGT-BHQ2-3’ (SEQIDNo.6)；③检测EGFR基因19号外显子15种缺失突变的引物和探针的制备EGFR基因19号外显子的缺失突变，在下游引物3’末端第三个碱基通过c/C错配，弓I入热稳定性内切酶MwoI酶切位点GCNNNNNNNGC (N = A或者T或者G或者C)，引物及探针序列如下EGFR 19del 上游引物:5，-GTCATAGGGACTCTGGATCCC-3’ (SEQ ID No. 7)EGFR 19del 下游引物5，-AITTCCTTGITGGCnTCGcAG-3’ (SEQ ID No. 8)EGFR 19del 探针5’ -FAM-CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAG-BHQ2-3’ (SEQIDNo. 9)；④检测K-ras基因Glyl2位点突变的引物和探针的制备K-ras基因Glyl2位点在上游引物3’末端第三个碱基通过c/C错配，引入热稳定性内切酶PspGI酶切位点CCWGG (W = A或者T)，引物及探针序列如下K-ras Glyl2 上游引物:5’ -TAAACTTGTGGTAGTTGGAcCT-3，(SEQ ID No. 10)K-ras Glyl2 下游引物:5’ -TGGTCCTGCACCAGTAATATGC-3，(SEQ ID No. 11)K-ras Glyl2 探针5’ -FAM-AGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCA-BHQ2-3’ (SEQIDNo. 12)；⑤检测K-ras基因Glyl3位点突变的引物和探针的制备K-ras基因Glyl3位点在下游引物3’末端第二个碱基通过g/G错配,引入热稳定性内切酶PhoI酶切位点GGCC，引物及探针序列如下K-ras Glyl3 上游引物5’ -GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3’ (SEQ ID No. 13)K-ras Glyl3 下游引物5，-GTCAAGGCACTCTTGCCTAgG-3’ (SEQ ID No. 14)K-ras Glyl3 探针5， -FAM-TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT-BHQ2-3， (SEQIDNo.15)；⑥检测B-raf基因Val600Glu突 变的引物和探针的制备B-raf基因Val600位点，具有天然的热稳定性内切酶TspRI酶切位点CASTG (S =C或者G)，无需引入酶切位点，即可直接对PCR产物进行酶切，引物及探针序列如下Val600 上游引物5，-ACCCACTCCATCGAGATTTC-3’ (SEQ ID No. 16)Val600 下游引物5’ -AACTCTTCATAATGCTTGCTCTGA-3’ (SEQ ID No. 17)Val600 探针5， -FAM-ACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTC-BHQ2-3， (SEQIDNo. 18)；⑦检测PI3K基因Glu542Lys突变的引物和探针的制备PI3K基因Glu542位点，在上游引物3 ’末端第三个碱基通过a/A错配，弓丨入热稳定性内切酶TspRI酶切位点CASTG (S = C或者G)，引物及探针序列如下Glu542 上游引物(引入酶切位点):5，-TTTCTACACGAGATCCTCTCaCT-3’ (SEQIDNo. 19)Glu542 下游引物5’-GCTGAGATCAGCCAAAITCAGT-3’ (SEQ ID No. 20)Glu542 探针5， -FAM-ATGGAGTCACAGGTAAGTGCTAAAATGGAG-BHQ2-3’ (SEQIDNo. 21)；⑧检测PI3K基因Glu545Lys突变的引物和探针的制备PI3K基因Glu545位点，具有天然的热稳定性内切酶TspRI酶切位点CASTG (S = C或者G)，无需引入酶切位点，即可直接对PCR产物进行酶切，引物及探针序列如下Glu545 上游引物5’-GAGATCCTCTCTCTGAAATCACT-3’ (SEQ ID No. 22)Glu545 下游引物同 SEQ ID No. 20Glu545 探针同 SEQ ID No. 21 ；⑨检测XRCCl基因SNP位点Arg399Gln的引物和探针的制备XRCCl基因SNP位点Arg399Gln，在下游引物3’末端第二个碱基通过c/A错配，弓丨入热稳定性内切酶PspGI酶切位点CCWGG (W = A或者T)，引物及探针序列如下Arg399 上游引物5’-TTGCCAACACCCCCAAGTAC-3’ (SEQ ID No. 23)Arg399 下游引物5，-GGCGTGTGAGGCCTTACCcC-3’ (SEQ ID No. 24)Arg399 探针5，-FAM-AGGCCGCATCGTGCGTAAGGAG-BHQ2-3，(SEQ ID No. 25)；以及，使用选自上述制备的引物和探针中的一种或多种分别进行荧光定量PCR反应；3)结果分析。本发明中，所述步骤2)中进一步包括a)试剂配制Thr790内参体系包括Taq Mix、Thr790 Mix、纯水；Thr790检测体系包括TaqMix、Thr790 Mix、热稳定性内切酶Bstn ；
Leu858内参体系包括Taq Mix、Leu858 Mix、纯水；Leu858检测体系包括的TaqMix、Leu858 Mix、热稳定性内切酶 PspGI ；19del内参体系:包括Taq Mix、19del Mix、纯水；19del检测体系:包括Taq Mix、19del Mix、热稳定性内切酶MwoI ；Glyl2内参体系:包括Taq Mix、Glyl2 Mix、纯水;Glyl2检测体系:包括Taq Mix、Glyl2 Mix、热稳定性内切酶PspGI ；Glyl3内参体系:包括Taq Mix、Glyl3 Mix、纯水;Glyl3检测体系:包括Taq Mix、Glyl3 Mix、热稳定性内切酶PhoI ；Val600内参体系包括Taq Mix、Val600 Mix、纯水；Val600检测体系包括Taq Mix、Val600 Mix、热稳定性内切酶TspRI ；Glu545内参体系包括Taq Mix、Glu542 Mix、纯水；Glu545检测体系包括TaqMix、Glu542 Mix、热稳定性内切酶TspRI ；Glu545内参体系包括Taq Mix、Glu545 Mix、纯水；Glu545检测体系包括TaqMix、Glu545 Mix、热稳定性内切酶TspRI ；Arg399内参体系包括Taq Mix、Arg399 Mix、纯水；Arg399检测体系包括TaqMix、Arg399 Mix、热稳定性内切酶PspGI ；b)向a)中的内参体系及检测体系中，加所述步骤I)中制备的检测样本，以及阳性对照标准品和质控标准品；C)、运行程序，Thr790Met 检测程序95°C 3min ;40 个循环92 °C 15sec，60°C 2min(收集荧光);Leu858Arg 检测程序为95°C 3min ;40 个循环92°C 15sec,60°C 35sec(收集突光)，75°C 2min ；EGFR基因19号外显子的缺失突变型检测程序为95°C 3min ;40个循环92°C15sec,60°C 2min(收集突光)；K-ras Glyl2 位点检测程序95°C 3min ;40 个循环92°C 15sec，55°C 35sec (收集荧光)，75°C 2min ；K-ras Glyl3 位点检测程序95°C 3min ;40 个循环92°C 15sec，55°C 35sec (收集荧光)，75°C 2min ；B-raf■基因 Val600 检测程序为95 °C 3min ;40 个循环92 °C 15sec，60°C35sec (收集荧光)，65°C 2min ；PI3K 基因 Glu542 位点检测程序为95°C 3min ;40 个循环92 °C 15sec，60°C35sec (收集荧光)，65°C 2min ；PI3K 基因 Glu545 位点检测程序为95°C 3min ；92°C 15sec，60°C 35sec(收集荧光),65。。2min ；XRCCl 基因 SNP 位点 Arg399Gln 检测程序为95 °C 3min ；92 °C 15sec，60 °C35sec (收集荧光)，75°C 2min。所述步骤3)中的结果分析具体为a)分析所述阳性对照标准品的内参体系和检测体系，当内参体系或检测体系无信号，说明检测体系无效，应停止分析，更换试剂重新检测；只有当所述阳性对照标准品的内参体系和检测体系均有信号，则继续分析结果；b)在a)的条件下，分析所述质控标准品的内参体系和检测体系，当检测体系出现信号，说明热稳定性内切酶无效或存在污染，应停止分析，更换试剂重新检测；只有当所述质控标准品的检测体系无信号而内参有信号时，则继续分析结果； c)在a)和b)的条件下，当所述样本的内参Ct值大于36或无信号，说明提取的DNA样本浓度过低或存在Taq酶抑制剂，需重新进行DNA提取；d)在a)和b)的条件下，当所述样本的内参Ct值小于质控标准品Ct值，所述样本检测体系有信号时，可能由于提取的DNA超出检测范围导致热稳定性内切酶的酶切不完全而引起的非特异性扩增所致，则需稀释所述样本重新检测；只有当所述样本检测体系无信号，判断为阴性结果；e)在a)和b)的条件下，当所述样本内参Ct值大于所述质控标准品Ct值并且小于36，所述样本检测体系无信号时，则判断为阴性结果；当所述样本检测体系有信号时，则判断为阳性结果。本发明通过在扩增引物中通过错配碱基方式引入一个内切酶酶切位点，在实时荧光定量PCR中对野生型基因进行实时酶切，以使突变型基因得到选择性扩增从而实现对突变基因和SNP位点的检测。本方法适用于常见的碱基变异类型，包括体细胞点突变、缺失突变、插入突变和遗传性SNP位点分析，从而为临床提供一种简便、快速、准确和经济的基因突变和SNP位点分析方法。
图I为使用本发明的方法检测EGFR基因Thr790Met突变的阴性样本有无高温内切酶的比较结果的图。图2为使用本发明的方法检测EGFR基因Thr790Met突变的阳性样本有无高温内切酶的比较结果的图。图3为使用本发明的方法检测K-ras基因Glyl2Arg突变的阴性样本有无高温内切酶的比较结果的图。图4为使用本发明的方法检测K-ras基因Glyl2Arg突变的阳性样本有无高温内切酶的比较结果的图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。以下实施例中，热稳定性限制性内切酶BstUI、PspGI、PhoI、MwoI, TspRI购自英国NEB公司，2XPremix Ex Taq购自Takara公司(此Mix已包括PCR缓冲液、dNTP、Mg2+，均由供应商提供)，所用引物及探针由上海生工合成，Tiangen组织样本基因组DNA提取试剂盒购自北京天跟生物科技有限公司。2 X Rox校正液购自日本TakaRa公司，人基因组DNA标准品购自美国SIGMA-ALDRICH。EGFR基因Thr79Met突变型标准品、EGFR基因Leu858Arg突变型标准品、EGFR基因2235_2249 del 15突变型标准品、K_ras基因Glyl2Arg突变型标准品、K_ras基因Glyl3Asp突变型标准品、B-raf基因Val600Glu突变型标准品、PI3K基因Glu542Lys突变型标准品、PI3K基因Glu545Lys突变型标准品、K_ras基因Arg399Gln型标准品均购自中国生物制品药品鉴定所。所用仪器为美国ABI公司ABI7300荧光定量PCR仪。实施例I引物和探针设计引物与探针序列设计I、引物设计 分别设计可扩增一段70-150bp的引物，相关参数为Tm值58. (TC -60. 0°C，GC值40.0% -65. 0%，引物大小20±3bp。并在引物中通过错配碱基方式引入酶切位点，使野生型的PCR产物可被内切酶酶切。EGFR基因Thr790位点在下游引物3’末端第三个碱基通过c/A错配，引入热稳定内切酶Bstn酶切位点CGCG。EGFR基因Leu858位点在上游引物3’末端第二个碱基通过c/C错配，引入热稳定性内切酶PspGI酶切位点CCWGG (W = A或者T)。EGFR基因19号外显子22352249区域15种缺失突变，在下游引物3’末端第三个碱基通过c/C错配，引入热稳定性内切酶MwoI酶切位点GCNNNNNNNGC (N = A或者T或者G或者C)。K-ras Gly 12位点在上游引物3’末端第三个碱基通过c/C错配,引入热稳定内切酶PspGI酶切位点CCWGG(W = A或者T)。K-ras Glyl3位点在下游引物3’末端第二个碱基通过g/G错配，引入热稳定内切酶PhoI酶切位点GGCC。B-raf基因Val600位点，具有天然的热稳定性内切酶TspRI酶切位点CASTG (S = C或者G)，无需引入酶切位点，即可直接对PCR产物进行酶切。PI3K基因Glu542位点，在上游引物3’末端第三个碱基通过a/A错配，引入热稳定性内切酶TspRI酶切位点CASTG(S = C或者G)。PI3K基因Glu545位点，具有天然的热稳定性内切酶TspRI酶切位点CASTG (S = C或者G)，无需引入酶切位点，即可直接对PCR产物进行酶切。XRCCl基因SNP位点Arg399Gln，在下游引物3’末端第二个碱基通过c/A错配，引入热稳定性内切酶PspGI酶切位点CCWGG(W = A或者T)。所设计的引物序列如下EGFR Thr790 上游引物:5，-ACGTGTGCCGCCTGCT-3’ (SEQ ID No. I)EGFR Thr790 下游引物(引入酶切位点):5，-CCGAAGGGCATGAGCcGC-3’ (SEQIDNo. 2)EGFR Leu858 上游引物(引入酶切位点)5’ -GTCAAGATCACAGATTTTGGcC-3J (SEQID No. 4)EGFR Leu858 下游引物5’ -GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3’ (SEQ ID No. 5)EGFR 19del 上游引物5，-GTCATAGGGACTCTGGATCCC-3’ (SEQ ID No. 7)EGFR 19del 下游引物(引入酶切位点):5，-AITTCCTTGITGGCnTCGcAG-3，(SEQIDNo. 8)K-ras Glyl2 上游引物(引入酶切位点)5’-TAAACTTGTGGTAGTTGGAcCT-3’ (SEQID No. 10)K-ras Glyl2 下游引物:5，-TGGTCCTGCACCAGTAATATGC-3，(SEQ ID No. 11)K-ras Glyl3 上游引物5’ -GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3’ (SEQ ID No. 13)K-ras Glyl3 下游引物(引入酶切位点)5’-GTCAAGGCACTCTTGCCTAgG-3’ (SEQIDNo. 14)Val600 上游引物5，-ACCCACTCCATCGAGATTTC-3’ (SEQ ID No. 16)。Val600 下游引物5’ -AACTCTTCATAATGCTTGCTCTGA-3’ (SEQ ID No. 17)Glu542 上游引物(引入酶切位点):5，-TTTCTACACGAGATCCTCTCaCT-3’ (SEQIDNo. 19) Glu542 下游引物5’-GCTGAGATCAGCCAAAITCAGT-3’ (SEQ ID No. 20)Glu545 上游引物5’-GAGATCCTCTCTCTGAAATCACT-3’ (SEQ ID No. 22)Glu545 下游引物同 SEQ ID No. 20Arg399 上游引物5’-TTGCCAACACCCCCAAGTAC-3’ (SEQ ID No. 23)Arg399 下游引物(引入酶切位点):5’-GGCGTGTGAGGCCTTACCcC-3’ (SEQ IDNo.24)。3、探针设计分别在ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为Tm值68. (TC -70. 0°C，GC值40. 0% -70. 0%,对探针进行5’端FAM标记，3’端TAMRA标记，其序列如下EGFR Thr790 探针5，-FAM-CATCTGCCTCACCTCCACCGTGC-BHQ2-3，(SEQ IDNo. 3)EGFR Leu858 探针5’ -FAM-TTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGT-BHQ2-3’ (SEQ IDNo. 6)EGFR 19del 探针5， -FAM-CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAG-BHQ2-3， (SEQIDN0. 9)K-ras Glyl2 探针5， -FAM-AGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCA-BHQ2-3， (SEQIDNo. 12)。K-ras Glyl3 探针5， -FAM-TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT-BHQ2-3， (SEQIDNo.15)。Val600探针5’-FAM-ACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTC-BHQ2_3’ (SEQ IDNo. 18)Glu542探针5’-FAM-ATGGAGTCACAGGTAAGTGCTAAAATGGAG-BHQ2_3’ (SEQ IDNo. 21)Glu545 探针同 SEQ ID No. 21Arg399 探针5’-FAM-AGGCCGCATCGTGCGTAAGGAG-BHQ2-3’ (SEQ ID No. 25)。实施例2利用本方法检测基因突变和SNP位点本发明的检测方法是在扩增引物中通过错配碱基方式引入一个内切酶酶切位点，在实时荧光定量PCR中对野生型基因进行实时酶切，使突变型基因得到选择性扩增，从而实现对突变基因和SNP位点的检测。因此，本发明的突变富集ARMS荧光定量PCR的检测方法整合了酶切富集PCR技术和ARMS荧光定量PCR技术，即在一个反应体系中对样品分别进行酶切、PCR富集和ARMS荧光定量PCR鉴定。具体过程为I、样本制备采用Tiangen组织样本基因组DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA。2、检测方法EGFR基因Thr790位点的检测下游引物3’末端的第三个碱基引入c/A错配后，在60°C经Taq酶PCR扩增后，其产物在野生型Thr790位点产生热稳定性内切酶BstM酶切位点CGCG，同时Bstn酶在60°C时具有最大酶切活性。因此，在60°C 2min时，Taq酶PCR扩增后，BstUI酶对扩增出的野生型Thr790进行酶切，使其野生型基因不能作为模板进行下一轮PCR指数级扩增；而当Thr790位点发生Thr790Met突变后，PCR产物无Bstn酶的CGCG酶切位点，因此，突变型的Thr790位点可进行PCR指数级扩增，产生荧光信号。EGFR Thr790位点突变检测体系如表I所示。PCR反应程序为95°C 3min ；92°C 15sec，60°C 2min(收集荧光)，共40个循环。表I
权利要求
1.一种检测基因突变和SNP位点的试剂盒，其中，所述试剂盒包含酶切野生型基因的热稳定性内切酶。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含扩增引物，在所述扩增引物中通过错配碱基的方式引入所述热稳定性内切酶的酶切位点，从而使所述热稳定性内切酶在PCR反应的同时酶切野生型PCR产物。
3.—种检测基因突变和SNP位点的试剂盒，其中，所述基因突变选自EGFR基因突变、K-ras基因突变、B-raf基因突变和PI3K基因突变中，以及所述SNP位点为XRCCl基因SNP位点， 其中，所述EGFR基因突变选自EGFR基因Thr790Met点突变、Leu858Arg点突变，和EGFR基因 19 号外显子 2235_2249 区域的 2235_2249 del 15、2236_2250 del 15、2236_2253del 18、2237_2251 del 15、2237_2254 del 18、2239_2247 del 9、2239_2253 del 15、2240_2251 del 12、2240_2254 del 15、2235_2252 > AAT、2237_2250 > T、2238_2248 >GC、2238_2252 > GCA、2239_2248TTAAGAGAAG > C、2239_2251 > C 的 15 种缺失突变中，所述 K-ras 基因突变选自 K-ras 基因 Glyl2Arg> Glyl2Cys> Glyl2Ser> Glyl2Ala> Glyl2Asp>Glyl2Val、Glyl3Asp 和 Glyl3Val 点突变中，所述 B_raf 基因突变为 B_raf 基因 Val600Glu点突变，所述PI3K基因突变选自PI3K基因Glu542Lys和Glu545Lys点突变中，以及所述XRCCl 基因 SNP 位点为 Arg399Gln， 其中，所述试剂盒包括以下组分 (1)检测EGFR基因Thr790Met突变的组合体 a)Thr790 Mix :包括Thr790上游引物(SEQ ID No. I)、Thr790下游引物(SEQ IDNo. 2)、Thr790 探针(SEQ ID No. 3)； b)热稳定性内切酶BstUI;和/或 (2)检测EGFR基因Leu858Arg突变的组合体 a)Leu858 Mix :包括Leu858上游引物(SEQ ID No. 4)、Leu858下游引物(SEQ IDNo. 5)、Leu858 探针(SEQ ID No. 6)； b)热稳定性内切酶PspGI;和/或 (3)检测EGFR基因19号外显子15种缺失突变的组合体a)19del Mix :包括 19del 上游引物(SEQ ID No. 7)、19del 下游引物(SEQ ID No. 8),19del 探针(SEQ ID No. 9)； b)热稳定性内切酶MwoI;和/或 (4)检测K-ras基因Glyl2位点突变的组合体a)Glyl2Mix :包括 Glyl2 上游引物(SEQ ID No. 10)、Glyl2 下游引物(SEQ IDNo. 11)、Glyl2 探针(SEQ ID No. 12)； b)热稳定性内切酶PspGI和/或 (5)检测K-ras基因Glyl3位点突变的组合体a)Glyl3Mix :包括 Glyl3 上游引物(SEQ ID No. 13)、Glyl3 下游引物(SEQ IDNo. 14)、Glyl3 探针(SEQ ID No. 15)； b)热稳定性内切酶PhoI;和/或 (6)检测B-raf基因Val600Glu突变的组合体a)Val600Mix 包括 Val600 上游引物(SEQ ID No. 16)、Val600 下游引物(SEQIDNo. 17)、Val600 探针(SEQ ID No. 18)； b)热稳定性内切酶TspRI;和/或 (7)检测PI3K基因Glu542Lys突变的组合体 a)Glu542Mix 包括 Glu542 上游引物(SEQ IDNo. 19)、Glu542 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu542 探针(SEQ ID No. 21)； b)热稳定性内切酶TspRI;和/或 (8)检测PI3K基因Glu545Lys突变的组合体 a)Glu545Mix 包括 Glu545 上游引物(SEQ ID No. 22)、Glu545 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu545 探针(SEQ ID No. 21)； b)热稳定性内切酶TspRI;和/或 (9)检测XRCCl基因SNP位点Arg399Gln的组合体 a)Arg399Mix 包括 Arg399 上游引物(SEQ ID No. 23)、Arg399 下游引物(SEQIDNo. 24)、Arg399 探针(SEQ ID No. 25)； b)热稳定性内切酶PspGI。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括以下组分 (1)检测EGFR基因Thr790Met突变的组合体 a)Thr790 Mix :包括Thr790上游引物(SEQ ID No. I)、Thr790下游引物(SEQ IDNo. 2)、Thr790 探针(SEQ ID No. 3)、Rox 校正液、纯水； b)热稳定性内切酶BstUI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水； d)质控标准品人基因组DNA标准品； e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和EGFR基因Thr790Met突变型标准品；和/或 (2)检测EGFR基因Leu858Arg突变的组合体 a)Leu858 Mix :包括Leu858上游引物(SEQ ID No. 4)、Leu858下游引物(SEQ IDNo. 5),Leu858 探针(SEQ ID No. 6)、Rox 校正液、纯水； b)热稳定性内切酶PspGI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水； d)质控标准品人基因组DNA标准品； e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和EGFR基因Leu858Arg突变型标准品；和/或 (3)检测EGFR基因19号外显子15种缺失突变的组合体 a)19del Mix :包括 19del 上游引物(SEQ ID No. 7)、19del 下游引物(SEQ ID No. 8),19del 探针(SEQ ID No. 9)、Rox 校正液、纯水； b)热稳定性内切酶MwoI； c)、TaqMix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水； d)质控标准品人基因组DNA标准品；e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和EGFR基因2235_2249del 15突变型标准品；和/或 (4)检测K-ras基因Glyl2位点突变的组合体 a)Glyl2Mix :包括 Glyl2 上游引物(SEQ ID No. 10)、Glyl2 下游引物(SEQ IDNo. 11)、Gly 12 探针(SEQ ID No. 12)、Rox 校正液、纯水； b)热稳定性内切酶PspGI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水； d)质控标准品人基因组DNA标准品； e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和K-ras基因Glyl2Arg突变型标准品；和/或 (5)检测K-ras基因Glyl3位点突变的组合体 a)Glyl3Mix :包括 Glyl3 上游引物(SEQ ID No. 13)、Glyl3 下游引物(SEQ IDNo. 14)、Gly 13 探针(SEQ ID No. 15)、Rox 校正液、纯水； b)热稳定性内切酶PhoI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水； d)质控标准品人基因组DNA标准品； e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和K-ras基因Glyl3Asp突变型标准品；和/或 (6)检测B-raf基因Val600Glu突变的组合体 a)Val600 Mix 包括 Val600 上游引物(SEQ ID No. 16)、Val600 下游引物(SEQIDNo. 17)、Val600 探针(SEQ ID No. 18)、Rox 校正液、纯水； b)热稳定性内切酶TspRI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水； d)质控标准品人基因组DNA标准品； e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和B-raf基因Val600Glu突变型标准品；和/或 (7)检测PI3K基因Glu542Lys突变的组合体 a)Glu542Mix 包括 Glu542 上游引物(SEQ IDNo. 19)、Glu542 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu542 探针(SEQ ID No. 21)、Rox 校正液、纯水； b)热稳定性内切酶TspRI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水； d)质控标准品人基因组DNA标准品； e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和PI3K基因Glu542Lys突变型标准品；和/或 (8)检测PI3K基因Glu545Lys突变的组合体 a)Glu545Mix 包括 Glu545 上游引物(SEQ ID No. 22)、Glu545 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu545 探针(SEQ ID No. 21)、Rox 校正液、纯水； b)热稳定性内切酶TspRI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水； d)质控标准品人基因组DNA标准品；e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和PI3K基因Glu545Lys突变型标准品；和/或 (9)检测XRCCl基因SNP位点Arg399Gln的组合体 a)Arg399Mix 包括 Arg399 上游引物(SEQ ID No. 23)、Arg399 下游引物(SEQIDNo. 24)、Arg399 探针(SEQ ID No. 25)、Rox 校正液、纯水； b)热稳定性内切酶PspGI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反应缓冲液、dNTP、Mg2+、无菌纯水； d)质控标准品人基因组DNA标准品； e)阳性标准品包括人基因组DNA标准品和K-ras基因Arg399Gln型标准品。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述组合体中，引物和探针的比例为I : I 5 2，优选为5 4。
6.一种检测基因突变和SNP位点的方法，其特征在于，在一个反应体系中采用热稳定性内切酶在PCR反应的同时进行酶切野生型PCR产物的反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括在扩增引物中通过错配碱基的方式引入所述热稳定性内切酶的酶切位点。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述热稳定性内切酶在95°C的半衰期为20_120min。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述基因突变选自EGFR基因突变、K-ras基因突变、B-raf基因突变和PI3K基因突变中，以及所述SNP位点为XRCCl基因SNP位点， 其中，所述EGFR基因突变选自EGFR基因Thr790Met点突变、Leu858Arg点突变，和EGFR基因 19 号外显子 2235_2249 区域的 2235_2249 del 15、2236_2250 del 15、2236_2253 del18、2237_2251 del 15、2237_2254 del 18、2239_2247del 9、2239_2253 del 15、2240_2251del 12、2240_2254 del 15、2235_2252 > AAT、2237_2250 > T、2238_2248 > GC、2238_2252> GCA、2239_2248TTAAGAGAAG > C、2239_2251 > C 的 15 种缺失突变中，所述 K_ras 基因突变选自 K-ras 基因 Glyl2Arg、Glyl2Cys、Glyl2Ser、Glyl2Ala、Glyl2Asp、Glyl2Val、Glyl3Asp和Glyl3Val点突变中，所述B_raf基因突变为B_raf基因Val600Glu点突变，所述PI3K基因突变选自PI3K基因Glu542Lys和Glu545Lys点突变中，以及所述XRCCl基因SNP 位点为 Arg399Gln， 所述方法进ー步包括以下步骤 1)制备检测样本； 2)在一个反应体系中进行边扩增边酶切反应，其中，在引物中通过错配碱基方式引入酶切位点，使野生型的PCR产物被内切酶酶切，其中 ①检测EGFR基因Thr790Met突变的引物和探针的制备 EGFR基因Thr790位点在下游引物3’末端第三个碱基通过c/A错配，引入热稳定性内切酶Bstn酶切位点CGCG，引物及探针序列如下EGFR Thr790 上游引物:5，-ACGTGTGCCGCCTGCT-3’ (SEQ ID No. I)EGFR Thr790 下游引物5’ -CCGAAGGGCATGAGCcGC-3 ’ (SEQ ID No. 2)EGFR Thr790 探针5，-FAM-CATCTGCCTCACCTCCACCGTGC-BHQ2-3，(SEQ IDNo. 3)； ②检测EGFR基因Leu858Arg突变的引物和探针的制备EGFR基因Leu858位点在上游引物3’末端第二个碱基通过c/C错配，引入热稳定性内切酶PspGI酶切位点CCWGG，W = A或者T，引物及探针序列如下EGFR Leu858 上游引物5’ -GTCAAGATCACAGATTTTGGcC_3 ’ (SEQ ID No. 4)EGFR Leu858 下游引物5，-GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3 ’ (SEQ ID No. 5)EGFR Leu858 探针5，-FAM-TTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGT-BHQ2-3，(SEQID No. 6)； ③检测EGFR基因19号外显子15种缺失突变的引物和探针的制备 EGFR基因19号外显子的缺失突变，在下游引物3’末端第三个碱基通过c/C错配，引入热稳定性内切酶MwoI酶切位点GCNNNNNNNGC，N = A、T、G或者C，引物及探针序列如下 EGFR 19del 上游引物:5，-GTCATAGGGACTCTGGATCCC-3，(SEQ ID No. 7)EGFR 19del 下游引物5’ -ATTTCCTTGTTGGCTTTCGcAG-3’ (SEQ ID No. 8) EGFR 19del 探针5’ -FAM-CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAG-BHQ2-3’ (SEQIDNo.9)； ④检测K-ras基因Glyl2位点突变的引物和探针的制备 K-ras基因Gly 12位点在上游引物3’末端第三个碱基通过c/C错配,引入热稳定性内切酶PspGI酶切位点CCWGG，W = A或者T，引物及探针序列如下 K-ras Glyl2 上游引物:5，-TAAACTTGTGGTAGTTGGAcCT-3，(SEQ ID No. 10) K-ras Glyl2 下游引物:5，-TGGTCCTGCACCAGTAATATGC-3，(SEQ ID No. 11) K-ras Glyl2 探针5， -FAM-AGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCA-BHQ2-3， (SEQ IDNo. 12)； ⑤检测K-ras基因Glyl3位点突变的引物和探针的制备 K-ras基因Glyl3位点在下游引物3’末端第二个碱基通过g/G错配,引入热稳定性内切酶PhoI酶切位点GGCC，引物及探针序列如下K-ras Glyl3 上游引物5，-GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3’ (SEQ ID No. 13)K-ras Glyl3 下游引物5，-GTCAAGGCACTCTTGCCTAgG-3’ (SEQ ID No. 14)K-ras Glyl3 探针5，-FAM-TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT-BHQ2-3，(SEQ IDNo. 15)； ⑥检测B-raf基因Val600Glu突变的引物和探针的制备 B-raf基因Val600位点，具有天然的热稳定性内切酶TspRI酶切位点CASTG，S = C或者G，无需引入酶切位点，即可直接对PCR产物进行酶切，引物及探针序列如下Val600 上游引物:5，-ACCCACTCCATCGAGATTTC-3’ (SEQ ID No. 16)Val600 下游引物5’ -AACTCTTCATAATGCTTGCTCTGA-3’ (SEQ ID No. 17)Val600 探针5’ -FAM-ACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTC-BHQ2-3’ (SEQID No. 18)； ⑦检测PI3K基因Glu542Lys突变的引物和探针的制备 PI3K基因Glu542位点，在上游引物3’末端第三个碱基通过a/A错配，弓丨入热稳定性内切酶TspRI酶切位点CASTG，S = C或者G，引物及探针序列如下Glu542 上游引物:5，-TTTCTACACGAGATCCTCTCaCT-3’ (SEQ ID No. 19)Glu542 下游引物5’ -GCTGAGATCAGCCAAATTCAGT-3’ (SEQ ID No. 20)Glu542 探针5’-FAM-ATGGAGTCACAGGTAAGTGCTAAAATGGAG-BHQ2-3’ (SEQ ID No. 21)； ⑧检测PI3K基因Glu545Lys突变的引物和探针的制备 PI3K基因Glu545位点，具有天然的热稳定性内切酶TspRI酶切位点CASTG，S = C或者G，无需引入酶切位点，即可直接对PCR产物进行酶切，引物及探针序列如下Glu545 上游引物5’ -GAGATCCTCTCTCTGAAATCACT-3’ (SEQ ID No. 22) Glu545 下游引物同 SEQ ID No. 20 Glu545 探针同 SEQ ID No. 21 ； ⑨检测XRCCl基因SNP位点Arg399Gln的引物和探针的制备 XRCCl基因SNP位点Arg399Gln，在下游引物3’末端第二个碱基通过c/A错配，引入热稳定性内切酶PspGI酶切位点CCWGG，W = A或者T，引物及探针序列如下Arg399 上游引物5’ -TTGCCAACACCCCCAAGTAC-3’ (SEQ ID No. 23)Arg399 下游引物5’ -GGCGTGTGAGGCCTTACCcC-3 ’ (SEQ ID No. 24)Arg399 探针5’-FAM-AGGCCGCATCGTGCGTAAGGAG-BHQ2-3’ (SEQ ID No. 25)； 以及，使用选自上述制备引物和探针中的一种或多种分别进行荧光定量PCR反应； 3)结果分析。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中进ー步包括 a)试剂配制 Thr790内參体系:包括Taq Mix、Thr790 Mix、纯水；Thr790检测体系:包括Taq Mix、Thr790 Mix、热稳定性内切酶BstUI ； Leu858内參体系包括Taq Mix、Leu858 Mix、纯水；Leu858检测体系包括Taq Mix、Leu858 Mix、热稳定性内切酶PspGI ； 19del内參体系:包括Taq Mix、19del Mix、纯水；19del检测体系:包括Taq Mix、19delMix、热稳定性内切酶MwoI ； Glyl2内參体系:包括Taq Mix、Glyl2 Mix、纯水;Glyl2检测体系:包括Taq Mix、Glyl2Mix、热稳定性内切酶PspGI ； Glyl3内參体系:包括Taq Mix、Glyl3 Mix、纯水;Glyl3检测体系:包括Taq Mix、Glyl3Mix、热稳定性内切酶PhoI ； Val600内參体系包括Taq Mix、Val600 Mix、纯水；Val600检测体系包括Taq Mix、Val600 Mix、热稳定性内切酶TspRI ； Glu545内參体系包括Taq Mix、Glu542 Mix、纯水；Glu545检测体系包括Taq Mix、Glu542 Mix、热稳定性内切酶TspRI ； Glu545内參体系包括Taq Mix、Glu545 Mix、纯水；Glu545检测体系包括Taq Mix、Glu545 Mix、热稳定性内切酶TspRI ； Arg399内參体系包括Taq Mix、Arg399 Mix、纯水；Arg399检测体系包括Taq Mix、Arg399 Mix、热稳定性内切酶PspGI ； b)向a)中的内參体系及检测体系中，加入所述步骤I)中制备的检测样本，以及阳性对照标准品和质控标准品； C)、运行程序， Thr790Met 检测程序95°C 3min ;40 个循环92°C 15sec，60°C 2min 收集荧光；Leu858Arg 检测程序为95°C 3min ;40 个循环92°C 15sec，60°C 35sec 收集荧光，.75 °C 2min ； EGFR基因19号外显子的缺失突变型检测程序为95°C 3min ;40个循环92°C 15sec，.60 °C 2min收集荧光； K-ras Glyl2 位点检测程序95°C 3min ;40 个循环92°C 15sec，55°C 35sec 收集荧光，75。。2min ； K-ras Glyl3 位点检测程序95°C 3min ;40 个循环92°C 15sec，55°C 35sec 收集荧光，75。。2min ； B-raf 基因 Val600 检测程序为95°C 3min ；40 个循环92°C 15sec，60°C 35sec 收集突光，65。。2min ； PI3K 基因 Glu542 位点检测程序为95°C 3min ;40 个循环92°C 15sec，60°C 35sec 收集荧光，65°C 2min ；PI3K 基因 Glu545 位点检测程序为95°C 3min ；92°C 15sec，60°C 35sec 收集荧光，.65 °C 2min ； XRCCl 基因 SNP 位点 Arg399Gln 检测程序为95°C 3min ；92°C 15sec，60°C 35sec 收集突光，75。。2min。
全文摘要
本发明公开了一种检测基因突变(包括点突变、缺失突变、插入突变)和SNP位点的方法和试剂盒，该方法将热稳定性内切酶与Taq酶融合在一个反应体系中，通过在实时荧光定量PCR中对野生型碱基位点进行实时酶切，从而实现对特异性碱基位点的检测。本方法适用于常见的碱基变异类型，包括体细胞点突变、缺失突变、插入突变和遗传性SNP位点分析，从而为临床提供一种简便、快速、准确和经济的基因突变和SNP位点分析方法。
文档编号G01N21/64GK102660641SQ20121011510
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者刘淇, 徐磊, 李雪, 谢飞飞, 赵金银, 陈唯军 申请人:北京宏微特斯生物科技有限公司