专利名称：流感疫苗中的过敏原卵类粘蛋白或卵运铁蛋白定量检测的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫分析技术领域，涉及一种蛋白的检测方法，特别是利用双抗体夹心酶联免疫吸附试验来定量检测流感疫苗中新的过敏原卵类粘蛋白或卵运铁蛋白的方法。
背景技术：
流行性感冒是最具世界流行潜力的疾病，上世纪数次流行性感冒的世界大流行给全球造成巨大损失。自本世纪初以来，世界卫生组织持续发布H5N1禽流感人类病例，特别是世界各地陆续发布疫情的H5N1禽流感以及近年来爆发的新型HINl流感(猪流感)，都有可能造成全球的大流行。流感疫苗是预防流行性感冒发生和流行的最有效方法。目前世界各国生产流感疫苗的主要方式是利用流感病毒流行株在鸡胚胎卵囊腔中培养后，经过灭活处理，再将流感病毒抗原纯化后制备成疫苗。因此疫苗中存在一部分鸡卵残留蛋白，残留蛋白对部分个体可能作为过敏原，可以引起IgE介导的速发型(I型)过敏反应。《中国药典》2010版第三部规定采用酶联免疫法检测，流感疫苗中卵清蛋白含量应不高于500ng/mL。 蛋清中含有多种过敏原，除了卵清蛋白外，还有卵类粘蛋白和卵运铁蛋白等。其中，蛋清中卵清蛋白含量最高，约占蛋清总蛋白的54%。除此之外，卵类粘蛋白约占蛋清总蛋白的11%。卵运铁蛋白约占蛋清总蛋白的12%。值得重视的是，某些个体口服或注射含有卵类粘蛋白和卵运铁蛋白的食物或制剂后会发生严重的过敏反应。由鸡胚尿囊液中培养的流感病毒液所制备的流感疫苗残留有一定量的鸡卵清蛋白，目前国内外对流感病毒疫苗中卵清蛋白有明确的规定，但无卵类粘蛋白和卵运铁蛋白残留量的相关规定。到目如为止，国内外对流感疫苗中存在的卵类粘蛋白或卵运铁蛋白新的过敏原并未充分认识到，更没有流感疫苗中对这两类过敏原含量的规定。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种新的流感疫苗中过敏原卵类粘蛋白或卵运铁蛋白定量检测方法，该方法不仅可以定量检测，而且特异性强、灵敏度高、重复性好、简便易行，非常适合于快速定量检测流感疫苗中卵类粘蛋白和卵运铁蛋白。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案一种流感疫苗中过敏原卵类粘蛋白或卵运铁蛋白定量检测方法，其特征在于，该方法在制备抗卵类粘蛋白或抗卵运铁蛋白单克隆抗体的基础上，经过配对抗体的筛选和建立的双抗体夹心酶联免疫吸附试验，来定量检测流感疫苗中的卵类粘蛋白或卵运铁蛋白。所述的定量检测方法包括抗卵类粘蛋白或抗卵运铁蛋白的单克隆抗体的制备和配对抗体的筛选以及双抗体夹心酶联免疫吸附试验的建立。所述的抗卵类粘蛋白或抗卵运铁蛋白单克隆抗体的制备和配对抗体的筛选方法是将卵类粘蛋白或卵运铁蛋白作为免疫原，采用常规杂交瘤技术得到抗卵类粘蛋白或抗卵运铁蛋白的单克隆抗体，并分别常规标记辣根过氧化物酶，分别将未标记的单克隆抗体作为包被抗体，将标记的单克隆抗体作为酶标抗体，采用阵列法两两配对挑选敏感性最高且特异性最好的配对抗体。所述的双抗体夹心酶联免疫吸附试验的方法是，在96孔板中，顺序加入包被抗体、待测标本和标准品、酶标抗体及底物，于波长410nm测定光吸收值，将上述挑选的最好的一对抗体分别用作包被抗体和酶标抗体来检测卵类粘蛋白或卵运铁蛋白。用5mg/L包被抗体包被96孔板，24小时后用含牛血清白蛋白的缓冲液封闭96孔板，洗涤后加入待测标本(稀释一定倍数的流感病毒感染尿囊液 原液、流感疫苗生产中间产品以及流感疫苗成品)和倍比稀释的卵类粘蛋白或卵运铁蛋白标准品，孵育及洗涤后加入酶标抗体，再次孵育及洗涤后以2，2’ -连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸)底物显色，于波长410nm测定光吸收值，以标准品的光吸收值为纵坐标，相应浓度为横坐标，作标准曲线，根据待测标本的光吸收值，经曲线拟合或换算，得出待测标本中卵类粘蛋白或卵运铁蛋白的浓度。本发明的流感疫苗中的过敏原卵类粘蛋白或卵运铁蛋白定量检测方法，是在单克隆抗体基础上建立的新方法，运用定量检测卵类粘蛋白和卵运铁蛋白双抗体夹心酶联免疫吸附试验，可以快速定量检测卵类粘蛋白或卵运铁蛋白，在国内外首次检测到流感病毒原液中卵类粘蛋白的含量在0. 9 258ng/mL之间，卵运铁蛋白的浓度在2 450ng/mL之间。为提高和控制流感疫苗质量，减少和防止流感病毒疫苗接种后的过敏反应提供重要依据。单克隆抗体是识别单一表位的抗体，所以本发明的特异性强；又因为经过抗体的配对筛选，所以本发明的灵敏度高；本发明是建立在酶联免疫吸附试验的基础上的，如果采取预包被抗体的方案，检测过程只需3小时左右；由于单克隆抗体质量易于控制，检测时各复孔间的光吸收值间误差很小，所以本发明还有简便易行、重复性好的特点。
具体实施例方式按照本发明的技术方案，在制备抗卵类粘蛋白或抗卵运铁蛋白单克隆抗体的基础上，经过配对抗体的筛选和建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验，来定量检测卵类粘蛋白或卵运铁蛋白。抗卵类粘蛋白或抗卵运铁蛋白单克隆抗体的制备是将卵类粘蛋白或卵运铁蛋白作为免疫原，采用常规杂交瘤技术得到抗卵类粘蛋白或抗卵运铁蛋白的单克隆抗体。配对双抗体的筛选方法是将得到的单克隆抗体分别常规标记辣根过氧化物酶，分别将未标记的单克隆抗体作为包被抗体，将标记的单克隆抗体作为酶标抗体，采用阵列法两两配对挑选最好条件的配对抗体，建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验的系统。最好条件的配对抗体的挑选方法是选择敏感性最高，即检测相同浓度的卵类粘蛋白或卵运铁蛋白的光吸收值最高，且特异性高(即检测无关蛋白的光吸收值最低，也即非特异本底最低)的配对抗体。双抗体夹心酶联免疫吸附试验的方法是，在96孔板中，加入5mg/L包被抗体，24小时后用含牛血清白蛋白的缓冲液封闭96孔板，洗涤后加入经稀释的鸡胚尿囊液中提取的流感病毒原液标本和倍比稀释的卵类粘蛋白或卵运铁蛋白标准品，孵育及洗涤后加入酶标抗体，再次孵育及洗涤后以2，2’_连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸)底物显色，于波长410nm测定光吸收值，以卵类粘蛋白或卵运铁蛋白标准品的光吸收值为纵坐标，相应浓度为横坐标，作标准曲线，根据待测标本的光吸收值，经曲线拟合或换算，得出流感疫苗中卵类粘蛋白或卵运铁蛋白的浓度。
以下是发明人给出的实施例实施例I :定量检测流感病毒原液中卵类粘蛋白将卵类粘蛋白作为免疫原，采用常规杂交瘤技术，经细胞融合、筛选及克隆化，共得到8株抗卵类粘蛋白的单克隆抗体，分别命名为FMU-OMl FMU-0M8。经过抗体的配对筛选后，将FMU-0M5单克隆抗体作为包被抗体，而将FMU-0M6单克隆抗体标记辣根过氧化物酶后作为酶标抗体。用PH9. 6,0. 05mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液稀释包被抗体FMU-0M5至5mg/L，加入96孔板，100 U I/孔，保湿，4°C放置24小时。用洗涤缓冲液洗96孔板3次，加入含I %牛血清白蛋白的缓冲液，室温封闭30分钟。洗板3次，加入待测经稀释鸡胚尿囊液中提取的流感病毒原液标本和倍比稀释的卵类粘蛋白标准品，100 u I/孔，37°C孵育I小时。洗板3次，分别加入I : 500稀释的酶标抗体FMU-0M6，IOOiU/孔，37°C孵育I小时。洗板3次，以2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺 酸)底物显色，IOOiU/孔，37°C放置5分钟，于波长410nm测定光吸收值。以标准品的光吸收值为纵坐标，相应浓度为横坐标，作标准曲线，其灵敏度达0. 5ng/mL。根据待测标本的光吸收值，经曲线拟合，得出7批不同流感病毒原液中卵类粘蛋白的含量在0. 9 258ng/mL之间。标准品为Sigma产品，即为已知浓度的用来免疫小鼠的卵类粘蛋白。实施例2 :定量检测流感病毒原液中卵运铁蛋白将卵运铁蛋白作为免疫原，采用常规杂交瘤技术，经细胞融合、筛选及克隆化，分别得到18株抗卵运铁蛋白的单克隆抗体，分别命名为FMU-OTl FMU-0T18。经过抗体的配对筛选后，将FMU-0T12单克隆抗体作为包被抗体，而将FMU-0T6单克隆抗体标记辣根过氧化物酶后作为酶标抗体。用pH9. 6,0. 05mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液稀释包被抗体FMU-OT12至5mg/L，加入96孔板，100 yl /孔，保湿，4°C放置24小时。用洗涤缓冲液洗96孔板3次，加入含1%牛血清白蛋白的缓冲液，室温封闭30分钟。洗板3次，加入待测经稀释鸡胚尿囊液中提取的流感病毒原液标本和倍比稀释的卵运铁蛋白标准品，100 iil/孔，37°C孵育I小时。洗板3次，加入I 500稀释的酶标抗体FMU-0T6，100iil/孔，37°C孵育I小时。洗板3次，以2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸)底物显色，IOOiU/孔，37°C放置5分钟，于波长410nm测定光吸收值。以标准品的光吸收值为纵坐标，相应浓度为横坐标，作标准曲线。根据待测标本的光吸收值，经曲线拟合和分子量换算，得出7批不同流感病毒原液中卵运铁蛋白的浓度在2ng/mL 450ng/mL之间。
权利要求
1.一种流感疫苗中的过敏原卵类粘蛋白或卵运铁蛋白定量检测方法，其特征在于，在制备抗卵类粘蛋白或抗卵运铁蛋白单克隆抗体的基础上，经过配对抗体的筛选和建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验，来定量检测卵类粘蛋白或卵运铁蛋白。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于 所述的抗卵类粘蛋白或抗卵运铁蛋白的制备方法是将卵类粘蛋白或卵运铁蛋白作为免疫原，采用常规杂交瘤技术得到抗卵类粘蛋白或抗卵运铁蛋白的单克隆抗体； 所述的配对双抗体的筛选方法是将得到的抗卵类粘蛋白或抗卵运铁蛋白单克隆抗体分别常规标记辣根过氧化物酶，分别将未标记的单克隆抗体作为包被抗体，将标记的单克隆抗体作为酶标抗体，采用阵列法两两配对，挑选选择敏感性最高，即检测相同浓度的卵类粘蛋白或卵运铁蛋白的光吸收值最高，且特异性高的配对抗体；建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验的系统； 所述的双抗体夹心酶联免疫吸附试验的方法是，在96孔板中，加入5mg/L包被抗体，24小时后用含牛血清白蛋白的缓冲液封闭96孔板，洗涤后加入经稀释的鸡胚尿囊液中提取的流感病毒原液标本和倍比稀释的卵类粘蛋白或卵运铁蛋白标准品，孵育及洗涤后加入酶标抗体，再次孵育及洗涤后以2，2’ -连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸)底物显色，于波长410nm测定光吸收值，以卵类粘蛋白或卵运铁蛋白标准品的光吸收值为纵坐标，相应浓度为横坐标，作标准曲线，根据待测标本的光吸收值，经曲线拟合或换算，得出流感疫苗中卵类粘蛋白或卵运铁蛋白的浓度。
全文摘要
本发明公开了一种流感疫苗中的过敏原卵类粘蛋白或卵运铁蛋白定量检测方法，在制备抗卵类粘蛋白或抗卵运铁蛋白单克隆抗体的基础上，经过配对抗体的筛选，建立的双抗体夹心酶联免疫吸附试验，来定量检测流感疫苗中卵类粘蛋白和卵运铁蛋白。为了减少由鸡胚尿囊腔内纯化制备的流感疫苗中残留卵类粘蛋白或卵运铁蛋白引起的接种人群中过敏反应的发生率，该方法特异性强、灵敏度高、重复性好、简便易行，非常适合疾病控制中快速定量检测流感疫苗或食品中卵类粘蛋白和卵运铁蛋白。
文档编号G01N33/68GK102650640SQ20121012167
公开日2012年8月29日 申请日期2012年4月24日 优先权日2012年4月24日
发明者刘志佳, 刘蓓, 周幸春, 宋朝君, 张宇丝, 张春梅, 张赟, 徐竹蔚, 方亮, 易静, 李永明, 李琦, 杨琨, 金伯泉, 陈丽华, 马樱 申请人:中国人民解放军第四军医大学