专利名称：一种快速定量检测肌钙蛋白t的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法
技术领域：
本发明属于医学检验领域，具体涉及ー种快速定量检测肌钙蛋白T(cTnT)的免疫荧光试纸条以及其制备与应用。
背景技术：
冠心病已成为影响人群健康的主要疾病。急性心肌梗死则是造成冠心病人死亡的主要原因。如何及时地发现急性心肌梗死病人及其相应的治疗是挽救心肌梗死病人生命的关键所在。传统的诊断主要是根据典型的临床表现，心电图的改变及实验室酶学检查。但相当一部分心肌梗死病人临床表现不明显，早期心电图无明显改变。在这种情况下，心肌损伤特异性标志物的应用对心肌梗死的早期确诊就起到了关键的作用。肌钙蛋白T(Cardiactroponin T，cTnT)是ー重要的心肌组织损伤特异性标识物，临床用于急性心肌梗死及其它心肌损伤性疾病的诊断。肌钙蛋白是横纹肌的结构蛋白，由Tnl、TnT和TNC三种亚单位组成。TnT是与原肌球蛋白结合的亚单位，Tnl是肌原纤维ATP酶的抑制性亚单位，TNC是钙离子结合亚単位。这三种亚单位与原肌球蛋白一起构成肌凝蛋白(Tm)-肌钙蛋白(Tn)复合体。在钙离子的诱导下，调节肌肉收缩和舒张的力量和速度。骨骼肌与心肌中的TnT和TnI是由不同的基因编码的，导致其氨基酸组成序列的差异，因此可以用免疫学的方法加以区分。TNC在骨船肌和心肌中则是相同的。cTnT是仅存在于心肌细胞中的特异性调节蛋白，分两种形式存在游离形式存在于细胞胞浆中，占6% 8% ;结合形式存在于心肌收缩单位中肌纤维的细肌丝上，占92% 94%。当出现可逆性心肌缺血，心肌细胞尚未坏死，但细胞膜受到损伤，胞浆中的cTnT可短暂释放入血；当发生不可逆性心肌缺血，心肌细胞坏死，细肌丝降解，可导致结合池cTnT释放入血。因此不稳定型心绞痛(UAP)患者血液中cTnT仅短暂轻度升高随后恢复正常；而AMI患者血中cTnT可显著升高且维持较长时间。cTnT在心肌损伤后2 8小时释放入血，12 24小时达高峰，在血中可维持14天左右，所以它的最大有效诊断窗ロ宽至2小时 14天。在心肌损伤后,cTnT较cTnl更早释放入血,更易被检测到,血中浓度更高，对检测心肌损伤的价值也就可能更高。cTnT仅存在于心肌细胞中，可用免疫酶标定量法测得，对心肌损伤的诊断具高度敏感和特异性。虽然早期的測定方法不成熟，使cTnT与骨骼肌TnT有微量交叉反应，采用心脏特异和非心脏特异两种抗体测定cTnT，发现cTnT与骨骼肌TnT有1% 2%的交叉反应。检测方法改进后，采用两种均为心脏特异的单克隆抗体作为检测抗体测定cTnT时，与骨骼肌TnT的交叉反应阳性率< O. 5%。对75名无心脏病的骨骼肌损伤患者(其中33名Duchenne病，42名运动员马拉松长跑后)用第二代检测方法检测cTnT，未发现I例假阳性反应。另据Rottbauer报道，用同样的方法检测横纹肌溶解症患者或健康人马拉松长跑后，虽然他们的CK可升至正常高限的300倍，却检测不到cTnT，另I 例因こ醇中毒导致严重骨骼肌损伤的患者，虽CK达35000IU/L(正常高限是200IU/L)，而cTnT却阴性。自1991年首次发表cTnT有诊断AMI价值的文章以来，全世界已经有十多个大型临床试验证实其对AMI有重要的诊断价值。Katus等人最早报道了 cTnT对诊断AMI是高度敏感和特异的。他们选取387例因胸痛而怀疑AMI的患者测定cTnT，发现所有AMI患者cTnT均升高(> O. lng/ml)，胸痛发作24小时内cTnT诊断AMI的敏感性和特异性分别为99%和93%，第2天敏感性和特异性均为100%，因cTnT的升高在血清中持续时间较长，故到第6天仍均达100%;而头24小时内CK和CK-MB的敏感性分别为99%和98%，特异性分别为75%和92%。cTnT的价值优于CK、CK-MB，在AMI后，cTnT升高幅度是CK-MB升高幅度的5倍，诊断AMI的绝对敏感窗(以症状发作后时间计)在cTnT也远较CK和CK-MB宽，cTnT为10. 5 140小时，CK和CK-MB为9 31小时。cTnT诊断AMI的价值优于CK,CK-MB的可能原因有(I)心肌中cTnT的含量较高，每克心室肌(湿重)含10-8mg的cTnT，cTnT总量中的6% 8%存在于胞浆中，而这胞浆中的cTnT量已经相当于心肌中CK的总量，所以cTnT在AMI后的升高幅度要远高于CK(cTnT可达30 40倍，而CK仅升高9倍)。(2) cTnT在心肌损伤后释放入血也较CK要早，它最早可在症状发作后I小时在血中检出，3 4小时其敏感性可达50%。(3)其在血中持续升高的时间较长。cTnT大部分(94%)以结合形式存在于心肌细胞收缩单位中，它从细肌丝的肌钙蛋白复合物中分离出来的过程是ー个消耗时间的过程，且此过程不断进行，因此虽然cTnT在血浆中的半衰期只有120分钟，但却可在血中持续升高达2周左右。在10. 5 140小时的绝对敏感诊断窗中，100%的AMI患者cTnT均升高，敏感性是CK的6倍。cTnT的测定始于20世纪90年代初，多采用双抗体竞争放射免疫法和竞争性ELISA測定法。有研究者将金标记或硒标记单克隆抗体与免疫层析技术相结合，用纸条法半定量床边检测cTnT浓度，最低检测值为O. I μ g/L。目前cTnT的检测多采用化学发光法，用化学发光物质标记后作为检测抗体，大大提高了測定的精确性和敏感性，但需要昂贵的检测设备。目前的床旁检测方法(胶体金试纸法)，不能满足临床诊断准确定量的要求，无法对AMI的病程起到很好的疗效监测作用。因此，建立ー种检测时间尽量缩短，并且检测除了能在实验室进行外，还要求能够进行床旁检测，同时能定量測定cTnT的检测方法，从而为临床提供准确的诊断依据，是十分必要的。申请号200610130403. 3公开了ー种化学免疫分析检测心肌钙蛋白T的方法，主要是用辣根过氧化物酶促化学发光体系，采用双单抗夹心法和/或竞争法检测，该方法需要将样品和与酶的复合物(固化与固相载体上)置于在反应池内，再经过洗涤后加入酶的底物、氧化剂以及增强剂便可发光，这种方法的过程复杂，且耗时长。
发明内容
为克服现有cTnT检测技术的不足，本发明提供ー种快速检测cTnT的试纸条组件，以及由该试纸条组件制成的检测卡。本发明根据免疫荧光技术特点和cTnT抗原抗体系统特点，设计新的原材料，试剂和エ艺流程，应用本发明提供的试纸条检测cTnT水平，具有简单，快速，灵敏和特异性好等特点，可同时定量检测高值和低值样品，并且性价比高，适用于临床快速检测。本发明提供的快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条的检测反应原理为固相双抗体夹心法的免疫荧光层析法。待测样品与适当比例的荧光标记抗体在液相均质介质中充分混和均匀，在此过程中样品中的cTnT能专ー性地与荧光标记抗cTnT抗体充分结合，然后再转加到检测卡上，流经检测卡中的硝酸纤维膜(NC膜)时，其中所含的、已反应结合在一起的cTnT-抗cTnT荧光抗体复合物能为膜上检测线上固定的抗cTnT的另ー个抗体特异性捕获，所发出的荧光可用专用仪器定量測定，荧光强度与样品中cTnT浓度成正比。本发明采用如下技术方案ー种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的钼卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬、依次接合在底衬上的吸水垫、包被分析膜及样品垫，该包被分析膜上设有检测线和质控线，检测线包被的特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体，质控线包被的特异抗体为兔IgG抗体；钼卟啉标记特异抗体为抗肌I丐蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体。优选地，所述底衬一面涂覆黏胶或双面胶，用以固定所述的吸水垫、包被分析膜及 样品垫，其中，硝酸纤维膜粘附在所述底衬的中间，两端分别与所述吸水垫和样品垫连接。优选地，所述吸水垫为ー种滤纸，为吸水纸或滤油纸；所述吸水垫粘附在所述底衬上，同时吸水垫与硝酸纤维膜重叠l_2mm连接。优选地，所述包被分析膜为硝酸纤维膜，且在所述包被分析膜上喷涂抗肌钙蛋白T单克隆抗体和兔IgG抗体。优选地，所述样品垫为玻璃纤维膜，且用含O. 01% -O. 5% PEG聚こニ醇、I % ~5%牛血清白蛋白、O. 01% -O. 05%表面活性剂的O. 04M磷酸盐缓冲液浸泡处理过，其中，磷酸盐缓冲液PH为7. 2，浸泡处理后，放置在25-40°C温度下干燥过夜，所述样品垫与硝酸纤维膜重叠l_2mm连接。优选地，所述的独立包装的钼卟啉标记特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体，并分别用含有如下组分的O. 02M磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得O. 01% -O. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、O. 01% -O. 05%表面活性齐 。优选地，所述独立包装的钼卟啉标记的激发光光源范围为390_420nm，发射光波长范围为 600nm-700nm。一种制备上述定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件的方法，包括以下步骤I)抗体的制备选用纯化的基因工程表达的抗肌钙蛋白T单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG ；2)包被分析膜的制备采用喷膜机分别在ー硝酸纤维膜上画检测线和质控线，划线细致均匀，检测线与质控线间隔5mm ；用检测线包被缓冲液稀释抗肌钙蛋白T单克隆抗体至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将抗肌钙蛋白T单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线上；用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG抗体至浓度为10_20ug/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG抗体对应喷印在硝酸纤维膜的质控线上；
将喷膜后的硝酸纤维膜放入25_40°C的真空干燥箱内，干燥后取出密封备用；3)样品垫的制备将玻璃纤维膜用含O. 01 % -O. 5 %聚こニ醇、I % -5 %牛血清白蛋白、O. 01% -O. 05%表面活性剂的O. 04M磷酸盐缓冲液浸泡，放入30-50°C的真空干燥箱内，干燥后即成样品垫，取出密封备用；4)钼卟啉标记特异抗体的制备将肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用O. IM碳酸氢钠溶液稀释至Img/ml,分别加入30-50mg钼卩卜啉溶解液,搅勻，室温孵育I小时，姆隔15分钟混勻一次,最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的钼卟啉标记抗体，用O. 02M磷酸盐缓冲液稀释混匀后于4 C保存；5)免疫荧光试纸条的制备 先将包被分析膜粘附在底衬中间位置上，在包被分析膜一端粘附吸水垫，二者重叠l_2mm ;在包被分析膜另一端粘附样品垫，二者重叠l_2mm ;再将黏贴好包被分析膜、吸水垫和样品垫的底衬裁切成细条；，即成ー种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸。优选地，所述检测线包被缓冲液为含有O. 8-1 %的甲醇、1-1. 5%海藻糖或者蔗糖、抗肌钙蛋白T单克隆抗体lmg/ml的50mM pH值为7. 6的磷酸盐缓冲液或三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液。优选地，所述质控线包被缓冲液为含O. 7-1 %的甲醇、O. 5-0. 8%的牛血清白蛋白、兔IgG抗体O. 5mg/ml50mM的pH值为7. 6磷酸盐缓冲液。应用上述快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条的免疫荧光检测卡组件，所述检测卡组件包括试纸条组件、用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的盖板和用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的背板组成的卡盒，所述背板包括放置所述试纸条的卡槽和用干与所述盖板结合的卡齿，所述盖板包括可观测检测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔和用干与所述背板的卡齿结合的固定孔，所述试纸条通过所述卡齿与所述固定孔结合而嵌合在所述背板和所述盖板之间，其中，所述包被硝酸纤维膜正对所述检测窗，所述样品垫正对所述加样孔；另外，独立包装的钼卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。制备上述快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件的方法，包括以下步骤I)背板和盖板的制备用聚苯こ烯或聚氯こ烯等塑料材质制成背板和盖板，所述背板包括放置所述试纸条组件的卡槽和用干与所述盖板结合的卡齿，所述盖板包括可测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔以及用干与所述背板的卡齿结合的固定孔；2)组装将试纸条放在所述背板的所述卡槽内，通过所述背板的卡齿与所述盖板的固定孔结合，将试纸条嵌合在背板和盖板之间，其中，包被分析膜正对所述检测窗，样品垫正对所述加样孔；3)包装将I人份的检测卡与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备I瓶独立包装的钼卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的钼卟啉标记特异抗体装入一个包装盒，在2°C _8°C环境下避光不冻存的进行保存。本发明的有益效果本发明采用免疫荧光快速检测技术，利用荧光的高灵敏特点，且样品与荧光标记抗体在试剂瓶内反应后再加入检测卡。由于样品与荧光标记抗体在液相中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高反应灵敏度，同时增加了样品的稀释倍数，去除了样品的基质效应，使定量结果有很好的可重复性，而且此方法省略了直接加样步骤，提高了定量结果的精密度和准确度，可满足同时检测高值和低值的临床诊断要求。应用本发明提供的试纸条检测人体内cTnT水平，成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，只需要配套专用荧光检测仪，因此可广泛应用于各级医疗检验场所，尤其是基层医疗机构，包括乡镇卫生院等均可开展。本发明对于心脑血管事件发生的预防有极为重要的意义。
图I为本发明的试纸条的结构示意图；图2为本发明的检测卡结构示意图；图3是钼卟啉发光材料的发射光谱曲线；图4为本发明的反应方式示意图；图5为本发明的检测结果示意图；图6为本发明的肌钙蛋白T检测标准工作曲线。附图标记1 :底衬；2 :吸水塾；3 :包被分析I旲；4 :检测线；5 :质控线；6 :样品塾；7 :加样孔；8 :检测窗；9 :项目名称；10 :固定孔；11 :盖板；12 :卡槽；13 :背板；14 :卡齿；15 :怕B卜琳标记抗体；16 :肌韩蛋白T ； 17 :检测线抗肌韩蛋白T单克隆抗体；18 :质控线兔IgG抗体。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进ー步说明，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。实施例一參照附图I，ー种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的钼卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬I、依次接合在底衬I上的吸水垫2、包被分析膜3及样品垫6，该包被分析膜上3设有检测线4和质控线5，检测线4包被的特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体，质控线5包被的特异抗体为兔IgG抗体；钼卟啉标记特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体。其中，底衬I 一面涂覆黏胶或双面胶，用以固定吸水垫2、包被分析膜3及样品垫6，其中，包被分析膜3附在底衬I的中间，两端分别与吸水垫2和样品垫6连接。吸水垫2为ー种滤纸，为吸水纸或滤油纸；吸水垫2粘附在底衬I上，同时吸水垫2与包被分析膜3重叠1-2_连接。包被分析膜3为硝酸纤维膜。样品垫6为玻璃纤维膜，且用含O. 01% -O. 5% PEG (聚こニ醇)、I % _5 %牛血清白蛋白、O. 01% -O. 05%表面活性剂的O. 04M磷酸盐缓冲液浸泡处理过，其中，磷酸盐缓冲液PH为7. 2，浸泡处理后，放置在25-40°C温度下干燥过夜，样品垫6与硝酸纤维膜3重叠I-2mm连接。独立包装的钼卟啉标记特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体，并分别用含有如下组分的O. 02M磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得0. 01%-O. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、O. 01% -O. 05%表面活性剤。制备上述定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件的方法，包括以下步骤I)抗体的制备选用纯化的基因工程表达的抗肌钙蛋白T单克隆抗体和纯化的兔IgG。2)包被分析膜3的制备
取硝酸纤维膜，调试BIO-DOT喷膜机，膜液量为25ul/35cm，机器划线，检测线与质控线间隔5mm，划线细致均匀；用检测线包被缓冲液稀释抗肌钙蛋白T单克隆抗体至浓度为10-20ug/ml，采用BIO-DOT喷膜机将抗肌钙蛋白T单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线上；其中检测线包被缓冲液的制备50mM pH7. 6PBS缓冲液，含甲醇I %、海藻糖I %、牛血清白蛋白O. 5%、ICll抗体lmg/ml ο用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG至浓度为10_20ug/ml，采用BIO-DOT喷膜机将纯化的兔IgG分别对应喷印在硝酸纤维膜的和质控线上；其中质控线包被缓冲液的制备50mM pH7. 6PB缓冲液，含甲醇I %、牛血清白蛋白O. 8%、兔 IgG 抗体 O. 5mg/ml。将喷印好的硝酸纤维膜放置25°C _37°C真空干燥箱处理I小时，装袋密封备用。3)样品垫6的制备将玻璃纤维膜用含O. 2% PEG、2. 5%牛血清白蛋白、O. 03%表面活性剂的O. 04M磷酸盐缓冲液浸泡，放入30-50°C的真空干燥箱内，干燥3小时后，即成样品垫6，取出密封备用；4)钼卟啉标记特异抗体的制备将抗cTnT单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用O. IM碳酸氢钠溶液稀释至Img/ml，各取5ml抗体溶液，分别加入30mg钼卟啉钼卟啉溶解液，搅匀，室温孵育I小时，每隔15分钟混匀一次。最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的钼卟啉标记抗体，用含O. 01% -O. 5% PEGU % -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、O. 01% -O. 05%表面活性剂的O. 02M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装，于4°C保存。5)免疫荧光试纸条的制备先将包被分析膜粘附在底衬I中间位置上，在包被分析膜3 —端粘附吸水垫2，ニ者重叠l-2mm ;在包被分析膜3另一端粘附样品垫6，二者重叠l_2mm ;再将黏贴好包被分析膜3、吸水垫2和样品垫6的底衬I裁切成细条；即成ー种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫突光试纸。參照附图2，一种应用上述快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条的免疫荧光检测卡组件，包括试纸条组件、用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的盖板11和用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的背板13组成的卡盒，背板13包括放置试纸条的卡槽12和用于与盖板11结合的卡齿14，盖板11包括可观测检测结果的检测窗8、可滴加样品的加样孔7和用干与背板的卡齿14结合的固定孔10,试纸条通过卡齿14与固定孔10结合而嵌合在背板13和盖板11之间，其中，包被硝酸纤维膜3正对检测窗8，样品垫6正对加样孔7 ;另外，独立包装的钼卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。制备上述快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件的方法，其特征在于包括以下步骤I)制成背板13和盖板11 用聚苯こ烯或聚氯こ烯等塑料材质制成背板13和盖板11，背板13包括放置所述试纸条组件的卡槽12和用于与盖板11结合的卡齿14，盖板11包括可测结果的检测窗8、可滴加样品的加样孔7以及用干与背板的卡齿14结合的固定孔10 ；2)组装 将试纸条放在背板13的卡槽12内，通过背板13的卡齿14与盖板11的固定孔10结合，将试纸条嵌合在背板13和盖板11之间，其中，包被分析膜3正对检测窗8，样品垫6正对加样孔7 ；3)包装将I人份的检测卡与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备I瓶独立包装的钼卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的钼卟啉标记特异抗体装入一个包装盒，在2°C _8°C环境下避光不冻存的进行保存。本发明的检测原理參照附图3，对钼卟啉发光材料的发射光谱曲线进行分析，发现钼卟啉所具有的特征光谱的激发光光源范围为390_420nm,发射光波长范围为600_700nm。由于钼B卜啉发光标记物的特点，使得以其作为标记物的免疫荧光试纸条可与仪器结合，使得基于钼卟啉发光技术的免疫层析试纸条可进行灵敏度极高的多重分析、且对目标被检测物进行灵敏度极高的精确定量检测。另外，本发明的快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条及检测卡，利用荧光的高灵敏特点，使待测样品与钼卟啉标记先在试剂瓶内反应，由于待测样品与钼卟啉标记在液相中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高反应灵敏度，同时增加了待测样品的稀释倍数，去除了待测样品的基质效应，使定量结果有很好的可重复性；而且钼卟啉标记上的特异抗体与待测样品充分结合形成ー复合物，然后将复合物转加到检测卡的加样孔7的样品垫6上，实现钼卟啉发光材料与免疫层析技术相结合从而检测人体内肌钙蛋白T水平。如图4所示，当复合物加到检测卡的加样孔7的样品垫6上后，在吸水垫2的吸カ下钼卟啉标记抗体15流经到检测卡中的包被分析膜3上，如果该复合物具有肌钙蛋白T，其能被检测线4上的肌钙蛋白T单克隆抗体17捕获，在緑色光照射下以红外光光信号的形式表现出来，所发出的荧光可用专用仪器定量測定，荧光强度与样品中肌钙蛋白T的浓度成正比。如果复合物中肌钙蛋白T低于最低检测标准，则检测线4不会发出荧光。另外，參阅图5的a、b、c所示，试纸条有效的情况下，检测线4上的抗肌钙蛋白T单克隆抗体17与质控线5上的兔IgG抗体18均会与复合物反应发出荧光，即检测线4与质控线5均发光，试纸条检测结果呈 阳性；只有质控线5发光，试纸条检测结果呈阴性；两条线均未发光，试纸条检测结果无效。标准工作曲线的绘制
首先，将提纯的肌钙蛋白T标准品用I : 10稀释的正常人血清(采用pH7.20.02MPB缓冲液稀释)作为稀释液配制系列浓度标准品，浓度为Ong/ml、IOng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份样品。其次，姆个样品分别用10个肌I丐蛋白T试纸条检测10次，10次检测仪器判读的样品检测T值和对照C值分别取平均值，最終根据二者的比值得出每个浓度对应的T/C结果，列于表I。表I、不同浓度下的T/C值
权利要求
1.ー种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，其特征在于 包括试纸条和与试纸条配合使用且独立包装的钼卟啉标记特异抗体，试纸条包括底衬(I)、依次接合在底衬(I)上的吸水垫(2)、包被分析膜(3)及样品垫(6)，该包被分析膜上(3)设有检测线(4)和质控线(5)，检测线(4)包被的特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体，质控线(5)包被的特异抗体为兔IgG抗体；钼卟啉标记特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体。
2.根据权利要求I所述快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，其特征在于所述底衬(I) 一面涂覆黏胶或双面胶，用以固定所述的吸水垫(2)、包被分析膜(3)及样品垫(6)，其中，包被分析膜(3)粘附在所述底衬(I)的中间，两端分别与所述吸水垫(2)和样品垫(6)连接。
3.根据权利要求I或2所述快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，其特征在于所述吸水垫(2)为ー种滤纸，为吸水纸或滤油纸；所述吸水垫(2)粘附在所述底衬(I)上，同时吸水垫(2)与包被分析膜(3)重叠l-2mm连接。
4.根据权利要求I或2所述的ー种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条，其特征在于包被分析膜(3)为硝酸纤维膜，且在包被分析膜(3)上喷涂抗肌钙蛋白T单克隆抗体和兔IgG抗体。
5.根据权利要求I或2所述的快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，其特征在于所述样品垫(6)为玻璃纤维膜，且用含O. 01%-0. 5%PEG聚こニ醇、1%-5%牛血清白蛋白、O. 01%-0. 05%表面活性剂的O. 04M磷酸盐缓冲液浸泡处理过，其中，磷酸盐缓冲液PH为7.2，浸泡处理后，放置在25-40°C温度下干燥，所述样品垫(6)与包被分析膜(3)重叠l_2mm连接。
6.根据权利要求I所述的快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，其特征在于所述的独立包装的钼卟啉标记特异抗体为抗肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体，并分别用含有如下组分的O. 02M磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得0. 01%-0. 5%聚乙ニ醇、1%-5%牛血清白蛋白、5%-20%甘油、O. 01%-0. 05%表面活性剤。
7.根据权利要求I所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件，其特征在于所述独立包装的钼卟啉标记的激发光波长范围为390-420nm，发射光波长范围为600nm-700nmo
8.ー种制备权利要求I所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)抗体的制备 选用纯化的基因工程表达的抗肌钙蛋白T单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG ； 2)包被分析膜(3)的制备 采用喷膜机分别在ー硝酸纤维膜上画检测线(4)和质控线(5)，划线细致均匀，检测线(4)与质控线(5)间隔5mm； 用检测线包被缓冲液稀释抗肌钙蛋白T单克隆抗体至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将抗肌钙蛋白T单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线(4)上； 用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔IgG抗体至浓度为10-20ug/ml，采用喷膜机将纯化的兔IgG抗体对应喷印在硝酸纤维膜的质控线(5)上；将喷膜后的硝酸纤维膜放入25-40°C的真空干燥箱内，干燥后取出密封备用； 3)样品垫(6)的制备 将玻璃纤维膜用含O. 01%-0. 5%聚こニ醇、1%-5%牛血清白蛋白、O. 01%-0. 05%表面活性剂的O. 04M磷酸盐缓冲液浸泡，放入30-50 V的真空干燥箱内，干燥后即成样品垫(6 )，取出密封备用； 4)钼卟啉标记特异抗体的制备 将肌钙蛋白T单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用O. IM碳酸氢钠溶液稀释至lmg/ml，分别加入30-50mg的钼卟啉溶解液，搅匀，室温孵育I小时，每隔15分钟混匀一次，最后用G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的钼卟啉标记抗体，用O. 02M磷酸盐缓冲液稀释混匀后于4 C保存； 5)免疫荧光试纸条的制备 先将包被分析膜粘附在底衬(I)中间位置上，在包被分析膜(3) —端粘附吸水垫(2)，二者重叠1_2_ ;在包被分析膜(3)另一端粘附样品垫(6)，二者重叠1-2_ ;再将黏贴好包被分析膜(3)、吸水垫(2)和样品垫(6)的底衬(I)裁切成细条，即成ー种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸。
9.根据权利要求8所述的ー种制备权利要求I所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条的方法，其特征在于，所述检测线包被缓冲液为含有O. 8-1%的甲醇、1-1. 5%海藻糖或者蔗糖、抗肌钙蛋白T单克隆抗体lmg/ml的50mM pH值为7. 6的磷酸盐缓冲液或三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液。
10.根据权利要求8所述的ー种制备权利要求I所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条的方法，其特征在于，所述检测线包被缓冲液为含甲醇O. 8%、蔗糖I. 5%、牛血清白蛋白O. 6%、抗肌钙蛋白T单克隆抗体lmg/ml的20mM pH值为7. 6的三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液。
11.根据权利要求8所述的ー种制备权利要求I所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条的方法，其特征在于，所述检测线包被缓冲液为含含甲醇1%、海藻糖1%、牛血清白蛋白O. 5%、抗肌钙蛋白T单克隆抗体lmg/ml的20mM pH值为7. 6的磷酸盐缓冲液。
12.根据权利要求8所述的ー种制备权利要求I所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条的方法，其特征在于，所述质控线包被缓冲液为含O. 7-1%的甲醇、O. 5-0. 8%的牛血清白蛋白、兔IgG抗体O. 5mg/ml50mM的pH值为7. 6磷酸盐缓冲液。
13.根据权利要求8所述的ー种制备权利要求I所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条的方法，其特征在于，所述质控线包被缓冲液为含甲醇1%、牛血清白蛋白O. 8%、兔IgG抗体O. 5mg/ml的50mM pH值为7. 6磷酸盐缓冲液。
14.根据权利要求8所述的ー种制备权利要求I所述的定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条的方法，其特征在于，所述质控线包被缓冲液为含甲醇O. 7%、牛血清白蛋白O. 5%、兔IgGO. 5mg/ml的50mM pH值7. 6的磷酸盐缓冲液。
15.ー种应用权利要求I所述的快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条的免疫荧光检测卡组件，其特征在于所述检测卡组件包括试纸条组件、用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的盖板(11)和用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的背板(13)组成的卡盒，所述背板(13)包括放置所述试纸条的卡槽(12)和用干与所述盖板(11)结合的卡齿(14)，所述盖板(11)包括可观测检测结果的检测窗(8)、可滴加样品的加样孔(7)和用干与所述背板的卡齿(14)结合的固定孔(10)，所述试纸条通过所述卡齿(14)与所述固定孔(10)结合而嵌合在所述背板(13)和所述盖板(11)之间，其中，所述包被分析膜(3)正对所述检测窗(8)，所述样品垫(6)正对所述加样孔(7 );另外，独立包装的钼卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。
16.权利要求15所述的快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件的制备方法，其特征在于包括以下步骤 1)制成背板(13)和盖板(11) 用聚苯こ烯或聚氯こ烯等塑料材质制成背板(13)和盖板(11)，所述背板(13)包括放置所述试纸条组件的卡槽(12)和用干与所述盖板(11)结合的卡齿(14)，所述盖板(11)包括可测结果的检测窗(8)、可滴加样品的加样孔(7)以及用干与所述背板的卡齿(14)结合的固定孔(10)； 2)组装: 将试纸条放在所述背板(13)的所述卡槽(12)内，通过所述背板(13)的卡齿(14)与所述盖板(11)的固定孔(10)结合，将试纸条嵌合在背板(13)和盖板(11)之间，其中，包被分析膜(3)正对所述检测窗(8)，样品垫(6)正对所述加样孔(7)； 3)包装 将I人份的检测卡与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备I瓶独立包装的钼卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的钼卟啉标记特异抗体装入ー个包装盒，在2°C _8°C环境下避光不冻存的进行保存。
全文摘要
本发明公开了一种快速定量检测肌钙蛋白T的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡，纸条组件包括了试纸条和独立包装的铂卟啉标记特异抗体，该试纸条包括了底衬，粘附于底衬上的包被分析膜、粘附于底衬上且与硝酸纤维膜的其中一端接合的样品垫和粘附于底衬上且与硝酸纤维膜的另一端接合的吸水垫，包被分析膜上设有检测线和质控线；所述检测线包被抗肌钙蛋白T单克隆抗体，质控线包被兔IgG抗体，检测卡则将一卡盒和试纸条组件结合即可，应用本发明所提供的试纸条以及检测卡检测人血液、血清或血浆中肌钙蛋白T，操作简单、快速、灵敏和特异性好等特点，具有良好的临床应用前景。
文档编号G01N33/558GK102692508SQ201210133789
公开日2012年9月26日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者李必松, 梁万兴, 罗琪, 谢爱武 申请人:广州鸿琪光学仪器科技有限公司