专利名称：一种梯度凝胶电泳检测运铁蛋白遗传多态性的方法
技术领域：
用水平板聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳检测运铁蛋白多态性的方法，涉及使用梯度电泳技术克服单一凝胶电泳方法检测的缺陷来分析绵羊运铁蛋白的遗传多态性。
背景技术：
血清运铁蛋白是一种分子量为75000_80000kDa的铁结合糖蛋白，电泳区带位于球蛋白，主要功能是将铁运输到骨髓或组织贮存器官。在动物血浆中的功能是将铁离子
从肠道运送到机体一定部位去合成重要的运氧工具，还能结合Cu、Mn、Zn及Co等在机体生长发育和代谢中起重要作用的微量元素，因此是细胞生长和分化所必须的因子。1958年， Ashton首次在英国绵羊血清中发现了 TF多态性，随后各国学者又对其他品种绵羊的TF多态性进行了广泛的研究。前人对此研究较多采用淀粉凝胶电泳来分离蛋白酶，此方法存在着分辨率较低、 有可能低估了遗传变异水平等缺点(孙伟.中亚以东南不同生态型绵羊品种群体遗传学的研究[D ].扬州扬州大学，2006 )。目前研究绵羊TF多态性大多通常采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳。张才俊(1994)采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳对100头青海黄牛的血清运铁蛋白多态性进行了研究，发现青海黄牛血清运铁蛋白位点存在6个等位基因，共构成13个基因型(张才骏.青海黄牛血清运铁蛋白多态性研究[J]，青海畜牧兽医杂志， 1994，24 (6):9-11)。刘艳芬(2002)利用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳对雷州山羊血液运铁蛋白多态性进行了研究，共发现3个等位基因，4种基因型(刘艳芬，赵云涛，严启涛等.雷州山羊血液运铁蛋白多态性研究[J]，中国草食动物，2003，5:11-13)。信金伟(2009)采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳方法对欧拉型藏绵羊的74份血样进行了血清运铁蛋白多态性的研究，发现被检欧拉型藏绵羊的血清TF位点上检测出5个复等位基因，9种基因型，为高原土著品种的基因储备积累基础试验资料(信金伟.欧拉型藏绵羊血清运铁蛋白多态性的研究[J]，中国畜牧兽医，2010，37 (4) :118-120)。田海宁(2011)为探讨青海小尾寒羊血清运铁蛋白不同表型的优势程度，采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳对引入青海省的89只小尾寒羊运铁蛋白多态性进行研究，在被检测的小尾寒羊运铁蛋白位点上共检测出16种基因型，受7个等位基因控制，表明引入青海小尾寒羊TF显示出丰富的生物多样性和高度的遗传变异性(田海宁.青海小尾寒羊血清运铁蛋白多态性研究[J]安徽农业科学，2011，39
(7):4022-4023)。海思源、杨虎林、陈增国等(2010)利用聚丙烯酰胺垂直板电泳测定了四川省阿贝县草地藏系绵羊红原羊类群、贾洛羊类群及青海欧拉羊血清运铁蛋白的多态性，对其遗传特征进行了比较研究，结果显示红原羊运铁蛋白有3种基因型，贾洛羊只有一种基因型(海思源、杨虎林、陈增国等.3个藏系绵羊品种血清运铁蛋白的多态性比较[J]，四川畜牧兽医，2010，4:30-32)。范玉霞(2008)采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法对82份青海互助本地山羊血清运铁蛋白进行了电泳分析，结果发现被检山羊血清共有3种基因型，为了解青海互助本地山羊的TF特征，为该品种的基因储备积累实验材料(范玉霞.青海互助本地山羊血清运铁蛋白和血红蛋白的电泳分析[J]，四川畜牧兽医，2008, 7 (213) 30-32 )。
聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳常采用均一浓度凝胶，根据蛋白质分子量的大小确定凝胶浓度，其工艺简单操作方便，但由于凝胶浓度单一，运铁蛋白在电泳过程中仍然不能得到很好的分型，效率相对而言仍较低，此外实验过程中胶板有时候会发热，且垂直板电泳过程为60V，lh、120V，2h，需耗费大量的时间。目前尚没有利用水平板聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳检测运铁蛋白多态性的报道，本发明旨在提供一种新的、高效、简便、快捷的检测运铁蛋白遗传多态性检测方法，为保护和合理利用本地绵羊品种资源提供可借鉴的遗传资料。
发明内容
本发明的目的在于针对现有研究方法存在的问题，为深入了解绵羊运铁蛋白的遗传多样性，本发明所采用的水平板聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳技术则克服了上述不足。本发明从水平板顶端到底端分别注入不同浓度的凝胶，形成梯度；在凝胶顶部孔径较大，在凝胶的底部孔径较小，运铁蛋白在梯度凝胶中分型清晰，效率高，且制胶过程简单，先采用电压为380V预电泳10-15分钟，然后采用740V电泳5_6个小时即可。
本发明所述的聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳检测运铁蛋白遗传多态性的方法，是采用水平板聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳检测运铁蛋白多态性，所述的水平板聚丙烯酰胺梯度凝胶，从顶部到底部凝胶浓度分别为12%、8%、6% ;电泳条件为380V。为了降低电泳过程中胶板的温度，保证实验的顺利进行；还可以对水平板进行冰水循环冷却(保持4°C )。为达到此目的，可在电泳设备上设置冰水循环系统以有效降低实验过程中胶板的温度。本发明方法的步骤包括采取绵羊非抗凝血备用，采用水平梯度电泳法对血清TF进行电泳分析，此过程包括凝胶的制备、电极缓冲液的配制、制胶、染色等步骤，对血清TF进行多态性分析。该方法的具体操作采集绵羊非抗凝血，使其自然凝固，以3000r/min离心IOmin,分离出血清，将上清液置于灭菌干净的青霉素小瓶中并编号。用水清洗玻璃板、晾干，将垫片放在玻璃板上，用洗涤液擦洗带有胶带纸的那块平板的无胶带纸的那个平面，将两块玻璃平板放在一起，用夹子将周围固定。用针筒向玻璃平板中分别加入12%、6%、8%的胶，待胶面水平凝固后，倒出正丁醇，取走垫条及玻璃平板，在剩余平板的胶面上放置保鲜膜，防止胶变干，在胶板下垫一块划一条直线的白纸上，使胶下边缘离直线大约5. 5cm，将待测的各血浆样品瓶打开，取单层小纸片(2mm*6mm)，沾少许血衆，用卷纸吸取多余血衆，放在线的下面并注意在适当的位置放上标准样品。加样后将胶板放在水平循环装置的平板上，倒入电极缓冲液，使棉布搭在胶面上，棉布紧贴胶面。电泳条件加样后预电泳，电压380v,电流24ma, 15_20min。电泳条带跑出大约IOcm后，停止电泳，保留12%的部分，其余部分凝胶舍去，将凝胶在胶与玻璃板接触的周围用注射器注水进去，然后用所料薄膜覆盖胶面，倾斜胶板。将胶放入装有染色液的方盒里，过几分钟会出现条带，通过UVI成像系统来成像，此时进行多态性分析。本发明的有益效果本发明通过水平板梯度电泳技术分析绵羊血清运铁蛋白遗传多态性，可广泛的用于蛋白质遗传多态性的分析，所分离蛋白质的范围更广，且能辨别分子量相差较小蛋白质，为蛋白质遗传多态性的研究提供技术支撑。本发明不同于聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，其过程并不是在单一浓度的凝胶上进行，而是通过形成梯度凝胶，使凝胶从顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，因此在凝胶的顶部孔径较大，而在凝胶的底部孔径较小，运铁蛋白在此梯度电泳中条带清晰、分型效率高。本方法具有简便、灵敏、分型效率高等特点，可以分析出绵羊血清运铁蛋白遗传多态性，为发现和鉴别更多运铁蛋白等位基因提供了检测方法，进而为绵羊运铁蛋白遗传多态性的研究提供参考依据。
图I各浓度胶长度示意图。图2实施例水平板梯度电泳检测运铁蛋白(Tf)各带型(等位基因型)判型图。
具体实施例方式为了更好的理解本发明，下面结合实施例进行进一步阐明本发明的内容。实施例I :
用水平板聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳分析绵羊血清运铁蛋白遗传多态性的步骤
一、选择用于待检验的样品一绵羊非抗凝血，使其自然凝固，以3000r/min离心lOmin，分离出血清，将上清液置于灭菌干净的青霉素小瓶中并编号，置于-20°C冰箱中保存，供TF电泳用。二、制胶 ①准备胶板
用水清洗玻璃板、晾干，将垫片放在玻璃板上，用洗涤液擦洗带有胶带纸的那块平板的无胶带纸的那个平面，将两块玻璃平板放在一起，用夹子将周围固定。②加胶 I、12%
取4个大tip头，分别放标注A、B、C、DW，取A 11. 2ml+B 7. 5ml+Dff 3. 8ml于一个小烧杯中取7. 5ml C于上述小烧杯中，玻璃棒搅动(快速)用大针筒吸取上述A、B、C、DW混合液，注入胶板中，直至胶板长度的2/3处，将小针筒的正丁醇注入胶内大约I. 5ml，大约10-20分钟，可以看到胶面水平凝固，倒掉上面正丁醇，并用水冲洗胶面2次。2、6%:
取A I. 125ml+B I. 5ml+C I. 875ml +Dff I. 5ml于一个小烧杯中，玻璃棒搅动用大针筒吸入大约6ml注入胶面，将小针筒中大约l_2ml的正丁醇注入胶面。待胶面水平、凝固，倒出正丁醇,再用水冲洗胶面1-2次。3、8%
取Al. 5ml+Bl. 5ml+Cl. 5ml +DffI. 5ml于一个小烧杯中，玻璃棒搅动用大针筒取大约 取6ml，注入胶面，将小针筒中剩余的正丁醇注入胶面静置，待胶面水平凝固后，倒出正丁醇。③拆胶
取走垫条及玻璃平板，在剩余的平板的胶面上放置保鲜膜，在胶板下垫一块划一条直线的白纸上使胶下边缘离直线大约5. 5cm，将待测的各血浆样品瓶打开，取单层小纸片，沾少许血浆，用卷纸吸取多余血浆，放在线的下面，并注意在适当的位置放上标准样品。④电泳过程
加样后将胶板放在冰水循环装置的平板上，倒入电极缓冲液，使棉布搭在胶面上，使棉布紧贴胶面、平整。电泳条件加样后预电泳，电压380v，电流24ma、15-20分钟。电泳循环装置配套有冰水循环冷却系统。具体做法是将胶板放在冰水循环装置的平板的上面，通过冰水循环装置的平板来间接冷却胶板(保持4°C )。三、染色
电泳条带跑出大约IOcm后，停止电泳，保留12%的部分，其余部分凝胶舍去，将凝胶在胶与玻璃板接触的周围用注射器注水进去，然后用所料薄膜覆盖胶面，倾斜胶板。将胶放入装有染色液的方盒里，过几分钟会出现条带，然后可以过夜放置。四、判型
从正极开始，带型向下依次为A、B、C、D、E、F、G,根据条带的数目分析出带型。电泳图见图2
本发明所用凝胶的配制方法
A.储备液stocksolution: Acrylamide 32g>Bisacrylamide O. 8g、加水定容至 100ml
B.凝胶缓冲液PH7. 8-7. 9、Tris 4. 54g、TEMD O. 3ml、2-mercaptoethanol (疏基乙醇)O. 15ml加水定容至100ml,并用concH2S04调整到PH 7. 8-7. 9。C. Ammonium persulfate (过硫酸铵)，100mg/50 ml D. W 以下为制作一块板胶的用量
(总量 30) 12% A. 11. 2ml+B 7. 5ml +C 7. 5ml +D. W 3. 8ml(总量 6) 6% A. I. 125ml+B I. 5ml +C I. 5ml +D. W I. 875ml(总量 6) 8% A. I. 5ml+B I. 5ml +C I. 5ml +D. W I. 5ml制成胶后的各浓度胶长度示意图，见图I本发明所用电极缓冲液的配制方法
Tris 15. 74g、硼酸 2. 96g，加水定容至 2000ml,用 NaOH 调整到 ph9. O。本发明所用电极染色液的配制方法
Ig考马斯亮蓝G溶于600ml水中，然后加入120ml 6%的高氯酸溶液，最后加水直到2000ml为止。在配置时采用实验室一个大约5000ml的标本缸，由于高氯酸原液浓度为70%，因此可以根据下式120*60%=x*70%计算出70%高氯酸的需要量(X)，然后加入水(2000-600-x)即可。
权利要求
1.一种梯度凝胶电泳检测绵羊运铁蛋白多态性的方法，其特征在于是采用水平板聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳检测运铁蛋白多态性，所述的水平板聚丙烯酰胺梯度凝胶，从顶部到底部凝胶浓度分别为12%、8%、6% ；电泳条件为采用电压为380V预电泳10-15分钟，然后采用740V电泳5-6个小时。
2.根据权利要求I所述的梯度凝胶电泳检测绵羊运铁蛋白多态性的方法，其特征在于在电泳过程中对水平板进行冰水循环冷却，保持4°C。
全文摘要
本发明公开了一种梯度凝胶电泳检测运铁蛋白遗传多态性的方法。该方法是采用水平板聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳检测运铁蛋白多态性，所述的水平板聚丙烯酰胺梯度凝胶，从顶部到底部凝胶浓度分别为12%、8%、6%；电泳条件为采用电压为380V预电泳10-15分钟，然后采用740V电泳5-6个小时。应用本发明方法，运铁蛋白能得到很好地分离，条带清晰，无干扰现象且能可同时进行大批量样本的检测，克服垂直板凝胶电泳条带不清晰、分型效率低等弊端。因此本发明采用的水平板聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳具有简便、快速、灵敏等特点，本方法为发现绵羊运铁蛋白的遗传多态性检测提供了新的检测方法。
文档编号G01N27/447GK102636548SQ20121013998
公开日2012年8月15日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者丁家桐, 倪蓉, 周洪, 孙伟, 孙炜, 常洪, 陈玲 申请人:扬州大学