专利名称：一种植物组织中H<sub>2</sub>S的化学染色方法
技术领域：
本发明涉及植物组织化学染色方法，具体是ー种植物组织中H2S的化学染色法，该方法可以对植物组织内的H2S做定性和半定量分析。
背景技术：
硫化氢(H2S)作为ー种有毒气体，人类认识和研究其作用已有300多年的历史。直到20世纪90年代中期，人们才发现H2S是存在于生物体内的ー种新型的内源性气体信号分子，所以H2S被认为是继NO和CO之后的第三种气体信号分子。在动物体中是ー种新的内皮细胞源性血管舒张因子，在平滑肌松弛、海马长时程增强、脑发育和炎症等方面发挥着重要的生理病理作用。在植物中，H2S也能够作为信号分子调控多种生理过程，响应生物和非生物胁迫，研究发现外源H2S可促进植物种子萌发和根系发生，调节和控制气孔运动，而且可以缓解重金属毒害、渗透胁迫、冷冻胁迫对植物的影响。因此H2S对生物的生理作用和它的信号转导机制正在成为生物领域的研究热点。对于H2S在生物体中的作用研究才刚起步，国内外H2S在组织细胞中的定位只有利用荧光探针的方法。这种探针仅见于研制成功的文献报道，还没有生产和应用；且荧光探针应用成本高，对实验条件要求也高。
发明内容
本发明的目的是建立ー种简便，易行，效果良好的植物组织中的H2S化学染色方法，从而为H2S在植物组织中的显色定位以及半定量分析提供一种有效的研究方法。本发明的显色原理和方法设计是根据H2S的化学性CuS04+H2S=CuS丨(黒色沉淀)+H2SO4,且CuS沉淀不溶于水、こ醇，仅溶于硝酸。植物组织中H2S的产生富集区域经CuSO4溶液处理后会有黒褐色沉淀产生，反之在没有H2S生成的区域则没有沉淀产生。本发明提供的ー种植物组织中H2S的化学染色方法，包括如下步骤取植物叶片浸泡于8_10%CuS04溶液中，6-10小时后取出叶片用蒸馏水洗净，放入95%こ醇中煮30-40分钟或放入95%こ醇中60°C水浴10-12小时，脱去叶绿素，取出叶片蒸馏水洗后体式显微镜下观察，叶片上呈现黑褐色斑点。可根据叶片上呈现黑褐色斑点的多少，判断植物组织H2S含量的多少。与现有技术相比，本发明是一种成本低廉、操作简便的H2S植物组织化学染色方法，它可以特异地显示出植物组织中H2S的定位，并可以依据叶片上沉淀形成的黒褐色斑点数量对H2S在组织中的含量进行半定量分析。
图I是拟南芥叶片局部放大照片(放大倍数180 X)图2是X射线光电子能谱(XPS)分析叶片黑色颗粒密集区的结果a:叶片黑色颗粒密集区XPS全谱
b:Cu2p 的能谱c:S2p 的能谱图3是拟南芥叶片PEG模拟干旱胁迫12小时后硫酸铜染色6小时的结果，图中A :こ醇脱色 B =CuSO4+ こ醇脱色 C 5%PEG+CuS04+ こ醇脱色 D 10%PEG+CuS04+ こ醇脱色E 20%PEG+CuS04+こ醇脱色F 40%PEG+CuS04+こ醇脱色图4是拟南芥叶片Cd胁迫12小时后硫酸铜染色6小时的结果，图中A :こ醇脱色 B :CuSO4+こ醇脱色 C : IOmMCdCl2+こ醇脱色 D :lmMCdCl2+CuS04+こ醇脱色 E 5mMCdCl2+CuS04+ こ醇脱色 F 10mMCdCl2+CuS04+ こ醇脱色
具体实施例方式以下给出本发明的非限定实施例。实施例I.取生长6周的拟南芥叶3片浸泡于CuSO4饱和溶液中，6小时后取出叶片，用蒸馏水洗净，放入95%こ醇中煮30分钟脱去叶绿素，取出叶片蒸馏水洗后体式显微镜下观察(见图I)。叶片上呈现CuS黒褐色斑点，说明植物组织中存在H2S。为进ー步证明叶片中的黒褐色沉淀是CuS，将上述有黒褐色斑点的叶片表皮撕下，暴露出黒褐色沉淀密集区域，充分干燥后进行X射线光电子能谱分析(XPS分析)。从XPS分析图谱中可知，叶片中的C、N、O最多，这符合生物样品的成份特点，而且能检测出Cu和S，这在正常生物样品中是不可能出现的结果(图2A)。在935eV附近的ー个强峰对应Cu2p的结合能(图2B)，在167eV附近的峰对应S2p的结合能(图2C)根据峰面积的定量測量，可知Cu和S的原子摩尔比为2. 27 :1. 11。通过XPS分析叶片中黑褐色区域的化学成份及元素结合能，确定该区域为CuS沉淀，验证了本方法的正确性。实施例2.取生长6周的拟南芥叶3片浸泡于CuSO4饱和溶液中，6小时后取出叶片，用蒸馏水洗浄，将叶片放入95%こ醇中60°C水浴12小时脱去叶绿素，取出叶片蒸馏水洗后体式显微镜下观察。叶片上呈现黑褐色斑点，说明植物组织中存在H2S。实施例3.为了证明叶片中CuS黒褐色沉淀多少与叶片中H2S的产率具有相关性，做了以下实验将生长6周的拟南芥植株分别浸泡在装有30ml的5%、10%、20%、40%PEG (模拟干旱胁迫)的培养皿中处理，每ー处理3株拟南芥。12小时后取出拟南芥，蒸馏水洗净，分别剪下各处理植株的叶片，分成两部分，一部分叶片浸泡于CuSO4饱和溶液中6小吋，一部分叶片用于測定H2S产率。经CuSO4饱和溶液染色后的叶片用蒸馏水洗净放在95%こ醇中煮30分钟脱去叶绿素，叶片蒸馏水洗后体式显微镜下观察，结果见图3。阴性对照为没有任何处理单独用こ醇脱叶绿素的叶片。结果表明，随着PEG处理浓度的升高，拟南芥叶片中测得的H2S的产率增加(R2=O. 8088)，而且叶片上黑褐色斑点数量也增多。
将生长6周的拟南芥植株分别浸泡在装有30ml的1、5、IOmMCdCl2溶液的培养皿中处理，每ー处理3株拟南芥。12小时后取出拟南芥，蒸馏水洗净，分别剪下各处理植株的叶片，分成两部分，一部分叶片浸泡于CuSO4饱和溶液中6小吋，一部分叶片用于测定H2S产率。经CuSO4饱和溶液染色后的叶片用蒸馏水洗净放在95%こ醇中60°C水浴12小时脱去叶绿素，叶片蒸馏水洗后体式显微镜下观察见图4。阴性对照为没有任何处理单独用こ醇脱叶绿素的叶片和用IOmMCdCl2处理仅用こ醇脱色的拟南芥叶片。结果表明，随着CdCl2溶液浓度的 升高，拟南芥叶片中测得的H2S的产率增加(R2=O. 9808)，而且叶片上黑褐色斑点数
量也增多。
权利要求
1.ー种植物组织中H2S的组织化学染色方法，其特征在于，包括如下步骤取植物叶片浸泡于8-10%CuS04溶液中，6-10小时后取出叶片用蒸馏水洗净，放入95%こ醇中煮30-40分钟，脱去叶绿素，取出叶片蒸馏水洗后，用体式显微镜观察，叶片上呈现黑褐色斑点。
2.如权利要求I所述的ー种植物组织中H2S的化学染色方法，其特征在于，所述的放入95%こ醇中煮30-40分钟，用放入95%こ醇中60°C水浴10-12小时代替。
全文摘要
本发明提供了一种植物组织中H2S的组织化学染色方法，步骤如下取植物叶片浸泡于8-10%CuSO4溶液中，6-8小时后取出叶片用蒸馏水洗净，放入95%乙醇中煮30-40分钟，脱去叶绿素，取出叶片用蒸馏水冲洗后,体式显微镜下观察，叶片上呈现黑褐色斑点。与现有技术相比，本发明成本低廉、操作简便，它可以特异地显示出植物组织中H2S的定位，并可以依据叶片上形成的黑褐色沉淀的斑点数量对H2S在组织中的含量进行半定量分析。
文档编号G01N1/30GK102721690SQ20121014338
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者乔增杰, 张丽萍, 裴雁曦, 金竹萍 申请人:山西大学