专利名称：一种胶原蛋白酶酶活的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白酶酶活测定方法，尤其涉及一种胶原蛋白酶酶活的测定方法。
背景技术：
胶原蛋白(Collagen)是由动物细胞合成的一种相对分子量在30万以上的生物高分子，广泛存在于动物骨骼、肌腱、软骨、皮肤及其它结缔组织中，约占哺乳动物总蛋白的1/3，骨骼与肌键中总蛋白的90%以上，皮肤中总蛋白的50%以上，胶原蛋白具有独特的三螺旋结构，很难被一般的蛋白酶水解，只能被胶原蛋白酶特异性水解。胶原蛋白酶(colIagenase),是一种以水解不溶性胶原蛋白蛋白为特征的蛋白水解酶,在多个蛋白酶家族，如金属蛋白酶家族和丝氨酸蛋白酶家族中均有存在，目前，胶原蛋白酶已广泛应用于医 药、食品等领域在工业开发中应用于胶原分级降解以获得胶原多肽；在医学研究中用于治疗椎间盘突出症等；实验室研究中作为工具酶应用于细胞和器官的分离；基础研究中应用于胶原结构的研究。李陈(《胶原蛋白酶活性的测定方法》，中国皮革，2008,37(11) : 24-25 )等人综述了胶原蛋白酶活性测定方法以酪蛋白作为底物，反应体系为0. ImL酶液，ImLO. 6%酪蛋白溶液，50mmol/L ρΗ7· 5 Tris-HCl, 4mmol/L CaCl2, 30°C水浴 lOmin，然后用 10% 的三氯乙酸终止反应,水解释放出来的酸性肽在273nm下测定吸光值，酶活力定义为每分钟每毫克蛋白产生相当于等量酪氨酸微摩尔数为一个酶活力单位。现有技术存在的问题是酶活定义的标准不统一，存在底物差异性，酶活数据不一致，测量精度不高，从而影响了胶原蛋白酶及其相关产品的应用和推广。
发明内容
本发明是为了克服现有技术的胶原蛋白酶酶活检测标准不统一、存在底物差异性、酶活数据不一致的不足，提供了一种标准统一、克服底物差异性、酶活数据一致、测量精度高的胶原蛋白酶酶活的测定方法。本发明采用以下技术方案
本发明的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，包括如下步骤
①试剂准备准备浓度为O.lmol/LpH7. 5的Tris · Cl缓冲液、体积分数10%的三氯乙酸溶液、O. 6^0. 8mol/L的邻苯二甲醛溶液、O. 3mmol/L的羟脯氨酸标准液、2mol/L的乙酸缓冲液、茚三酮显色液、体积分数60%的醇溶液；
②羟脯氨酸梯度样品制备分别移取羟脯氨酸标准液适量于比色管中稀释定容至同一体积，制成浓度为O. 03、. 3μ mol/mL的若干羟脯氨酸梯度样品，取与羟脯氨酸梯度样品相同体积的蒸馏水于比色管中作为参照样品；
③羟脯氨酸梯度样品测定向参照样品和各羟脯氨酸梯度样品中分别加入与羟脯氨酸梯度样品体积相等的乙酸缓冲液和茚三酮显色液，充分混合，密封后于10(T105°C水浴加热15 20min，冷却，放置lOmin，然后加入羟脯氨酸梯度样品体积3倍的醇溶液稀释，以参照样品为参比溶液，在520nm处测各羟脯氨酸梯度样品的吸光值，根据羟脯氨酸梯度样品的浓度C和吸光值A作出C-A标准曲线，并拟合出标准曲线公式；
④待测酶解液制备称取O.8^1. 2mg胶原底物，加入O. 4^0. 6mlTris · Cl缓冲液，于35 40°C预热8 12min，加入O. Iml待测酶液，所述待测酶液体积记为V2，于35 40°C酶解反应Tmin，所述T的值为25 35，然后加入O. 5 O. 7ml三氯乙酸溶液摇匀，接着加入O. 5 O. 7ml的邻苯二甲醛溶液摇匀，最后加入O. Γ0. 6g硅胶，搅匀后静置5lmin，离心得上清液，该上清液体积记为V1，所述上清液稀释N倍后作为待测酶解液；
⑤空白液制备称取O.8 1. 2mg胶原底物，加入O. 4^0. 6ml Tris · Cl缓冲液，于35 40°C预热8 12min，加入O. 5 O. 7ml三氯乙酸溶液摇匀，然后加入O. Iml待测酶液，于35 40°C酶解反应25 35min，再加入O. 5 O. 7ml的邻苯二甲醛溶液摇匀，最后加入O. 4 O. 6g硅胶，搅匀后静置5lmin，离心得上清液，所述上清液稀释N倍后作为空白液，其中N的值与步骤④中的N值相同；
⑥酶活力的测定取待测酶解液和空白液各一定体积于比色管中，所述体积记为V3,分别加入V3体积的乙酸缓冲液和茚三酮显色液，充分混合，密封后于10(T105°C水浴加热15 20min，冷却，放置lOmin，然后加入3倍V3体积的醇溶液稀释，以空白液为参比溶液，测待测酶解液在520nm处的吸光值；
⑦测出待测酶解液吸光值A后，代入步骤③得到的标准曲线公式中得到对应的待测酶解液中的羟脯氨酸浓度C ；
⑧胶原蛋白酶酶活的计算计算公式如下
,
权利要求
1.一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的测定方法包括如下步骤 ①试剂准备准备浓度为0.lmol/LpH7. 5的Tris Cl缓冲液、体积分数10%的三氯乙酸溶液、0. 6^0. 8mol/L的邻苯二甲醛溶液、0. 3mmol/L的羟脯氨酸标准液、2mol/L的乙酸缓冲液、茚三酮显色液、体积分数60%的醇溶液； ②羟脯氨酸梯度样品制备分别移取羟脯氨酸标准液适量于比色管中稀释定容至同一体积，制成浓度为0. 03^0. 3umol/mL的若干羟脯氨酸梯度样品，取与羟脯氨酸梯度样品相同体积的蒸馏水于比色管中作为参照样品； ③羟脯氨酸梯度样品测定向参照样品和各羟脯氨酸梯度样品中分别加入与羟脯氨酸梯度样品体积相等的乙酸缓冲液和茚三酮显色液，充分混合，密封后于10(T105°C水浴加热15 20min，冷却，放置lOmin，然后加入羟脯氨酸梯度样品体积3倍的醇溶液稀释，以参照样品为参比溶液，在520nm处测各羟脯氨酸梯度样品的吸光值，根据羟脯氨酸梯度样品的浓度C和吸光值A作出C-A标准曲线，并拟合出标准曲线公式； ④待测酶解液制备称取0.8^1. 2mg胶原底物，加入0. 4^0. 6mlTris Cl缓冲液，于35 40°C预热8 12min，加入0. Iml待测酶液，所述待测酶液体积记为V2，于35 40°C酶解反应Tmin，所述T的值为25 35，然后加入0. 5 0. 7ml三氯乙酸溶液摇匀，接着加入0. 5 0. 7ml的邻苯二甲醛溶液摇匀，最后加入0. 4^0. 6g硅胶，搅匀后静置5lmin，离心得上清液，该上清液体积记为V1，将所述上清液稀释至浓度0. 03、. 3 u mol/mL作为待测酶解液，稀释倍数记为N ； ⑤空白液制备称取0.8^1. 2mg胶原底物，加入0. 4^0. 6ml Tris Cl缓冲液，于35 40°C预热8 12min，加入0. 5 0. 7ml三氯乙酸溶液摇匀，然后加入0. Iml待测酶液，于35 40°C酶解反应25 35min，再加入0. 5 0. 7ml的邻苯二甲醛溶液摇匀，最后加入0. 4 0. 6g硅胶，搅匀后静置5lmin，离心得上清液，所述上清液稀释N倍后作为空白液； ⑥酶活力的测定取待测酶解液和空白液适量于比色管中，体积记为V3，分别加入V3体积的乙酸缓冲液和茚三酮显色液，充分混合，密封后于10(T105°C水浴加热15 20min，冷却，放置lOmin，然后加入3倍V3体积的醇溶液稀释，以空白液为参比溶液，测待测酶解液在520nm处的吸光值； ⑦测出待测酶解液吸光值A后，代入步骤③得到的标准曲线公式中得到对应的待测酶解液中的羟脯氨酸浓度C ； ⑧胶原蛋白酶酶活的计算计算公式如下酶活(jjj= Cx^xMWxN 、式T 其中，C为待测酶解液中羟脯氨酸的浓度为上清液体积,为羟脯氨酸分子量'N%上清液稀释倍数为待测酶液体积为酶解反应时间。
2.根据权利要求I所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，步骤②中所述适量是指0. n. 0ml，所述同一体积是指1ml，所述浓度为0. 03、. 3 u mol/mL的羟脯氨酸梯度样品的数量为6个、7个或8个。
3.根据权利要求2所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述6个羟脯氨酸梯度样品的浓度依次为0. 03,0. 06,0. 12,0. 18,0. 24,0. 30 u mol/mL ;所述7个羟脯氨酸梯度样品的浓度依次为0. 03,0. 06,0. 12,0. 15,0. 18,0. 24,0. 30 u mol/mL ;所述8个羟脯氨酸梯度样品的浓度依次为 0. 03,0. 06,0. 12,0. 15,0. 18,0. 21,0. 24,0. 30 y mol/mL。
4.根据权利要求I所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的醇溶液为乙醇溶液或异丙醇溶液。
5.根据权利要求I所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的胶原底物是指不溶性胶原蛋白或明胶。
6.根据权利要求I或2或3或4或5所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的待测酶液是由成品胶原蛋白酶配制成的0. 2mg/L的酶液。
7.根据权利要求I或2或3或4或5所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的硅胶为细孔硅胶。
8.根据权利要求I或2或3或4或5所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，步骤④中上清液稀释至浓度0. 12^0. 24 u mol/mL作为待测酶解液。
全文摘要
本发明公开了一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，旨在克服现有技术存在的酶活检测标准不同一、数据一致性差等问题，所述的测定方法包括如下步骤①试剂准备；②羟脯氨酸梯度样品制备；③羟脯氨酸梯度样品测定，根据测定的吸光值A和羟脯氨酸梯度样品浓度C作出C-A标准曲线，并拟合出标准曲线公式；④待解酶解液制备，以不溶性胶原蛋白或明胶为胶原底物，加入待测酶液酶解反应，离心得上清液，上清液稀释制得待测酶解液；⑤空白液制备；⑥酶活力测定，将待测酶解液按步骤③的操作条件测出其吸光值A；⑦待测酶解液中羟脯氨酸浓度的计算；⑧胶原蛋白酶酶活力计算。本发明具有酶活检测标准统一、克服了底物差异性、测量精度高、酶活数据一致的特点。
文档编号G01N21/31GK102809541SQ20121014703
公开日2012年12月5日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者周宇芳, 朱鹏, 杨会成, 廖妙飞, 肖金星, 钟明杰, 付万冬 申请人:浙江省海洋开发研究院