人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体、其制备方法及应用的制作方法

文档序号:5948956阅读:496来源:国知局
专利名称:人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体、其制备方法及应用的制作方法
技术领域
本发明涉及基因工程抗体技术,具体地说,涉及人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体、其制备方法及应用。
背景技术
乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是世界范围内普遍存在的公共健康问题,急性乙型肝炎过后有5%-10%的持续HBV感染发展为慢性肝病,包括慢性活动性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌。据估计全世界每年有500,000到1,000,000人死于与HBV有关的各种肝脏疾病。我国属于肝炎大国,乙肝病毒携带率为人口的9. 75%。全世界乙肝病毒感染者4. 2亿,我国约有I. 3亿人携带乙肝病毒。乙肝病毒的传播方式大致可分为垂直传播和水平传播两大类。垂直传播指HBV携带者母亲对胎儿的传播,绝大部分发生在妊娠的最后三个月。婴儿一旦感染乙肝病毒,他们中85%-90%会发展成慢性带乙肝病毒状态,其中25%于成年后将死于肝硬化和肝癌。99年的研究显示,我国乙肝病毒感染者也就是乙肝病毒携带者和慢性乙型肝炎中有80%-85%来源于父母在生殖生育过程中的感染。水平传播可以概括为围产期传播、家庭内传播、医源性传播和性传播,而其中围产期传播较严重。关于慢性乙型肝炎的治疗目前还没有一个令人满意的方法,对于肝功能有损害的病人通过保肝治疗绝大部分可以使肝功能得到恢复,但要清除乙肝病毒却是十分困难的。乙肝病毒慢性携带者更是如此。其原因主要是免疫耐受,也就是乙型肝炎病毒感染者的体内免疫系统对乙型肝炎病毒不能产生有效的清除作用。免疫耐受的原因是人体感染乙肝病毒的时间较早,普遍认为是在3岁以前感染的。尚未找到合适的治疗方法之前,防止病毒感染就显得十分重要。目前对于乙肝病毒的预防主要包括主动免疫和被动免疫两种。主动免疫即注射乙肝疫苗,自70年代末首次出现血源性乙肝疫苗,经过几十年的发展到现在已有了成熟的基因工程疫苗。乙肝疫苗的免疫效果好,是预防乙型肝炎传播的有效手段之一。被动免疫为注射乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG),主要用于阻断母婴传播(与乙肝疫苗联合使用)和意外事故的被动免疫。有研究表明采用乙肝疫苗联合HBIG阻断母婴传播效果优于单用疫苗者并且能减少慢性感染的比例。目前HBIG均来源于人抗-HbsAg的阳性血清,这就使其大量制备受到限制,同时由于来源于血清所以容易发生血源性传播疾病的感染。正如血源性疫苗向基因工程疫苗的转变,现在也亟待开发出基因工程乙肝表面抗体替代血源性HBIG,噬菌体抗体库技术为这一问题的解决另辟踐径。利用含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白来预防和治疗传染病由来已久。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护肌体抵抗病毒攻击已获得许多实验的证明,如鼠抗甲肝病毒、汉坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性单克隆抗体可以在体内100%保护动物免受病毒攻击。以抗原免疫动物获得多抗血清的途径一直是获得抗体的经典方法,但缺乏特异性和均一性。继而建立的B淋巴细胞杂交瘤技术使得众多科学家通过细胞工程可以在体外定向地制备各种单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb),其特异性强,性质均一,易于大量生产。然而McAb多为鼠源性,鼠源McAb的异源性反应极大地限制了 McAb作为治疗制剂在人体的应用。免疫球蛋白(Vaccinia immune globulin, VIG)作为抗体成分主要来自捐献者(恢复期病人)免疫血清,从获得阳性血清到通过安全性检测均需花费大量的人力和财力,这就使其大量制备受到限制,同时由于来源于血清所以容易发生血源性传播疾病的感染。而使用人源基因工程产品替代血制品则可克服这些缺陷,随着人源基因工程抗体研究的不断深入,给这一领域的生物制品发展带来了新的希望和广阔前景。通过基因水平上抗体分子的重组可获得多种多样的特异性鼠源及人源抗体,使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景。80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展 ,使当今世界人源或基因工程抗体的开发研究取得很大进展,并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。人源抗病毒基因工程抗体,尤其是人源全抗体的研究成功,给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗带来了新的希望,在抗病毒感染生物药领域逐渐形成了一类新的抗病毒药,即所谓的抗体药(Antibody Drug)。正如血源性疫苗向基因工程疫苗的转变,现在也亟待开发出基因工程抗体替代血源性VIG,如通过嵌合抗体技术(Boulianne, G. L.等,1984;Morrison, S. L.等,1984)、人源化抗体技术(Jones, P.T.等,1986)、携带人单抗的转基因小鼠技术(Green,L.L.等,1994)、异体杂交瘤技术(James, K. et al.,1987)、曬菌体表面展示技术(Barbas, C. F.等,1991)等产生人源化抗体,现已成为国内外研究的热点,并正在逐步获得成功。

发明内容
本发明的目的是提供一种人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体及其活性片段。本发明的另一目的是提供编码所述抗体或其活性片段的基因。本发明的另一目的是提供所述人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体的制备方法。本发明的再一目的是提供所述人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体的应用。为了实现本发明目的,本发明的一种人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体HBFab03或其活性片段,其轻链高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3以及重链高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如表I所示表I抗体HBFab03的重链及轻链高变区的氨基酸序列CDRlCDR2CDR3重链VH SITGSSYY IYSTSGTT ARPTAHRNVRMVPGQDAFEV轻链VL QSVDSSR DASQQYASAPDT前述的抗体HBFab03,i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示,或该序列经替换、或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列;例如,将第7位的Gly替换为Ala,或是将第17位的Ala替换为Val,或是在28位缺失Asp均不会影响蛋白的功能;以及ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示,或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如,将第6位的Gly替换为Asp,或是将第38位的Thr替换为Ala均不会影响蛋白的功能。
本发明还提供编码所述抗体HBFab03的基因。其中,编码轻链可变区和编码重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。本发明的一种人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体HBFabl2或其活性片段,其轻链高变区⑶R1XDR2和⑶R3以及重链高变区⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列如表2所示表2抗体HBFabl2的重链及轻链高变区的氨基酸序列CDRlCDR2CDR3重链VH SITGSSYY IYSTSGTT ARPTAHRNVRMVPGQDAFEV轻链VL QSVSSTY GASQQYGYSPLT
前述的抗体HBFabl2,i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示,或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列;例如,将第 位的Gly替换为Ala,第17位的Ala替换为Val,均不会影响蛋白的功能;以及ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示,或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如,将第6位的Gly替换为Asp,或是将第38位的Thr替换为Ala均不会影响蛋白的功能。本发明还提供编码所述抗体HBFabl2的基因。其中,编码轻链可变区和编码重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示。本发明还提供含有编码所述抗体HBFab03和/或HBFab 12的基因的载体及含有该载体的宿主细胞。本发明还提供所述抗体HBFab03或HBFabl2或它们的活性片段经改造得到的单链抗体ScFv或全抗体免疫球蛋白IgG。本发明还提供所述抗体HBFab03或HBFabl2的制备方法,其是利用噬菌体表面展示技术,采集多个具有高滴度乙肝病毒表面抗原抗体者的外周血淋巴细胞,通过基因工程方法构建了人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体文库,并筛选获得特异性抗乙肝病毒表面抗原的基因工程抗体Fab段。获得的Fab段抗体分别命名为HBFab03和HBFabl2。这2株重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的,并在原核细胞中获得有效表达的特异性结合乙肝病毒的功能性抗体。它们特异性识别乙肝表面抗原,且均针对“ α ”决定簇,与乙肝病毒表面抗原具有明显的酶联免疫(ELISA)反应和较高的亲和力,具有阻止HBV感染敏感细胞的中和功能。HBFab03和HBFabl2特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗乙肝病毒表面抗原抗体基因库的特异性富积筛选,该抗体库的建立来源于中国乙肝疫苗免疫者外周血淋巴细胞基因。其轻链和重链可变区相应的三个CDR区序列组合及其CDR区之间框架区序列组成了每个抗体可变区序列特征,HBFab03和HBFabl2均隶属于抗体重链家族VH4,抗体轻链家族VK3。抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域⑶R1、⑶R2和⑶R3中特异性核苷酸序列及其互补所决定,6个相应的⑶R区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域,决定发明中每个抗体的抗原结合特征和抗乙肝病毒功能特征(见表I和表2)。此外,考虑到密码子的简并性,例如可在其编码区,在不改变氨基酸序列的条件下,对编码上述Fab段抗体的基因序列进行改造,获得编码具有相同功能的抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性,人工合成改造基因,以提高抗体的表达效率。进一步地,本发明将上述Fab抗体的轻链可变区和重链可变区进行重组,获得分子量更小的单链抗体(ScFv),该抗体同样能够特异性识别乙肝病毒表面抗原,具有细胞内免疫的作用。单链抗体穿透力强,易于进入局部组织发挥作用。可将上述编码Fab抗体的基因、ScFv基因克隆到表达载体中,进而转化宿主,通过诱导表达获得Fab抗体以及单链抗体。此外,可将上述Fab抗体的轻链编码基因和重Fd段基因克隆到全抗表达载体中,并导入宿主细胞中,获得表达抗乙肝病毒的全抗免疫球蛋白。例如,可将上述2株Fab抗体(HBFab03和HBFabl2)的轻链和重Fd段基因分别克隆入全抗体表达载体pAC-K_Fc并转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统可实现全抗 体的分泌型表达,得到全抗体HBIgG03 和 HBIgG12。利用ELISA、SDS_PAGE、BIAcore、竞争阻断实验及体外细胞学实验对获得的全抗体进行功能鉴定,结果表明2株人源IgG全抗体(HBIgG03和HBIgG12)针对乙肝表面抗原均有特异性结合;HBIgG03和HBIgG12对乙肝表面抗原显示出较高的亲和力,亲和力常数KD(M)分别为3. 75X 10_9和9. 53X 10Λ竞争阻断实验及体外细胞学实验结果表明这2株人源抗体(HBIgG03和HBIgG12)具有阻止HBV感染敏感细胞的功能,具有中和活性。这一结果为阻止乙肝病毒感染和乙肝病毒相关肝病的治疗研究奠定了基础。本发明还提供所述抗体HBIgG03或HBIgG12或它们的活性片段在制备预防或治疗乙肝病毒相关肝病的药物或诊断试剂中的应用。本发明进一步含有所述抗体HBIgG03或HBIgG12或它们的活性片段的药物或诊断试剂。本发明利用噬菌体抗体库技术,成功地获得了 2株特异性针对乙肝病毒表面抗原的人源中和性抗体HBIgG03和HBIgG12 ;利用上述获得的人源中和性抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体可变区基因、Fab抗体基因以及各自抗体基因特征下的全抗体基因,可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产该抗体或以此为基础的改建后的含有该抗体基因的任何其他基因,获得具有中和乙肝病毒感染的抗体产物,制成临床上用于预防和治疗乙肝病毒相关肝病的特异性抗体药物或诊断试剂。


图I为ELISA检测表达的人Fab抗体对抗人Fab和HBsAg的特异性结合。图2纯化后IgG的SDS-PAGE电泳图。图3为应用表面等离子共振技术测定人源抗乙肝病毒表面抗原单抗亲和力的结果;其中,A 为 HBIgG03,B 为 HBIgG12。图4为H印G2细胞中HBV PreslDNA检测结果;其中,A、B、C、D1、D2、E、F和G分别为乙肝病毒感染组;HBV和人源抗体HBIgG03孵育后再感染;HBV和人源抗体HBIgG12孵育后再感染;HBV和鼠单抗孵育后感染(鼠单抗稀释度1:400) ;HBV和鼠单抗孵育后感染(鼠单抗稀释度1:800);单用人源抗体HBIgG03和H印G2细胞作用;单用人源抗体HBIgG12和HepG2细胞作用;单用鼠单抗与HepG2细胞作用。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。实施例I人源抗乙肝病毒抗体库的构建及Fab抗体的筛选I. I材料和方法I. I. I病毒、细胞及载体来源乙肝病毒HBV China C Subtype已在文献(王琳,刘文等,中国流行的C基因型HBV稳定复制表达细胞系的建立,解放军医学杂志,2010,12 ;黄维金,周诚等,乙型肝炎病毒中国流行株B、C、D/C及A基因型的全基因克隆与序列分析,世界华人消化杂志,2009,17(29) =2978-2983)中公开,由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肝炎室提供。人肝癌细胞系H印G2、昆虫细胞Sf9(购自ATCC,美国)。菌株 XLl-Blue (Stratagene,美国),载体 pComb3H(40kb),由美国 Scripps 研究所馈赠。杆 状病毒表达载体pAC-K-Fc,购自德国PROGEN公司,商品编号PR3003。乙型肝炎表面抗原(CHO-HBsAg)购自北京万泰生物药业公司;鼠抗乙肝表面抗原单克隆抗体3E7 (MouseAnti-Hepatitis B Surface Antigen HbsAg, Clone 3E7)购自 DAKO 公司。乙肝表面抗原阳性血清由佑安医院肝病研究所惠赠。I. I. 2抗原制备分离HBV病毒颗粒Csc12垫层4ml,上面加6ml血清标本(委托首都医科大学附属北京佑安医院采集),超速离心30000转/分钟,离心4小时;弃上清,加入IXPBS Iml悬浮沉淀,4°C放置过夜;12000转/分钟瞬时离心,保留上清即HBV病毒悬液。I. I. 3噬菌体抗体库的构建用淋巴细胞分离液(Sigma,美国)从具有高滴度乙肝病毒抗体的疫苗注射者的抗凝血液中分离淋巴细胞,用RNeasy Mini Kit (QIAGEN,德国)提取总细胞RNA,以01igo-dT为引物,提取的RNA为模版采用Invitrogen公司的第一链合成试剂盒(SuperScriptTMIIIFirst-Strand Synthesis System for RT-PC R. Cat No. 18080-051)逆转录成cDNA.用一组扩增人源抗体IgGl重链Fd及轻链Kappa和Lambda的引物,使用的引物序列如下(一)重链Fd区引物5,端VHla 5’-CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GGG-3’VHlf 5’-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3’VH2f 5’-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TCG GG-3’VH3a 5’-GAG GTG CAG CTC GAG GAG TCT GGG-3'VH3f 5’-GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3'VH4f 5,-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3’VH6f 5’-CAG GTG CAG CTA CTA GAG TGG GG-3’VH6a 5,-CAG GTA CAG CTC GAG CAG TCA GG-3’3,端CGlZ 5’-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG-3'(二)轻链引物
κ链可变区5’ -端VKla 5’-GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3’VK2a 5’-GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3'VK3a 5’-GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA-3'κ链可变区3-端CKld 5’ -GCG CCG TCT AGA ATT MC ACT CTC CCC TGT TGA AGCTCT TTG TGA CGGGCG AAC TCA-3'λ链可变区5-端
VLl 5’-AAT TTT GAG CTC ACT CAG CCC CAC-3’VL2 5,-TCT GCC GAG CTC CAG CCT GCC TCC GTG-3’VL3 5,-TCT GTG GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG-3'VL4 5’-TCT GAA GAG CTC CAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG-3'VL5 5,-CAG TCT GAG CTC ACG CAG CCG CCC-3’VL6 5’-CAG ACT GAG CTC ACT CAG GAG CCC-3'入链可变区3-端CL2 5’-CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3’对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR条件为94°C lmin,54°C lmin,72°C 2min,共35个循环。建库方法基本按文献进行(Barbas, C. F III. , Kang, A. S. , andlarner, R. A. Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surface: thegene III site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991; 88 (18) : 7978-7982)。具体如下将不同引物合成的Kamba和Lamda链PCR产物混合,将不同引物合成的Fd链混合,分别用Sacl/Xbal和Xhol/Spel克隆入噬菌体载体pComb3,将克隆入轻、重链基因的pComb3载体DNA连接产物经乙醇沉淀后,用10 μ I蒸溜水悬起,电转导入事先制备好的200 μ I电转菌XLl-Blu (电转条件为=Bio-Red电转仪,0. 2cm电转杯,2. 5千伏),电转后加10ml SOC培养液,37° C I小时,加入IOml带有氨苄青霉素和四环素的SB培养液37° C培养1小时,加入80-1001111前述58,37° C 2小时后加入辅助噬菌体VCSM13 1X1012,1小时后加入卡那霉素(70 μ g/ml),37° C摇床培养过夜。用4% PEG8000和3% NaCl沉淀噬菌体上清,经9000rpm,20分钟,4°C离心后,用2ml 0. 02M PBS pH 7.4重悬沉淀,建立噬菌体抗体库,分装保存于-20° C冰柜中。I. I. 4噬菌体抗体库的富集筛选及Fab段抗体的诱导表达以纯化乙型肝炎表面抗原(CHO-HBsAg)为筛选抗原。使用时用0. lmol/LNaHCO3(pH8. 6)溶液稀释,包被免疫管,用含4%脱脂奶的PBS液,于37°C封闭2h后,加入上述噬菌体抗体库,每管lml,37°C孵育2h,用含5% Tween-20的TBS液反复洗20遍,最后每管用lmlpH2. 2的甘氨酸-盐酸洗脱液洗脱,并用pH9. 6的Tris液中和。洗脱后的噬菌体继续感染2ml新鲜的OD6tltl为I. O左右的XLl-Blu菌,经辅助噬菌体VCSM13 (Stratagene,美国)感染后进行下一轮筛选。如此反复筛选4飞次。具体富集筛选方法及Fab段的诱导表达基本按文献(Barbas, C. FIII. , Kang, A. S. , and larner, R. A. Assembly of combinatorialantibody libraries on phage surface: the gene III site. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1991; 88 (18) :7978-7982)进行。具体如下
用O. IM NaHCO3 (pH8. 6)的溶液包被纯化的乙型肝炎表面抗原(CHO-HBsAg) (I :200稀释),每孔100μ 1,4°C过夜;次日用IXPBST洗去未吸附的抗原,用4%的脱脂奶37°C封闭I小时,弃封闭液;每孔加入80 μ I噬菌体抗体库,37°C孵育2小时,弃去孔中未结合的噬菌体,用 lXTBST(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl,0. 5% Tween 20,ρΗ7· 5)洗液冲洗各孔,冲洗时,用带有吸头的移液器反复吹打,共洗10-20遍,以充分洗去未吸附的噬菌体;最后用ddH20洗两遍,吸净孔中的液体;每孔加入50 μ I Gly-HCl (ρΗ2. 2)的洗脱液,室温孵育10分钟,期间反复吹打数次。加入适量的2Μ Tris,以中和洗脱下来的噬菌体;将洗脱的噬菌体立即加入2ml新鲜制备的XLl-Blu菌液中(0D_ = I),室温孵育15-20分钟;然后转入250ml三角瓶中,加入SBlOml (氨苄青霉素:20yg/ml,四环素:10 μ g/ml),立即取10 μ I涂氨苄青霉素平皿,以滴定噬菌体;三角瓶与37°C振荡培养I小时,加入IOOmlSB(氨苄青霉素100 μ g/ml),37°C I小时后,加入辅助噬菌体VCSM13 μ 1ml,37°C振荡培养2小时,加入卡那霉素(终浓度70 μ g/ml),37°C培养过夜。如此反复筛选4次。
I. I. 5人源抗乙肝病毒表面抗原Fab抗体的ELISA检测(I)检测Fab的表达用O. lmol/L NaHCO3 (pH9. 6)溶液将抗人Fab 抗体(I 2000 稀释后使用,Sigma,美国)包被于酶标板上,4°C过夜;4%脱脂奶封闭,37°C lh,加入表达的Fab抗体,37°C Ih ;力口入酶标抗人Fab 二抗(I 2000稀释后使用,Sigma,美国),37°C Ih ;显色液显色,2M H2SO4终止反应,酶标仪检测吸光度A值。(2)间接酶联免疫法检测Fab与乙肝病毒表面抗原的结合活性用纯化乙型肝炎表面抗原(CHO-HBsAg)作为包被抗原,其余步骤同上。I. I. 6人源Fab抗体可变区基因的核酸序列分析用Qiagen Miniprep Kit (QIAGEN,德国)制备质粒DNA进行核酸序列分析。轻重链的测序引物分别为 5' -AAACTAGCTAGTCGCCAAGGA-3'和 5' -CCGCGGTGGCGGCCGCAAAT-3'。将测序结果与Internet V-Base基因库中IgG基因序列进行比较。I. I. 7全抗体重组表达质粒的构建将获得的Fab抗体的轻链用Xbal/SacI进行酶切,然后用末端补平酶(K片段)补平,克隆至 pAC-K-Fc 载体(德国 PR0GEN,商品编号 PR3003) (Liang, M. F.,Stefan, D.,Li, D.X. , Queitsch, I. , Li, ff. , and Bautz, E. F. Baculovirusexpression cassette vectors forrapid production of complete human IgG from phage displayselected antibodyfragments. Journal of Immunological Methods. 247:119-130.),再利用 Xhol/Spel 位点将重链Fd段克隆进去,构建成全抗体表达载体。I. I. 8采用美国Pharmogen公司的BaculoGold共转染试剂盒。操作方法略述如下将5 μ g的重组质粒DNA与0. 5 μ g的BaculoGold线性DNA混合后,利用试剂盒中的转染试剂转染生长密度为50%的Sf9细胞,27°C培养4d后,收集上清作为重组病毒的毒种进行滴定和扩增。具体操作见 Baculovirus expression vector system手册(BD BiosciencesPharmingen, USA)。I. I. 9全抗体IgG分泌表达和纯化用重组病毒感染生长密度70%左右的Sf9细胞,27 °C吸附lh。随后改用SF-900 II SFM无血清培养液,27 °C培养3 5d后收集上清。采用Amersham公司的Protein-A 亲和层析柱直接纯化表达上清(Harlow E, Lane D. Antibodies:A LaboratoryManual [Μ]. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)。利用 ELISA 及 IFA对所获纯化的IgG抗体功能特性进行鉴定。具体操作见I. I. 5和I. I. 6。I. I. IOBIAcore法测定全 抗体亲和力(I) CM5传感器芯片动力学手动标片用HBS-EP_BUFFER(GE,美国)作为流动相缓冲溶液,样品稀释溶液使用IOmM NaAcρΗ4· 0、4· 5、5· 0、5· 5,软件采用 BIAcore 3000 控制软件,用 Amine Coupling For 30-50Immoblization Kit (GE,美国)确定氨基偶联HBsAg的最佳浓度,IOmM NaAc最佳pH值,在芯片流通池分别固定700RU、1300RU、2400RU,用pH 2.0 IOmM甘氨酸-盐酸(Gly-HCl)分别进行饱和浓度,解离情况测试确定最佳再生条件。(2)动力学测试分别以HBsAg固定量700RU、1300RU.2400RU流通池为检测通道,未偶联HBsAg流通池为参比通道,HBS为流动相,流速30μ L/min,基线稳定5min,抗体抗原结合3min,解离5min,依次以抗体浓度32、16、8、4、2、0nM(nmol/L),预先空跑8nM 3-10次反应以稳定芯片,OnM和8nM做两次平行,防止系统漂移。(3)数据结果处理采用Biaevaluation分析软件处理SPR信号图,全IgG抗体每个浓度注射到偶联HBsAg流通池后的图谱减去注射相同浓度的抗体到参比流通池所得到的图谱,参比校正后进行曲线拟合,以描述抗原抗体反应动力学的适当模型,并计算KA和KD值。I. I. 11人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体体外抗病毒效果研究利用!fepG2细胞模型来评价获得的这2株人源抗-HBsAg抗体的中和活性。首先收集乙肝病毒阳性血清通过超速离心获得病毒颗粒。将生长状态良好的HepG2细胞分为几组,A组用病毒颗粒感染;B组用HBV和人源抗体HBIgG03孵育后再感染;C组用HBV和人源抗体HBIgG12孵育后再感染;D组用HBV和鼠单抗孵育后感染;E组单用人源抗体HBIgG03和H印G2细胞作用疋组单用人源抗体HBIgG12和H印G2细胞作用;G组单用鼠单抗与H印G2细胞作用。上述各类样品与H印G2细胞作用时,在培养基中加了 10_4-10_6M的地塞米松(地塞米松可以通过作用于HBV基因内的糖皮质激素元件上调HBV的复制)。具体操作如下将HepG2细胞传代置于96孔板中,每孔中的细胞个数为IX IO4 ;两天后细胞数量增至5 X IO4个/孔,将超速离心获得的HBV悬液用DMEM全培养基按2倍、4倍、8倍稀释;分别取HBV原液、2倍、4倍、8倍稀释液各100 μ I加入96孔板中,与HepG2细胞37°C孵育3小时;取HBV原液、2倍、4倍、8倍稀释液各100 μ I分别与人IgGlOO μ g、10 μ g、5 μ g、2. 5 μ g或与I IOOU 200,1 400,1 800稀释的鼠单抗37°C孵育I小时,将抗原抗体混合物加入96孔板的H印G2细胞中37°C孵育3小时(每个浓度的抗原抗体混合物制备3孔);弃去孔中液体,用I XPBS将贴壁细胞洗3遍;再向孔中加入含有10_4M地塞米松和10_5M胰岛素的DMEM全培养基,37°C培养I天;吸出孔中液体分别保存,用I XPBS将贴壁细胞洗3遍,力口入DMEM全培养基,37°C培养I天;吸出孔中液体分别保存,加入含有10_6M地塞米松和10_6M胰岛素的DMEM全培养基,37°C培养,每两天换一次培养液,培养8天。分别利用ELISA、免疫荧光(IFA)和PCR等方法检测细胞及细胞上清的乙肝病毒抗原。(I) ELISA检测细胞培养上清
用纯化乙型肝炎表面抗原(CHO-HBsAg)作为包被抗原,分别检测经HBV或抗原抗体复合物孵育后I天、2天、4天、6天、8天采集的细胞培养上清,其余同I. I. 5中(2)。(2)间接免疫荧光(IFA)检测将经过HBV或HBV+抗体孵育后的IfepG2细胞培养8天后制成抗原片,丙酮固定,-20°C固定30分钟;加入鼠单抗(I 1000)37°C孵育30分钟,洗净,吹干;按照1:30的比例,加入用1:30000稀释的伊文思兰溶液稀释的抗鼠Fe荧光抗体,37°C孵育30min,洗净,吹干。荧光显微镜检测拍照。(3) PCR 检测按试剂盒说明书操作,提取细胞染色体外DNA,取5 μ I作为模板,合成halfnest-PCR,引物如下
引物I :HBsAg 上游5’ -GACTGGGGACCCTGCACCGAAC-3’引物2 =Presl 上游5,-GGAAGATCTCCATGGGAGGTTGGTC-3’引物3 =Presl 下游5’ -CCGGAATTCTTAGGCCTGAGGATGAC-3’先用引物I和引物3作为外引物扩增出Presl+Pres2+S段基因,再用上述扩增产物为模板,以引物2和引物3为内引物扩增出Presl片段。I. I. 12非高变区氨基酸突变后获得的抗体对乙肝病毒抗性的研究基于HBIgG03重链可变区氨基酸序列,将SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第6位的Gly替换为Ala,将HBIgG03轻链可变区(SEQ ID No. I所示)的第8位的Thr替换为Gin。分别合成HBIgG03的重链编码核酸序列(在相应位置将密码子ggc替换为gcc)以及轻链编码核酸序列(在相应位置将密码子acc替换为cag)。按照上述I. I. 8 1. I. 11的方法,将轻链基因和重链Fd段克隆到pAC-K-Fc中,并转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达,并对该突变体进行免疫学检测。I. 2 结果I. 2. I人源抗乙肝病毒表面抗原抗体库的筛选成功构建4个Kappa库和4个Lambda库,库容量在IXlO7以上,轻重链插入率在95%以上。分别对Kappa子库和Lambda子库进行包装,用纯化乙肝表面抗原经过三轮筛选发现Kappa子库三轮筛选出现富集现象,洗脱库容逐渐增加,而Lambda子库并未出现,挑取400个Kappa子库克隆和200个lambda子库克隆,ELISA结果显示针对HBsAg阳性克隆有199个,全部来自Kappa子库,测序共发现20株序列不同的抗体克隆(表3)。表3抗体库包装和富集筛选产出量
包装库容賴库容(出歸)5^
(f; ^^挑选克隆阳性克隆
(cfWml) 一轮二轮二 if/T-TTM、列克隆
(ELISA)
Kappa 库 7xlOi3 5χ105 6χ106 4χ107 600 199 20 Lambda 库 8χ1013 5χ105 3χ105 2χ105 200_O_OI. 2. 2人源抗乙肝病毒表面抗原抗体的序列分析用DNASTAR序列分析软件对Fab片段进行分析处理,并与Internet V-Base基因库中的IgG序列进行比较,筛选出20株序列不同的Fab抗体,其重链可变区分类在VH4、VH1和VH3,其中主要为VH4,轻链可变区分类在VKl和VK3,并分别命名为HBFabOl到HBFab20。从轻重链可变区⑶R3区的氨基酸序列(表4)发现,从HBFab03到HBFab20重链均相同但轻链不同。其中,抗体HBFab03轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示,编码轻链可变区和编码重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 7所示;抗体HBFabl2轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ IDNo. 3和SEQ ID No. 4所示,编码轻链可变区和编码重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ IDNo. 7 和 SEQ ID No. 8 所示。表4人源抗乙肝病毒表面抗原Fab抗体互补决定区基因的氨基酸序列分析
权利要求
1.人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体HBFab03或其活性片段,其特征在于,其轻链高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3以及重链高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如下表所示
2.根据权利要求I所述的抗体HBFab03,其特征在于, i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示,或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列;以及 )其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示,或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.编码权利要求2所述抗体HBFab03的基因,其中编码轻链可变区和编码重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。
4.人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体HBFabl2或其活性片段,其特征在于,其轻链高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3以及重链高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如下表所示
5.根据权利要求4所述的抗体HBFabl2,其特征在于, iii)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQID No. 3所示,或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列;以及 iv)其重链可变区的氨基酸序列如SEQID No. 4所示,或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
6.编码权利要求5所述抗体HBFabl2的基因,其中编码轻链可变区和编码重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示。
7.权利要求I或4所述抗体或它们的活性片段经改造得到的单链抗体ScFv或全抗体免疫球蛋白IgG。
8.权利要求I或4所述抗体或它们的活性片段的制备方法,其特征在于,利用噬菌体表面展示技术,采集多个具有高滴度乙肝病毒表面抗原抗体者的外周血淋巴细胞,通过基因工程方法构建了人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体文库,并筛选获得特异性抗乙肝病毒表面抗原的基因工程抗体Fab段。
9.权利要求I或4所述抗体或它们的活性片段在制备预防或治疗乙肝病毒相关肝病的药物或诊断试剂中的应用。
10.含有权利要求I或4所述抗体或它们的活性片段的药物或诊断试剂。
全文摘要
本发明提供了利用噬菌体表面展示技术筛选获得的人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体HBIgG03(轻链和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)和HBIgG12(轻链和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示)。所述抗体能够特异性识别乙肝病毒表面抗原,可与乙肝病毒表面抗原发生显著的酶联免疫反应且具有抗乙肝病毒感染的中和活性功能。此外,可将本发明的抗体制成预防和治疗乙肝病毒相关肝病的特异性抗体药物,从而在临床中用于预防和治疗由乙肝病毒引起的肝病。
文档编号G01N33/569GK102863527SQ20121016783
公开日2013年1月9日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者梁米芳, 毕胜利, 孙丽娜, 郭瑜, 刘洋, 张福顺, 李川, 李德新 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
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