专利名称：生物内源性氧化剂的检测试剂及方法
技术领域：
本发明涉及用于检测生物内源性氧化剂的化学试剂以及检测方法。
背景技术：
通常将活性氧(ROS)和活性氮(RNS)作为具有强氧化性的非常小的无机或有机分子。有各种形式的ROS和RNS，包括自由基，如超氧化物自由基、羟基自由基、一氧化氮、二氧化氮和有机过氧化氢自由基，以及非自由基种类，如过氧化氢、单态氧、臭氧、亚硝酸、过氧亚硝酸和次氯酸。ROS和RNS是细胞呼吸的副产物。在正常条件下，ROS和RNS以非常低的水平存在，并在细胞信号传导中发挥重要作用。而在氧化应激期间，ROS和RNS水平急剧升高，这可能对各种生物分子如蛋白质、脂质和DNA造成严重损害。已知在许多人类疾病如心血管疾病、炎性疾病、代谢疾病、癌症和中枢神经系统疾病中会过量产生ROS和RNS。因此，迫切需要能够灵敏且选择性地测量、检测或筛选某些ROS和RNS的化学物质，以阐释其在体 外和体内的生理作用。在各种形式的ROS和RNS中，过氧亚硝酸和次氯酸的氧化能力最强，同时，对它们的高选择性检测对于清楚地解释它们的生理病理作用非常关键。在1990年，科学家首次发现生物体内的一氧化氮和超氧阴离子可以通过近扩散控制的加成反应生成内源性的过氧亚硝酸根(00N0-)I。进一步的研究揭示，一氧化氮(NO)的细胞毒性很大程度上由00N0-介导1-3。不论是以直接的方式还是间接地通过一系列的下游反应物质，过氧亚硝酸可以氧化各种底物，包括过渡金属中心、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和组氨酸等，或通过使酪氨酸硝化而修饰蛋白。过氧亚硝酸还可以诱导脂质过氧化，攻击DNA的核苷碱基和糖-磷酸酯骨架4-9。这些过程导致蛋白质失去功能，膜降解以及DNA损伤。当细胞损伤无法被主动修复时，即会发生细胞凋亡或坏死。过氧亚硝酸与各种病理状态(如心血管疾病、循环休克、炎症、癌症、中风、再输灌损伤、神经退行性疾病和糖尿病)之间的关联现已明确建立起来7。因此，准确检测细胞的过氧亚硝酸水平对于疾病诊断及相关病理生理学的探究有重要意义。过氧亚硝酸可以硝化游离的或蛋白质中的酪氨酸，因此，可以通过细胞硝基酪氨酸的免疫组织学的方法来测量00N0-的水平10-11。但是，这种方法有缺陷。首先酪氨酸可以通过其它机理被硝化12-15，这会导致实际测量值偏高。同时，该方法无法提供高分辨率的时空信息。基于发光，尤其是基于荧光的技术已逐渐成为生物、医学领域的常规技术手段。在早期的研究中用到的荧光探针如二氢二氯荧光素(DHDCF)及其双乙酸酯衍生物和二氢罗丹明(DHR)等选择性很差16-21。因此，解读这些研究数据时须得小心，以避免得出错误的结论22。化学发光探针也有相同的问题23-25。最近报道了几类00N0—的小分子荧光成像剂，包括罗丹明B hydroazide26，HPF/APF27，NiSPY系列28，HKGreen系列29-31，频哪醇硼酸酯32-33，BzSeO-Cy34-35以及CyPSe36。其中HPF和APF已经商品化。，HKGreen系列与DHDCP和DHR相比，选择性有所提高，并在一些生物医学研究中得到应用38-39。但是，针对高氧化性物质(包括C10_和HO’)的高选择性仍然是个问题。此外，多通道探针允许自动校准，并避免了脱色、不均匀的探针负载以及不均匀的激发等所致的复杂性40-41。显而易见，有必要开发多信号通道小分子探针。
发明内容
本发明提供一类新颖的荧光探针，以测量、检测或筛选活性氮(RNS)或活性氧(ROS), ia 1OyO2^NCKH2Oy 0H、0Cr、0N0(T和烷基过氧化氢自由基(R00 )等。所述探针特别对过氧亚硝酸(0N00_)和次氯酸(C10_)具有高选择性，能给出敏感的、比例型、多通道的荧光信号，并可应用于细胞显微成像实验中。具体而言，本发明的荧光探针具有通式I所示的结构
权利要求
1.具有通式I或II结构的化合物
2.如权利要求I所述的化合物，其特征在于，所述通式I或II中，!^、民和&各自独立选自H、C1-C6烷基、链烯基、炔基、卤素、C1-C6烷氧基、氨基、羟基、卤素取代的C1-C6烷基和卤素取代的C1-C6烷氧基；和 R4选自H、C1-C6烷基、卤素、羟基和链烯基。
3.如权利要求I或2所述的化合物，其特征在于，所述通式I或II中，R5、R7和R8各自独立选自氣，C1-C6烧基，酸基，齒素，链稀基，烧氧基，轻烧基，氣基，轻基，和齒素取代的烧基。
4.如权利要求I一 3中任一项所述的化合物，其特征在于，所述通式I中，R9选自H、卤素和C1-C6烷基。
5.如权利要求I一 4中任一项所述的化合物，其特征在于，所述通式I中，RpRyRpR5'R8SH, R2SC1-C6烷基，R6为羟基、氨基和N(R)2, R7和R9各自独立为H和卤素，以及R为C1-C6烷基； 所述通式II中，R1^ R3> R4> R5> R8为H，R2为C1-C6烷基，R6为羟基、氨基和N(R)2, R7为H或卤素，以及R为C1-C6烷基。
6.如权利要求I所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自以下化合物I一 5和Ia :
7.—种检测用组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的化合物。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于测量、检测或筛选活性氧(ROS)和活性氮(RNS)。
9.一种测量样品中的活性氧(ROS)和/或活性氮(RNS)的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤 a)使权利要求1-6中任一项所述通式I和/或II化合物或权利要求7所述组合物接触样品，以形成荧光化合物；和 b)测量所述荧光化合物的荧光特性，从而根据所述荧光特性测定样品中的活性氧和/或活性氮。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述活性氧选自JOyO/'ROO 、‘0H、C10 —和H2O2 ;所述活性氮选自一氧化氮、二氧化氮、亚硝酸和过氧亚硝酸。
全文摘要
本发明涉及用于检测生物内源性氧化剂的化学试剂以及检测方法。具体而言，本发明涉及如下通式I,II的化合物及使用所述化合物检测生物内源性氧化剂如活性氧和活性氮的方法。本发明化合物特别对过氧亚硝酸(ONOO-)和次氯酸(ClO-)具有高选择性，能生成荧光染料，发送敏感的、比例型、多通道的荧光信号，并可应用于细胞显微成像实验中。
文档编号G01N21/64GK102807543SQ201210181179
公开日2012年12月5日 申请日期2012年6月4日 优先权日2012年6月4日
发明者杨有军, 张泉娟, 钱旭红 申请人:华东理工大学