基因多态性检测方法

专利名称：基因多态性检测方法
技术领域：
本发明涉及使用用具有相同或者接近的检测波长的荧光染料修饰的多种寡核苷酸、在一种波长下检测多种基因多态性的方法。
背景技术：
存在很多使用用荧光染料标记的探针来分析靶标核酸的突变的方法。专利文献I中记载了如下方法用PCR扩增含有突变的区域之后，使用用荧光染料标记的核酸探针来进行熔解曲线分析，基于熔解曲线分析的结果来分析突变的方法。在专利文献I中，如权利要求13中记载的“在至少与核酸测定用的新型核酸探针的种类的数量相同种类的数量的波长下进行测定”那样，在使用多种探针的情况下，使用了用波长互不相同的突光染料标记的探针。 在专利文献2中，记载了用固相化的探针检测基因突变的方法，如权利要求8中记载的“结合了发出不同波长的荧光的多种荧光物质”那样，在使用多种探针的情况下，使用了用波长互不相同的荧光染料标记的探针。如此，在专利文献1、2中，使用多种探针的情况下，使用了用波长互不相同的荧光染料标记的探针。在专利文献1、2中，需要与探针的数量(S卩，想要检测的突变的数量)相同数量以上的不同荧光波长。但是，在测定装置能够检测的荧光波长的种类上存在限制的情况下、或者在探针上能够修饰的荧光分子的种类上存在限制的情况下，能够测定的突变的数目也受到限制。另外，在这样的情况下，需要使用不同的试剂多次测定不同的基因突变，需要工时和成本。现有技术文献专利文献专利文献I :日本专利文献特开2002-355084号公报；专利文献2 :日本专利文献特开2006-166808号公报。

发明内容
发明要解決的问题本发明的课题为即使在测定装置能够检测的荧光波长的种类上存在限制的情况下、或者在探针上能够修饰的荧光分子的种类上存在限制的情况下，也能够一次测定多种不同的基因多态性的方法。用于解决问题的手段本发明人发现，将用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记、并且被设计为Tm值为相互接近的温度的多种探针添加到一个反应系统中，能够在一种波长下同时检测多种基因多态性，从而完成了本发明。即，本发明如下所述。
(I) 一种使用用荧光染料标记并与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸来同时检测多种基因多态性的方法，其特征在于，标记所述多种寡核苷酸的荧光染料为具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料，所述多种寡核苷酸被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，所述多种寡核苷酸分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3°C以上，并且在一种波长下同时检测多种基因多态性。(2)根据(I)所述的方法，其中，所述多种寡核苷酸的、针对含有第一基因型的序列的Tm值之差为(TC 4°C。 (3)根据(I)所述的方法，其中，所述多种寡核苷酸的、针对含有第一基因型的序列的Tm值之差为(TC 2°C。(4)根据(I)所述的方法，其中，所述多种寡核苷酸的、针对含有第一基因型的序列的Tm值之差为(TC 1°C。(5) 一种基因多态性的检测方法，其中，同时或者连续进行(I) ⑷中任一项所述的基因多态性的检测方法、以及使用了所述相同或者接近波长之外的一种以上的荧光染料检测波长的基因多态性的检测方法。(6) 一种基因多态性检测方法，其中，同时或者连续进行(I) ⑷中任一项所述的基因多态性的检测方法、以及使用了所述相同或者接近波长之外的两种以上的荧光染料检测波长的基因多态性的检测方法。(7)根据(I) ￠)中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，含有所述第一基因型的序列为野生型序列，含有所述第二基因型的序列为相对于野生型序列具有一个碱基以上的取代突变、插入突变、缺失突变的序列。(8)根据(I) (7)中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，所述寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出，并且在与靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。(9)根据⑶所述的基因多态性检测方法，其中，所述寡核苷酸为与靶标序列杂交时荧光强度减少的多态性检测用探针。(10) 一种试剂盒，其为在一种波长下同时检测多种基因多态性的试剂盒，包含包括用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记的多种寡核苷酸的多态性检测用探针，所述多种寡核苷酸被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，所述多种寡核苷酸分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3°C以上。(11) 一种预测个体中的药效或体质的方法，包括使用⑴ (9)中任一项所述的基因多态性检测方法来测定与药效或体质相关的多态性的有无。
(12) 一种基因多态性检测装置，其特征在于，包括容纳有与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸的反应部；将试样和/或反应液供给至所述反应部的送液部；向所述反应部照射用于激发荧光的光的光源部；控制所述反应部的温度的控制部；以及检测荧光的检测部，所述多种寡核苷酸用具有相互相同或者接近的检测波 长的荧光染料标记，并被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，并且分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3°C以上。(13) 一种基因多态性判定系统统，其特征在于，包括容纳有与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸的反应系统；向所述反应系统供给试样和/或反应液的送液系统；向所述反应系统照射用于激发突光的光的光源系统；控制所述反应系统的温度的控制系统；检测荧光的检测系统；以及基于检测结果来判定多态性的判定系统，所述多种寡核苷酸用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记，并被设计为针对含有多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，并且分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和含有第二基因型的序列的Tm值相隔3°C以上。发明的效果通过本发明的方法，即使在使用能够检测的波长的种类较少的装置的情况下、或者能够修饰探针的荧光分子的种类较少的情况下，也能够一次检测多种多态性。


图IA不出实施例I的Tm分析中每单位时间的Pacific Blue和BODIPY FL的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)和温度的关系(左图表示Pacific Blue的变化量，右图表示BODIPY FL的变化量)，其中，探针使用了 3PB-EGFR-insWT-R5(序列编号
9)、3PB-EGFR-insWT-F4(序列编号 10)和 3FL-EGFR-ins7_Fl (序列编号 11)，模板使用了EGFR-e20-ins-WT-F (序列编号1)，荧光染料使用了 Pacific Blue和BODIPY FL0纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)、横轴为温度(°C)。在以下的图中示出用不同模板的组合进行同样的实验的结果。图IB示出实施例I的、模板使用了 EGFR-e20-ins9-F(序列编号2)时的结果。图IC示出实施例I的、模板使用了 EGFR-e20-insCAC-R3(序列编号14)时的结果。图ID示出实施例I的、模板使用了 EGFR-e20-insTGCGTG-F (序列编号4)时的结果。图IE示出实施例I的、模板使用了 EGFR-e20-insAACCCC-R6 (序列编号16)时的结果。
图IF示出实施例I的、模板使用了 EGFR-e20-insCCCCAC_R7 (序列编号17)时的结果。图IG示出实施例I的、模板使用了 EGFR-e20-insAACCCCCAC-R8 (序列编号18)时的结果。图IH示出实施例I的、模板使用了 EGFR-e20-insCACGTG-R9 (序列编号19)时的结果。图2A示出实施例2的Tm分析中每单位时间的Pacific Blue的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)和温度的关系，其中探针使用了 3PB-858-G-PM(序列编号20)和3PB-3A4-G-PM(序列编号21)、模板使用了 100%的858_mm(序列编号22)和100%的 3A4-mm(序列编号24)、荧光染料使用了 Pacific Blue。纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(°C)。在以下的图中示出用与不同模板的组合进行同样的实验的结果。图2B示出实施例2的、模板使用了 50 %的858_mm(序列编号22)、50 %的858-PM(序列编号23)和100%的3A4_mm(序列编号24)时的结果。图2C示出实施例2的、模板使用了 90 %的858_mm(序列编号22)、10 %的858-PM(序列编号23)和100%的3A4_mm(序列编号24)时的结果。图2D示出实施例2的、模板使用了 100 %的858_mm(序列编号22)、50 %的3A4-mm(序列编号24)和50%的3A4_PM(序列编号25)时的结果。图2E示出实施例2的、模板使用了 100 %的858_mm(序列编号22)、90 %的3A4-mm(序列编号24)和10%的3A4_PM(序列编号25)时的结果。图3A示出实施例3的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)和温度的关系，其中，探针使用了 3T-719-G-PM(序列编号26)、3T-858-G-PM(序列编号27)和3T-790-T-PM(序列编号28)，模板使用了 100%的719-G (序列编号29)、100 %的858-G (序列编号31)和100 %的790-T (序列编号33)，荧光染料使用了TAMRA0纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)、横轴为温度(V )。在以下的图中示出以不同模板的组合进行同样的实验的结果。图3B示出实施例3的、模板使用了 50 %的719-G (序列编号29)、50 %的719-C (序列编号30)、100%的858-6(序列编号31)和100%的790-T(序列编号33)时的结果。图3C示出实施例3的、模板使用了 100 %的719-G (序列编号29)、50 %的858-G(序列编号31)、50%的858-1'(序列编号32)和100%的790-T(序列编号33)时的结果。图3D示出实施例3的、模板使用了 100 %的719-G (序列编号29)、100 %的858-G(序列编号31)、50%的790-T (序列编号33)、和50%的790-C(序列编号34)的情况下的结果。图4A示出实施例4的Tm分析中每单位时间的TAMRA、Pacific Blue和BODIPYFL的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)和温度的关系(左图表示Pacific Blue的变化量，中间的图表示BODIPY FL的变化量，右图表示TAMRA的变化量)，其中，探针使用了 3T-719-G-PM(序列编号 26)、5PB-V12M_A_PM(序列编号 35)、3PB-UGT-T-PM(序列编号36)、5FL-Q126X-T-PM(序列编号 37)和 3FL-NAT-C-PM(序列编号 38)，模板使用了 100%的V12M-PM (序列编号 39)、100% 的 UGT-PM (序列编号 41)、100% 的 Q126X-PM (序列编号 43)、100%的NAT-mm(序列编号46)和100%的719_mm (序列编号30)，荧光染料使用了 TAMRA、Pacific Blue和BODIPY FL0纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(V)。在以下的图中示出用不同的模板的组合进行同样的实验的结果。图4B示出实施例4的、模板使用了 50 %的V12M_PM(序列编号39)、50 %的V12M-mm (序列编号 40)、100% 的 UGT-PM (序列编号 41)、100% 的 Q126X-PM (序列编号 43)、100%的NAT-mm(序列编号46)和100%的719_mm(序列编号30)时的结果。图4C示出实施例4的、模板使用了 100%的V12M-PM(序列编号39)、50%的UGT-PM (序列编号41)、50%的UGT-mm(序列编号42)、100%的Q126X_PM(序列编号43)、100%的NAT-mm(序列编号46)和100%的719_mm(序列编号30)时的结果。图4D示出实施例4的、模板使用了 100%的V12M-PM(序列编号39)、100%的UGT-PM(序列编号 41)、50% 的 Q126X-PM(序列编号 43)、50% 的 Q126X_mm(序列编号 44)、100%的NAT-mm(序列编号46)和100%的719_mm(序列编号30)时的结果。 图4E示出实施例4的、模板使用了 100%的V12M-PM(序列编号39)、100%的UGT-PM (序列编号41)、100%的Q126X-PM(序列编号43)、50%的NAT-PM (序列编号45)、50%的NAT-mm(序列编号46)和100%的719_mm(序列编号30)时的结果。图4F示出实施例4的、模板使用了 100%的V12M-PM(序列编号39)、100%的UGT-PM(序列编号 41)、50% 的 Q126X-PM(序列编号 43)、50% 的 Q126X_mm(序列编号 44)、100%的NAT_mm(序列编号46)、50*%的719_PM(序列编号29)和50%的719_mm(序列编号30)时的结果。
具体实施例方式〈1>本发明的多态性检测方法本发明的多态性检测方法是使用用荧光染料标记并与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸来同时检测多种基因多态性的方法，其特征在于，标记所述多种寡核苷酸的荧光染料为具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料，所述多种寡核苷酸设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，所述多种寡核苷酸分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3°C以上，在一种波长下同时检测多种基因多态性。本发明中的基因多态性是指基因上的特定的位置处的碱基的类型有多种，多态性的例不有喊基取代、插入或缺失一个以上的喊基等。本发明中的“多种多态性”包含检测一个基因上的多种多态性的情况以及对多种基因检测每一个基因多态性的情况这两个方面。本发明的方法中，使用用相互具有相同或者接近的检测波长的荧光染料标记，分别与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸。以使用两种寡核苷酸的情况为例进行说明，寡核苷酸I与第一多态性区域杂交，寡核苷酸2与第二多态性区域杂交，标记寡核苷酸I的荧光染料和标记寡核苷酸2的荧光染料具有相互相同或者接近的检测波长。这里，接近是指在检测荧光值时受到对测定结果产生影响的干涉的波长区域。该接近的波长区域根据荧光染料的组合而不同，例如检测波长(最大波长)的差为200nm以内，IOOnm以内，50nm以内或30nm以内。作为如此检测波长接近的荧光染料的组合，例如有BODIPY FL和 FAM、B0DIPY FL和 TRITC、Pacific Blue和 Alexa Fluor 405、TAMRA和 AlexaFluor 670、TAMRA 和 Alexa Fluor 700、TAMRA 和 Texas Red 等。即，在本发明的方法中，不一定要使用相同的荧光染料，若用具有接近的检测波长的荧光染料来标记各寡核苷酸，也能够在一种波长下同时检测多种多态性。本发明的一种波长不仅是指相同波长，而且也指所述接近的波长范围。此外，具有相同的检测波长的情况通常是指多种寡核苷酸用相同的荧光染料标
记。 此外，在本发明的方法中，只要在一种波长下进行多种基因多态性的检测，也可以同时或者连续使用用具有一种或者两种以上的其他(除所述相同或者接近之外)的检测波长的荧光染料标记的一种或者两种以上的探针进行基因多态性(与所述多种基因多态性不同的基因多态性)的检测。即，只要在一种波长下进行多种基因多态性的检测，也可以同时或者连续进行在其他的一种或者两种以上的波长下的基因多态性的检测。在本发明的方法中，使多种寡核苷酸对含有第一基因型的序列的Tm值集中到接近区域。这里，优选接近的温度区域是指多种寡核苷酸的各个对含有第一基因型的序列的Tm值之差例如为(TC 4°C，0°C 2°C或(TC 1°C。另外，多种寡核苷酸分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值分别相隔例如3°C以上，5°C以上，或10°C以上。以使用与第一多态性区域杂交的寡核苷酸I和与第二多态性区域杂交的寡核苷酸2这两种寡核苷酸的情况为例进行说明(此外，寡核苷酸可以使用三种以上)。针对第一多态性区域的第一基因型(例如野生型)的寡核苷酸I的Tm值和针对第二多态性区域的第一基因型(例如野生型)的寡核苷酸2的Tm值的温度差例如为0°C
4。。，(TC 2。。，或(TC I。。。并且，针对第一多态性区域的第一基因型(例如野生型)的寡核苷酸I的Tm值和针对第一多态性区域的第二基因型(例如突变型)的寡核苷酸I的Tm值的温度差为例如为3°C以上，5°C以上，或10°C以上。另外，针对第二多态性区域的第一基因型(例如野生型)的寡核苷酸2的Tm值和针对第二多态性区域的第二基因型(例如突变型)的寡核苷酸2的Tm值的温度差例如为3°C以上，5°C以上或10°C以上。此外，针对第一多态性区域的第二基因型(例如突变型)的寡核苷酸I的Tm值和针对第二多态性区域的第二基因型(例如突变型)的寡核苷酸2的Tm值的温度差可以为(TC，但为了判别两种突变，例如1°C以上。在含有第一基因型的序列为野生型序列、含有第二基因型的序列为相对于野生型序列具有I个碱基以上的取代突变、插入突变和/或缺失突变的突变型序列的情况下，将针对野生型序列的峰集中在一定温度区域，使得能够不检测针对野生型的峰，而检测突变型序列。S卩，由于野生型的Tm值包含在一定温度区域内，因此通过检测对应于突变型的、从野生型的Tm值变化了的峰，能够检测突变型的有无。S卩，通过预先针对含有第一基因型的序列将熔解曲线分析的峰(即Tm值)集中到一定的温度区域，使得即使不针对含有第一基因型的序列测定熔解曲线分析的峰，也能够通过测定含有第二基因型的序列的峰(优选的是，如上所述，从含有第一基因型的序列的峰变化了 3°C以上的峰)，来测定突变。例如，作为寡核苷酸，选择含有与含第一基因型(野生型)的序列100%匹配、与含第二基因型(突变型)的序列错配的序列，如上所述，使针对含有第一基因型的序列的Tm值比针对含有第二基因型的序列的Tm值高3°C以上、优选高5°C以上，更优选高10°C以上。或者，也可以选择如下探针序列含有与含第一基因型(野生型)的序列错配、与含第二基因型(突变型)的序列100%匹配的探针序列，针对含有第一基因型的序列的Tm 值比针对含有第二基因型的序列的Tm值低3°C以上、优选低5°C以上，更优选低10°C以上。此外，第一基因型和第二基因型可以均为突变型。在含有第一基因型的序列和含有第二基因型的序列均为突变型序列的情况下，也能够检测相对于含有第一基因型的序列，含有第二基因型的序列是否还含有突变。本发明的方法中使用的与含有基因多态性的区域杂交的寡核苷酸，例如可以使用日本专利文献特开2001-286300号公报和特开2002-119291号公报等中记载的末端部用荧光染料标记的淬灭探针。这样的寡核苷酸探针例如与未与靶标序列杂交时相比，与靶标序列杂交时荧光染料的荧光减少或增加。本发明中的寡核苷酸探针例如在未杂交时荧光染料的荧光发光、而杂交时荧光染料的荧光淬灭的淬灭探针。作为本发明的寡核苷酸探针的长度，无特别限制，但为了在含有第一基因型的序列和含有第二基因型的序列之间获得Tm值的差，例如为40碱基长以下，例如11 40碱基长、12 30碱基长、15 30碱基长或18 30碱基长。作为本发明中使用的用于检测基因多态性的探针的碱基序列的示例，例如可以举出序列编号9 11、序列编号20 21、序列编号26 28、序列编号35 38所示的探针。作为荧光染料，可以使用日本专利文献特开2001-286300号公报和特开2002-119291号公报等中记载的荧光染料，作为具体例，可以举出Pacific Blue、FAM、TAMRA.BODIPY FL等。将荧光染料结合至寡核苷酸的方法，可以按照通常的方法、例如特开
2001-286300号公报和特开2002-119291号公报中记载的方法来进行。本发明的方法只要是使用上述寡核苷酸探针的方法则无特别限制，例如可以通过熔解曲线分析来分析基因多态性。本发明方法使用用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记的多种寡核苷酸探针，并且该多种寡核苷酸探针分别被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值相互接近的温度，针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3°C以上，除此之外，能够按照通常的熔解曲线分析(Tm分析)的方法来进行。熔解曲线分析例如可以按照特开2001-286300号公报和特开
2002-119291号公报中记载的方法来进行。在熔解曲线分析中，在检测突变型的峰时，可以得出存在突变的结论。
另外，本发明的方法也可以含有在检测基因多态性之前或者与检测基因多态性同时扩增核酸。作为核酸扩增的方法，例如为使用聚合酶的方法，作为其示例，可以举出PCR、ICAN、LAMP等。在通过使用聚合酶的方法来进行扩增的情况下，例如在本发明探针的存在下来进行扩增。根据使用的探针，来调节扩增的反应条件等，对本领域技术人员来说是容易的。由此，由于仅在核酸扩增后分析探针的Tm值，因此在反应结束后不需要精制扩增产物等。因此，不用担心扩增产物带来污染。另外，由于能够在与扩增所需的仪器相同的仪器内进行检测，因此不需要移动容器。因此也容易自动化。在本发明中，试样中的DNA可以是单链DNA，也可以是双链DNA。在所述DNA为双链DNA的情况下，例如，包括在所述杂交步骤之前，通过加热使所述试样中的双链DNA解离的步骤。通过将双链DNA解离成单链DNA，使得能够在下一杂交步骤中，与检测用探针杂交。作为进行核酸扩增时的模板的核酸，只要含有核酸则无特别限制，例如血液、口腔 粘膜悬浮液、指甲或毛发等的体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋组织、胃液、胃洗涤液、腹膜液、羊水、细胞培养等任意的源自或者可以源自生物学起源的物质。作为模板的核酸可以从该起源得到后直接使用，或者为了改变所述样品的特性而经前处理之后使用。除了测定本发明探针的荧光染料的荧光之外，Tm分析可以按照通常的方法进行。荧光的测定可以通过使用与荧光染料对应的波长的激发光测定发光波长的光来进行。Tm分析中的升温速度通常为0. I 1°C /秒。进行Tm分析时的反应液的组成只要探针和具有与其碱基序列互补的序列的核酸能够杂交则无特别限制，通常一价阳离子浓度为I. 5 5mM、pH为7 9。PCR等使用DNA聚合酶的扩增方法的反应液通常满足该条件，因此可以将扩增后的反应液直接用于Tm分析。基于Tm分析的结果的基因多态性的检测可以按照通常的方法进行。本发明中的检测包含突变的有无的检测和突变的量的检测。此外，通过本发明的多态性检测方法能够检测基因多态性，基于检测到的多态性的有无，能够判断与药效或体质相关的多态性的有无，并预测个体中的药效或体质。例如，在EGFR exon20 insertion的基因多态性的情况下，能够判定作为抗癌剂的吉非替尼(gefitinib)的有效率。〈2>本发明试剂盒本发明试剂盒是为在本发明的多态性检测方法中使用的试剂盒。S卩，本发明的试剂盒的特征在于，其为在一种波长下同时检测多种基因多态性的试剂盒，包含包括用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记的多种寡核苷酸的多态性检测用探针，所述多种寡核苷酸分别被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，并被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3°C以上。本发明检测试剂盒除了上述探针之外，还可以含有进行核酸扩增所需的试剂类，尤其可以含有用于使用DNA聚合酶的扩增的引物。在本发明检测试剂盒中，探针、引物及其他的试剂类可以单独被容纳，也可以将它们的一部分制成混合物。〈3>本发明装置
本发明装置是用于在基因多态性检测方法中使用的装置，具体地，其特征在于，包括容纳有与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸的反应部；将试样和/或反应液供给至所述反应部的送液部；向所述反应部照射用于激发荧光的光的光源部；控制所述反应部的温度的控制部；以及检测荧光的检测部，所述多种寡核苷酸如〈1>中本发明的多态性检测方法中说明的那样，用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记，并被设计为针对含有多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值相互接近的温度，并且分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3°C以上。反应部中可以固定有所述多种寡核苷酸，也可以形成为在即将使用之前设置固定有所述多种寡核苷酸的基板。送液部可以是能够同时输送含有基因的试样和反应液，也可以能够分别输送。另夕卜，也可以形成为能够输送清洗液等。
光源部只要是能够照射与标记寡核苷酸的荧光染料相对应的激发波长的光源即可，在同时或连续使用用具有一种或者两种以上的其他(所述相同或者接近之外)的检测波长的荧光染料标记的一种或者两种以上的探针进行基因多态性(与所述多种基因多态性不同的基因多态性)的检测的情况下，也可以并用能够照射其他的激发波长的一种或两种以上的光源。控制部例如能够以一定的速度升高或降低反应部的温度，并且能够保持在一定的温度。检测部只要能够在与标记寡核苷酸的荧光染料对应的相同或接近的检测波长下进行检测即可，在同时或者连续使用用具有一种或者两种以上的其他(所述相同或者接近之外)的检测波长的荧光染料标记的一种或两种以上的探针进行基因多态性(与所述多种基因多态性不同的基因多态性)的检测的情况下，也可以形成为能够检测其他的检测波长。另外，也可以将检测对象仅设为第二基因型，仅检测含有第二基因型的序列的峰(例如从含有第一基因型的序列的峰变化了 3°C以上的峰)。〈4>本发明系统本发明系统是用于在基因多态性检测方法中使用的系统，具体地，其特征在于，包括容纳有与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸的反应系统；向所述反应系统供给试样和/或反应液的送液系统；向所述反应系统照射用于激发突光的光的光源系统；控制所述反应系统的温度的控制系统；检测荧光的检测系统；以及基于检测结果来判定多态性的判定系统，所述多种寡核苷酸如在〈1>中本发明的多态性检测方法中说明的那样，用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记，并被设计为针对含有多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，并且分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和含有第二基因型的序列的Tm值相隔3°C以上。反应系统、送液系统、光源系统、控制系统、检测系统能够使用所述的本发明装置。另外，判定系统可以是连接在本发明装置上的、基于输入的检测结果来输出多态性的类型的判定或突变的有无等的计算机之类的系统。实施例以下，举出实施例来具体说明本发明，但是本发明不限于以下的实施例。
实施例I (用三种探针和两种波长检测EGFR exon20 insertion的模板寡核苷酸的情况)EGFR exon20 insertion中，除了野生型(以下WT)之外,还已知下述7个广范围的突变。据说EGFR exon20 insertion上带有突变的患者的吉非替尼有效率为0%，因此有必要检测EGFR exon20 insertion的突变型(以下mt)。序列编号I所示的序列表示NM_005228. 3GENE ID :1956中碱基编号2530-2579。表I ·
权利要求
1.一种使用用荧光染料标记并与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸来同时检测多种基因多态性的方法，其特征在于， 标记所述多种寡核苷酸的荧光染料为具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料， 所述多种寡核苷酸被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度， 所述多种寡核苷酸分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3°C以上，并且 在一种波长下同时检测多种基因多态性。
2.根据权利要求I所述的方法，其中，所述多种寡核苷酸的、针对含有第一基因型的序列的Tm值之差为(TC 4°C。
3.根据权利要求I所述的方法，其中，所述多种寡核苷酸的、针对含有第一基因型的序列的Tm值之差为(TC 2°C。
4.根据权利要求I所述的方法，其中，所述多种寡核苷酸的、针对含有第一基因型的序列的Tm值之差为(TC 1°C。
5.一种基因多态性的检测方法，其中，同时或者连续进行 权利要求I 4中任一项所述的基因多态性的检测方法、以及 使用了所述相同或者接近波长之外的一种以上的荧光染料检测波长的基因多态性的检测方法。
6.一种基因多态性检测方法，其中，同时或者连续进行 权利要求I 4中任一项所述的基因多态性的检测方法、以及 使用了所述相同或者接近波长之外的两种以上的荧光染料检测波长的基因多态性的检测方法。
7.根据权利要求I 6中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，含有所述第一基因型的序列为野生型序列，含有所述第二基因型的序列为相对于野生型序列具有一个碱基以上的取代突变、插入突变、缺失突变的序列。
8.根据权利要求I 7中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，所述寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出，并且在与靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。
9.根据权利要求8所述的基因多态性检测方法，其中，所述寡核苷酸为与靶标序列杂交时荧光强度减少的多态性检测用探针。
10.一种试剂盒，其为在一种波长下同时检测多种基因多态性的试剂盒，包含包括用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记的多种寡核苷酸的多态性检测用探针， 所述多种寡核苷酸被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度， 所述多种寡核苷酸分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3°C以上。
11.一种预测个体中的药效或体质的方法，包括使用权利要求I 9中任一项所述的基因多态性检测方法来测定与药效或体质相关的多态性的有无。
12.—种基因多态性检测装置，其特征在于，包括 容纳有与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸的反应部；将试样和/或反应液供给至所述反应部的送液部； 向所述反应部照射用于激发荧光的光的光源部； 控制所述反应部的温度的控制部；以及 检测荧光的检测部， 所述多种寡核苷酸用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记，并被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，并且分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3°C以上。
13.—种基因多态性判定系统统，其特征在于，包括 容纳有与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸的反应系统； 向所述反应系统供给试样和/或反应液的送液系统； 向所述反应系统照射用于激发突光的光的光源系统； 控制所述反应系统的温度的控制系统； 检测荧光的检测系统；以及 基于检测结果来判定多态性的判定系统， 所述多种寡核苷酸用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记，并被设计为针对含有多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，并且分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和含有第二基因型的序列的Tm值相隔3°C以上。
全文摘要
本发明的课题是提供基因多态性检测方法即使在测定装置能够检测的荧光波长的种类上存在限制的情况下或者在探针上能够修饰的荧光分子的种类上存在限制的情况下，也能够一次测定多种不同的基因多态性。解决手段一种使用多种用荧光染料标记并与含有基因多态性的区域杂交的寡核苷酸同时检测多种基因多态性的方法，其特征在于标记该多种苷酸的荧光染料为具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料，该多种寡核苷酸被设计为针对含有该多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，该多种寡核苷酸分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上，并在一种波长下同时检测多种基因多态性。
文档编号G01N21/64GK102808020SQ201210181280
公开日2012年12月5日 申请日期2012年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者井口亚希 申请人:爱科来株式会社