专利名称：蛋白c(pc)测定试剂盒(发色底物法)的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种发色底物法检测蛋白C活性的试剂盒。
背景技术：
蛋白C (简称PC)是ー种维生素K依赖性蛋白，在Ca2+存在的条件下，能被凝血酶-凝血酶调节蛋白激活转化成有活性的蛋白C (简称APC)。APC能通过蛋白水解作用灭活活化的凝血因子V a (简称F V a)和VDI a (简称F VDI a)，从而显示出较强的抗凝活性；同时通过释放血管血纤维蛋白溶酶原激活剂来促进纤溶。PC的缺乏会使人体的凝血及纤溶平衡受影响，使凝血亢进，从而发生血栓性疾病。血浆PC水平的降低易引起弥散性血管内凝血(DIC)和肝脏疾病，如肝硬化和慢性肝炎。近年来，人们发现许多临床疾病均可伴随PC水平的改变，如肾功能衰竭、外科手木、 炎性反应、ロ服抗维生素K类抗凝药、缺血性心脏疾病、脑血管疾病、静脉血栓形成以及白血病等。由此可见，很有必要建立一种能准确检测血浆中PC活性的简便方法，用于上述各类疾病的辅助诊断。根据检测原理，目前用于定量检测蛋白C的方法可归纳为三大类(I)根据PC的抗原特性而形成的免疫学方法，包括双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析法、火箭免疫电泳法等，其中使用最为广泛的是ELISA法，通过采用单抗或多抗进行抗原-抗体反应来检测PC抗原含量。该方法能够准确检测PC抗原含量，但是存在着一定的缺陷。首先，需要高度纯化的PC来获得特异性抗体，因为不纯的抗原中所含血浆蛋白杂质会导致抗体的专ー性不强，这会使得检测结果偏高；其次，该方法操作繁琐，检测时间很长，不能满足急诊和临床病人及时诊断和治疗的需要；最后，该方法还有ー定的局限性，它同时也检测了 PC的病理形态，如与抑制剂连接的或灭活的PC，因此不能准确判断所检测的PC是否有正常活性。(2)根据PC抗凝活性形成的APTT凝固法。该方法使用蛇毒激活PC后，加入到血浆凝固体系中，能够延长血浆凝固时间，延长比例对应着样品中PC含量。该方法能专ー性检测功能性PC，但是该方法的干扰因素多，检测结果变数较大，其结果的判断往往以检验人员的经验而定，直接影响测定结果的准确性和重复性。(3)采用APC专ー性的合成多肽作为底物的酶学方法，即发色底物法。早期采用凝血酶-凝血酶调节蛋白(T-TM)作为激活剂。该方法不能直接检测血浆中的PC活性，因为血浆中包含有PC抑制剂和其他干扰物质，易在活性检测过程中与合成肽底物反应。因此，必须事先通过抗体柱或吸附将PC从血浆中分离出来，这ー过程不仅需要大量的血浆，而且也需要大量的时间及人力，该方法不适用于大批量样品的快速处理。目前，国外已开发使用蛇毒激活剂代替T-TM，它能快速激活人和牛血浆PC，激活机制可能与凝血酶类似，但不受其它凝血因子的干扰，也不水解底物。它的快速激活作用使得PC抑制剂的作用降至最低，并因此排除了吸附分离PC的必要性，从而加速PC活化过程，克服了用T-TM作激活剂时激活时间太长，操作繁琐的缺陷。
目前，蛋白C活性定量检测的方法主要采用发色底物法，该方法能准确、特异地反映PC活性，不仅结果真实稳定，而且操作简便易行，具有快速的优点，只需数分钟就能完成检测。但由于目前市售的此类试剂盒中所采用的激活剂绝大多数是从铜头蝮蛇(Agkistrodon contortrix)毒中分离纯化而得,该种类蛇多分布在美国东南部及墨西哥东北部，国内对于该蛇毒的获得比较困难，因此这种激活剂无法在国内大批量生产和应用。近期，有文献报道从皖南蝮蛇蛇毒中分离提纯的PC激活剂具有用于临床PC活性检测的前景，但实验证明该激活剂对血浆中其它凝血因子有部分激活，易受多种因素干扰，特异性相对较低，目前该激活剂还未能够应用到PC測定试剂盒中。以上种种弊端使得PC检测难以在医院推广使用，从而限制了该检测项目的常规开展。因此，迫切需要开发ー种新的PC激活剂用于PC活性测定试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种蛋白C活性检测试剂盒，该试剂盒基于中国秦岭蝮蛇 蛇毒激活剂，能有效定量检测血浆蛋白C活性，其检测特异性强；且原料易得、成本较低，适
合批量化生产。具体地，本发明提供了一种检测蛋白C活性的试剂盒，该试剂盒包括Rl试剂和R2试剂；所述Rl试剂包含ー种蛋白C激活剂，所述蛋白C激活剂自中国秦岭蝮蛇蛇毒中提取，其SDS-PAGE电泳呈一条带，分子量在40-45KD之间；所述R2试剂为包含发色底物的试剂。上述试剂盒中，所述蛋白C激活剂自中国秦岭蝮蛇蛇毒中提取的方法如下步骤I :中国秦岭蝮蛇蛇毒干粉用磷酸盐缓冲液溶解后，采用DEAE-琼脂糖快流速阴离子交换柱进行层析，用含O O. 5mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液进行线性梯度洗脱，检测波长为280nm，收集并合并活性峰洗脱液；步骤2 :将步骤I所得活性峰洗脱液经透析除盐后，采用SP-S^hadex C50阳离子交换柱进行层析，用含O. I O. 6mol/L氯化钠的醋酸盐缓冲液进行线性梯度洗脱，检测波长为280nm，收集并合并活性峰洗脱液；步骤3 :步骤2所得活性峰洗脱液经浓缩、透析除盐后，采用S^hadex G-100柱进行过滤层析，磷酸盐缓冲液洗脱，收集活性峰洗脱液，即为所述蛋白C激活剂。上述提取方法中，步骤I所述磷酸盐缓冲液的pH值为7 8、浓度为10 25mM。步骤I所述中国秦岭蝮蛇蛇毒干粉与用于溶解蛇毒干粉的磷酸盐缓冲液的质量体积比以g/ml计为O. 5 I. 5:10。步骤2所述醋酸盐缓冲液的pH值为5 6、浓度为30 60mM。步骤3所述磷酸盐缓冲液的pH值为7 8、浓度为10 30mM。上述试剂盒中，所述Rl试剂和R2试剂还分别包含缓冲液、稳定剂、赋形剂和防腐齐 。上述试剂盒中，所述Rl试剂中所述蛋白C激活剂的工作浓度为O. 07 O. 36mg/ml ο所述R2试剂中发色底物为PyroGlu-Pro-Arg-pNA HCl，工作浓度为O. I O. 5mg/ml ο所述Rl试剂缓冲液为Tris缓冲液或HEPES缓冲液,为反应提供适宜的反应条件。
优选地，所述Rl试剂缓冲液为pH值为7· 5 8· 5、浓度为4 6mmol/L的Tris-HCl缓冲液。所述R2试剂缓冲液为Tris-HCl缓冲液、Tris-CsCl缓冲液、Tris-NaCl缓冲液、咪唑缓冲液、HEPES缓冲液、巴比妥缓冲液中的ー种或多种。优选地，所述R2试剂缓冲液为pH值为6. 9 8. 5的Tris-CsCl缓冲液，所述Tris终浓度为50 100mmol/L，所述Cs+终浓度为100 260mmol/L。作为优选，所述R2试剂缓冲液中还含有Ca2+，可以加速底物反应速率，所述Ca2+终浓度为4 6mmol/L。本发明试剂盒中，所述Rl试剂、R2试剂中的稳定剂均为蛋白质、氣基酸、表面活性齐U、助悬剂、抗氧剂中的ー种或多种；所述蛋白质为牛血清白蛋白或明胶，所述表面活性剂为 PEG-6000 或 PEG-8000。
所述Rl试剂、R2试剂中的赋形剂均选自蔗糖、甘露醇、甘氨酸、海藻糖、乳糖中的ー种或两种。所述Rl试剂、R2试剂中的防腐剂均为本领域的常规防腐剤，如叠氮钠，含量为O. 02%-0. 2% (g/ml)吋，既可以有效杀菌，又不会产生副作用，可延长试剂盒的有效期；还可以是其它具有防腐作用的庆大霉素、环丙沙星或ProClin系列防腐剂中的任何ー种。本发明试剂盒具有如下优点I、本发明试剂盒中的蛋白C激活剂来源于中国秦岭蝮蛇蛇毒，原材料国内易于获得，制备方法简便，易于产业化生产；2、本发明试剂盒中的蛋白C激活剂对血浆中其它凝血因子没有激活作用，具有较强的专一性，并因此不易受干扰，具有较强的特异性；3、本发明试剂盒试剂组成简单，易于制备，生产成本较低；4、本发明试剂盒检测蛋白C活性时操作简单，适用于多种型号的半自动或全自动的凝血分析仪，便于在各级医院、医学生物科研単位等推广使用，从而可促进该检测项目的常规开展。
图I为本发明试剂盒的校准曲线；图2为本发明试剂盒与现有蛋白C检测试剂盒的相关性分析。
具体实施例方式本发明公开了ー种蛋白C活性检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进エ艺參数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进ー步的详细说明。实施例中所描述的具体的物料配比、エ艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例I蛋白C激活剂的制备(I)取Ig秦岭蝮蛇粗蛇毒干粉(购自陕西省宁东林业局蛇场)，溶于IOml 2OmM PBS缓冲液(pH7. 5)，静置，取上清液加入到预先用相同缓冲液平衡的DEAE-S印harose FF阴离子交換柱中，上样完成后，用上述缓冲液再次冲洗柱子至平衡，以便于除去未结合到柱子上的其余杂蛋白。再用含O O. 5mol/L NaCl的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为Iml/min，检测波长为280nm。取O. Iml洗脱液，加入O. Iml正常混合血浆和37°C预温的O. ImlAPTT试剂(脑磷脂-白陶土)，混匀后37 °C孵育5min，然后加入37°C预温的O. 025mol/LCaCl2溶液O. Iml后，測定凝固时间，如发生延长，说明洗脱液含有能激活蛋白C的活性成分，收集并合并活性峰洗脱液。
(2)将步骤(I)收集到的活性峰洗脱液用pH 5. 8、50mM NaAc-HAc缓冲液透析除盐，上样到经相同缓冲液平衡后的SPS印hadex C_50阳离子交换柱上，流速为lml/min。上样完成后，用上述缓冲液再次冲洗柱子至平衡，然后采用含O. I O. 6mol/L NaCl的NaAc-HAc缓冲液进行线性梯度洗脱，收集并合并活性峰洗脱液。(3)将步骤(2)收集到的活性峰洗脱液用聚こニ醇-20000浓缩后，移至透析袋中再次进行透析，透析液为浓度20mM、pH8. O的PBS缓冲液，充分透析后，上样到经相同缓冲液充分平衡后的Sephadex G-100层析柱上,流速为O. 4ml/min,用该平衡缓冲液以相同的流速进行洗脱，收集到活性峰约10ml。最后，将所收集活性蛋白透析后浓缩，分装冻干保存。用还原性和非还原性SDS-PAGE电泳检测，均显示为一条带，分子量在4(T45kD之间。实施例2本发明试剂盒的制备本实施例中的蛋白C活性测定试剂盒为固体试剂，包括Rl试剂和R2试剂，分别按以下成分和用量配制A) Rl 试剂
Tris-HCi 缓冲液(ρΗ8·0 )5mmol/L;
蝮蛇蛇毒激活剂0.2 5 mg/ml;
甘露醇5% ( g/ml);
BSA0.1% ( g/ml);
NaN30.02% ( g/ml );上述试剂全部溶解完全后，以Iml/瓶分装入瓶，制成冻干粉后使用。B) R2 试剂
Tris-HCl 缓冲液(pH8.4 )70mmo]/L;氯化铯150m inol/L; P y r ο GI u - P r ο - A rg - P N A · H CI3 .m g/m I; :氮イ匕4丐5mmoi/L; PEG-6000I % ( g/m!); 甘露醇40mg/ml; NaN30.02% ( g/ml );上述试剂全部溶解完全后，以Iml/瓶分装入瓶，制成冻干粉后使用。实施例3本发明试剂盒检测蛋白C活性的方法取蛋白C校准品(购自美国ANIARA公司，货号A222101)，用生理盐水配制成6个不同活性的校准品溶液，活性分别为150%、100%、75%、50%、25%、0%。将实施例2所制备试剂盒中的固体Rl试剂用Iml蒸馏水溶解，R2试剂用Iml蒸馏水溶解。以日本东亚CA530全自动血凝仪操作为例设定反应温度37°C，測定波长为405nm，分别取不同浓度的校准品溶液 20 μ 1，预热60s后，加入Rl试剂125 μ 1，反应300s后加入R2试剂30 μ 1，测定反应第Ils与第IOOs时的吸光度差值(Λ 0D)，每管重复测定3次，将各校准管3次测得的吸光度Λ OD的均值为纵坐标，对应的活性为横坐标，制作“活性-吸光度差值”校准曲线，结果见图I。取待测样品，同上方法测定样品的吸光度Λ OD值，代入校准曲线，即可计算出待测样品中蛋白C的活性。如果样品中蛋白C的检测活性超出校准曲线的范围，为了保证检测的准确性，需要用生理盐水进行适当稀释后再行检测。本试剂盒不仅适用于日本东亚CA530血凝仪，而且还适用于其它品牌、型号的凝血分析仪，如美国贝克曼库尔特ACL 7000全自动血凝仪、美国太平洋ThromboScreen 400C半自动血凝仪、北京赛科希德SF-8000全自动血凝仪等，具体參数可根据仪器不同进行适当调整。实施例4本发明试剂盒的特异性分析为了考察本发明试剂盒的特异性，本实施例针对本发明试剂盒所用蛇毒PC激活剂采用了以下三种不同的实验来共同说明。I、蛇毒蛋白C激活剂(简称PCA)对人血浆PT和APTT的影响蛇毒激活剂有些可影响凝血系统的内源途径或(和)外源途径，而理想的蛋白C激活剂应能抑制凝血系统内源途径，对外源途径没有影响。本实验通过研究本发明所用秦岭蝮蛇蛇毒PCA对人正常血浆APTT和PT的影响来进行分析。以不同浓度的上述蛇毒PCA进行PT和APTT考察，測定方法如下(I)取O. Iml正常混合血浆，加入O. Iml蛇毒PCA，37°C孵育5min，然后加入37°C预温PT试剂O. 2ml，记录凝固时间，即为PT值。(2)取O. Iml正常混合血浆，加入37°C预温的O. Iml APTT试剂(脑磷脂-白陶土)，以及O. Iml蛇毒PCA混匀后，37°C孵育5min，然后加入37°C预温的O. 025mol/L CaCl2溶液O. Iml后，记录凝固时间，即为APTT值。测定结果如表I所示。表I本发明所用蛇毒PCA对PT、APTT的影响
权利要求
1.一种检测蛋白C活性的试剂盒，其特征在于，包括Rl试剂和R2试剂；所述Rl试剂包含ー种蛋白C激活剂，所述蛋白C激活剂自中国秦岭蝮蛇蛇毒中提取，其SDS-PAGE电泳呈一条帯，分子量在40-45KD之间；所述R2试剂为包含发色底物的试剂。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白C激活剂自中国秦岭蝮蛇蛇毒中提取的方法如下 步骤I :中国秦岭蝮蛇蛇毒干粉用磷酸盐缓冲液溶解后，采用DEAE-琼脂糖快流速阴离子交换柱进行层析，用含O O. 5mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液进行线性梯度洗脱，检测波长为280nm，收集并合并活性峰洗脱液； 步骤2 :将步骤I所得活性峰洗脱液经透析除盐后，采用SP-Sephadex C50阳离子交換柱进行层析，用含O. I O. 6mol/L氯化钠的醋酸盐缓冲液进行线性梯度洗脱，检测波长为280nm,收集并合并活性峰洗脱液； 步骤3 :步骤2所得活性峰洗脱液经浓缩、透析除盐后，采用Sephadex G-IOO柱进行过滤层析，磷酸盐缓冲液洗脱，收集活性峰洗脱液，即为所述蛋白C激活剂。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤I所述磷酸盐缓冲液的pH值为7 8、浓度为10 25mM。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在干，步骤I所述中国秦岭蝮蛇蛇毒干粉与用于溶解蛇毒干粉的磷酸盐缓冲液的质量体积比以g/ml计为O. 5 I. 5:10。
5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤2所述醋酸盐缓冲液的pH值为5 6、浓度为30 60mM。
6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤3所述磷酸盐缓冲液的pH值为7 8、浓度为10 30mM。
7.如权利要求1-6任ー项所述的试剂盒，其特征在于，所述Rl试剂和R2试剂还分别包含缓冲液、稳定剂、赋形剂和防腐剤。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述Rl试剂中所述蛋白C激活剂的工作浓度为 O. 07 O. 36mg/ml。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中发色底物为PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl,工作浓度为 O. I O. 5mg/ml。
10.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述Rl试剂缓冲液为Tris缓冲液或HEPES缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种检测蛋白C活性的试剂盒。本发明所提供的检测蛋白C活性的试剂盒，包括一种由中国秦岭蝮蛇蛇毒分离纯化的蛋白C激活剂和发色底物试剂，属于发色底物法检测。本发明所述试剂盒检测特异性好、不易受干扰，且原材料易于获得、制备简便，检测时操作简单、快速，仪器适用范围广，便于在各级医院、卫生部门等推广使用。
文档编号G01N33/68GK102692511SQ20121018957
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者谢永华 申请人:上海太阳生物技术有限公司