血清dkk1在制备甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断试剂中的用途

血清dkk1在制备甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断试剂中的用途
【专利摘要】本发明涉及血清DKK1在制备甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断试剂中的用途。本发明人通过分析大量的肝细胞癌样本，从中分析了DKK1和AFP的表达情况，首次发现血清DKK1诊断AFP阴性肝细胞癌具有较高的灵敏度和特异性。
【专利说明】血清DKK1在制备甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断试剂中的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域；更具体地，本发明涉及血清DKKl在制备甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断试剂中的用途。
【背景技术】
[0002]肝脏原发性肿瘤包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、肝内胆管癌、混合性肝细胞癌、胆管囊腺瘤、肝母细胞瘤、血管瘤、类癌、淋巴癌、上皮样血管内皮瘤、鳞状细胞癌、畸胎瘤、以及平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤等其它肝脏肉瘤。目前，肝细胞癌的病因尚未完全明确，其发生是一个涉及多因素、多阶段和多基因累积变异的过程，主要的因素有病毒感染、黄曲霉毒素的摄入、酒精中毒、水污染、肝螺旋杆菌以及肝硬化等。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是肝细胞癌的主要致病因素，尤其是在亚洲和非洲；丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染呈世界性分布，是欧美等西方国家肝细胞癌发病率升高的主要因素。肝硬化是肝细胞癌发生最危险的因素，也是肝硬化病人主要的死因。由于大多数肝细胞癌患者就诊时已属中晚期，失去了最佳治疗时机，目前仅有30-40%的肝细胞癌患者能实施有效手术治疗，五年生存率仅3-5%。所以及时有效的诊断肝细胞癌是提高患者生存率的关键之一。
[0003]目前，筛查和诊断肝细胞癌最常用的方法是影像学和血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)检测。影像包括超声、CT、MRI等,但影像检测花费昂贵,难以广泛应用，且易受操作者经验影响，而且难以区分肝癌和非恶性增生。AFP是当前全世界应用最广泛的肝细胞癌标志物。当其界值为20ng/mL时，AFP诊断肝细胞癌的灵敏度仅为55-60%,产生约40%的假阴性率。这部分AFP阴性肝细胞癌病人在临床上难以诊断，难以评估其治疗效果和疾病进程。因此发现新的可靠的能弥补AFP不足的肝细胞癌诊断标志物，可极大提高和改善临床综合治疗效果，有助于肝细胞癌患者生存期的延长和生存质量的提高。理想的肿瘤标志物需要有较高的特异性，能够将肝细胞癌与肝炎、肝硬化、肝脏再生结节等区别开来，同时还需有较高的灵敏度，能够诊断早期肝细胞癌，且具有易检测、可重复、非侵入性的特点。
[0004]人类基因组计划的完成，高通量基因表达检测方法的发展和大规模数据分析能力的提高，使人们可以更深入地研究肝细胞癌发生发展过程中基因表达的改变，更好地理解肝细胞癌的发病机制，筛选并获得可应用于临床的生物标志物和药物靶点。本发明人前期通过 cDNA 表达谱芯片(Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array)技术分析了肝癌患者癌组织及对应癌旁肝组织基因表达谱存在差异。进一步发现DKKl在正常成年人的多种组织中不表达，仅在胎盘组织中表达，具有肿瘤特异性。
[0005]DKKl是Wnt信号通路的抑制因子，最早克隆于1998年，发现其在非洲爪蟾早期发育中能够抑制fct诱导的轴的复制而参与头部的形成。Wnt通路是一条对胚胎发育起重要调节作用的信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡、细胞极性和运动等过程，其通路中信号分子的突变或异常表达与多种疾病及癌症相关。fct通路受几种分泌蛋白的调控，包括DKK、WIF(ffnt-1nhibitor factor)和 SFRP(secreted frizzled related protein)等。DKK 家族包含进化上相对保守的4个成员(DKK1-4)。DKKl编码一个分泌型糖蛋白，含有两个富含半胱氨酸的保守区域(Cysl、Cys2),能够与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6 (low_densitylipoprotein receptor-related protein 5/6,LRP5/6)结合，并在膜蛋白 Kremenl/2 参与下通过引起LRP5/6内吞,抑制Wnt-Frizzled_LRP5/6复合体的形成,而抑制经典的fct信号通路。
[0006]随后本发明人采用ELISA方法，首次在10种不同类型人肿瘤细胞培养上清中检测出高浓度的DKKl蛋白，提示多种人肿瘤细胞分泌和高表达DKKl，DKKl可用于人类恶性肿瘤的临床血清诊断。于是2005年本发明人申报了国家发明专利(CN200510110298.2)和国际PCT专利(PCT/CN2006/000382)。DKKl用于癌症血清诊断的中国专利和国际专利均为本发明人首次在国内和国际上提出申请。尽管针对DKKl已经有在先的研究，但是本领域目前对血清DKKl的临床意义，特别是对AFP阴性(血清AFP ( 20ng/ml)肝细胞癌患者的诊断能力并不清楚。

【发明内容】

[0007]本发明的目的在于提供血清DKKl在制备甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断试剂中的用途。
[0008]在本发明的第一方面，提供DKKl蛋白或其编码基因在制备甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断试剂中的用途。
[0009]在本发明的另一方面，提供DKKl在制备甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断试剂盒中的用途。
[0010]在一个优选例中，所述的诊断试剂选自(但不限于):
[0011]特异性扩增DKKl蛋白的编码基因的引物；或
[0012]特异性识别DKKl蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
[0013]特异性抗DKKl蛋白的抗体。
[0014]在另一优选例中，所述的特异性扩增DKKl蛋白的编码基因的引物是引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示。
[0015]在本发明的另一方面，提供一种用于测定甲胎蛋白阴性肝细胞癌的试剂盒，所述的试剂盒中含有:
[0016](I)检测甲胎蛋白或其编码基因(较佳地，为血清中的甲胎蛋白或其编码基因)的表达情况或表达量的诊断试剂；和
[0017](2)检测DKKl蛋白或其编码基因(较佳地，为血清中的DKKl蛋白或其编码基因)的表达情况或表达量的诊断试剂。
[0018]在一个优选例中，所述的试剂盒中，先使用⑴的诊断试剂检测待测样品(较佳地，为血清)中甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量；再使用(2)的诊断试剂检测待测样品(较佳地，为血清)中的DKKl蛋白或其编码基因的表达情况或表达量，当甲胎蛋白检测为阴性时，若检测为DKKl阳性，则该待测样品的提供者为肝细胞癌高危。
[0019]在另一优选例中，所述的检测甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂选自(但不限于):
[0020]特异性扩增甲胎蛋白的编码基因的引物；或
[0021]特异性识别甲胎蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
[0022]特异性抗甲胎蛋白的抗体。
[0023]在另一优选例中，所述的特异性扩增甲胎蛋白的编码基因的引物是引物对，核苷酸序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
[0024]在另一优选例中，所述的检测DKKl蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂选自(但不限于):
[0025]特异性扩增DKKl蛋白的编码基因的引物；或
[0026]特异性识别DKKl蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
[0027]特异性抗DKKl蛋白的抗体。
[0028]在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括:
[0029]核酸抽提试剂(如核酸抽提液)；和/或
[0030]聚合酶链反应试剂(如dNTP，Taq酶)；和/或
[0031]蛋白免疫印迹试剂；和/或
[0032]酶链免疫反应试剂(如显色液或杂交液)。
[0033]在本发明的另一方面，提供一种测定甲胎蛋白阴性肝细胞癌的方法，所述方法包括:
[0034](a)检测待测样品中甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量；和
[0035](b)检测待测样品中的DKKl蛋白或其编码基因的表达情况或表达量，当甲胎蛋白检测为阴性时，若检测为DKKl阳性，则该待测样品的提供者为肝细胞癌高危。
[0036]在一个优选例中，使用所述的试剂盒进行测定。
[0037]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】

【附图说明】
[0038]图1.DKKl和AFP在肝组织及相应血清中表达情况的比较分析。
[0039]通过sem1-qPCR检测4例正常肝组织(healthy controls, HC)、8例肝硬化组织(liver cirrhosis, LC)和 16 例肝细胞癌组织(hepatocellular carcinoma, HCC)中DKKl (图A)和AFP (图D)的mRNA表达情况，以及通过qRT-PCR检测DKKl (图B)和AFP (图E)的mRNA表达情况。ELISA检测这28例肝组织相应血清中DKKl (图C)和AFP (图F)的蛋白水平。
[0040]图2.DKKl是否可作为诊断标志物的研究的流程设计。
[0041]正常人(healthycontrols, HC);慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)；肝硬化(liver cirrhosis, LC);肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC);酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA);受试者工作特征(receiveroperating characteristics, ROC) ；DKK1:dickkopf-l ；AFP: alpha-fetoprotein。
[0042]图3.测试集和验证集各组中血清DKKl蛋白和血清AFP蛋白的浓度。
[0043]图A和C为正常对照组(healthy controls, HC)、慢性乙型肝炎组(chronichepatitis B，CHB)、肝硬化组(liver cirrhosis, LC)和肝细胞癌组(HCC)中血清 DKKl 蛋白的浓度。图B和D为血清AFP蛋白在这4组中的浓度，当血清AFP浓度高于1210ng/ml时，其浓度以1210ng/ml计算。*，Ρ〈0.001。
[0044]图4.血清DKKl诊断肝细胞癌cutoff值的确定。
[0045]以肝细胞癌(HCC)为病人组，以正常人(healthy controls, HC)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)和肝硬化(liver cirrhosis, LC)患者为对照组制作ROC曲线，确定血清DKKl诊断肝细胞癌的cutoff值、敏感性(sensitivity)、特异性(specificity)和曲线下面积(aera under the curve, AUC)。
[0046]图5.血清DKKl对AFP阴性((20ng/ml)肝细胞癌的诊断能力。
[0047]图A和C为在AFP阴性肝细胞癌(AFp--HCC)和AFP阳性肝细胞癌(AFP+-HCC)中血清DKKl的浓度。图B和D为以AFP阴性肝细胞癌(AFP-negative HCC)为病人组，以正常人(healthy controls, HC)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)和肝硬化(livercirrhosis, LC)病人为对照组，制作ROC曲线，评价血清DKKl对AFP阴性肝细胞癌的诊断价值。
【具体实施方式】
[0048]本发明人通过分析大量的肝细胞癌样本，从中分析了 DKKl和AFP的表达情况，首次发现血清DKKl诊断AFP阴性肝细胞癌具有较高的灵敏度和特异性。因此，DKKl可非常有效地用于诊断AFP阴性肝细胞癌。
[0049]本发明中，本发明人首先在组织水平平行分析了 DKKl和AFP的表达情况，随后设计了大样本多中心队列研究，通过检测测试集队列(包括213例正常人、98例慢性乙型肝炎患者、96例肝硬化患者和424例肝细胞癌患者(其中179例为AFP阴性))血清中的DKKl蛋白浓度，在国内外首次发现血清DKKl诊断AFP阴性肝细胞癌具有较高的灵敏度和特异性，并在验证集(包括99例正常人、73例慢性乙型肝炎患者、72例肝硬化患者和209例肝细胞癌患者(其中69例为AFP阴性))中验证了血清DKKl对AFP阴性肝细胞癌的诊断价值。
[0050]如本文所用，“AFP阴性肝细胞癌”是指一种适应症，其是一种肝细胞癌，但其AFP基本上不表达或血清AFP低于20ng/ml。AFP是当前应用最广泛的肝细胞癌标志物，根据现有技术，当AFP界值为20ng/mL时，AFP诊断肝细胞癌的灵敏度仅为55_60%，产生约40%的假阴性率。这部分AFP阴性肝细胞癌病人在临床上难以诊断，难以评估其治疗效果和疾病进程。
[0051]目前临床上，肝癌主要分为以下几类:(1)肝细胞癌，起源于肝细胞的恶性肿瘤；
(2)胆管癌，起源于肝内外胆管上皮细胞的恶性肿瘤，约占原发性肝癌的20%，近年来发病率逐年升高；(3)混合性原发性肝癌，同一肝癌肿块内，肝细胞癌与胆管细胞癌并行；(4)肝血管瘤，较为常见的肝脏良性肿瘤，占肝良性肿瘤的5-20% ； (5)肝腺瘤:在肝脏良性肿瘤中，其发病率仅次于肝血管瘤，发病机理可能与性内分泌紊乱有关，主要发于女性；(6)肝脏局灶性结节性增生，肝脏良性病变，发病原因暂不清；(7)肝类癌，恶性肿瘤原发性肝类癌较少见，继发性肝类癌主要有消化道等脏器的类癌转移所致，较常见；(8)肝母细胞瘤:一种具有多种分化方式的恶性胚胎性肿瘤，是儿童中最常见的肝肿瘤；(9)转移性肝癌:原发灶在身体其它部位，转移至肝生长的恶性肿瘤。
[0052]此外，还有慢性肝病(例如肝炎、肝硬化)也表现为肝部不适，易于被诊断为肝癌。根据以上肝癌以及肝病的特点可知，在临床上肝癌存在复杂性，如何进行区分认定、提高临床诊断准确性是人们亟待解决的问题，临床上非常需要能够准确诊断肝细胞癌(特别是常规难以准确诊断的AFP阴性肝细胞癌、早期肝细胞癌或小肝细胞癌)的标志物。而AFP尽管已经被作为一种经典的肝癌标志物，但其却不能够完全解决临床上准确细分、诊断的难题，误诊率居高不下。而DKKl这一标志物，尽管本发明人在先已经将之与癌症相关联，然而其是否可以对肝癌的类型进行细分是以往的研究中未知的。
[0053]在本发明中，术语“DKK1蛋白”的氨基酸序列与GenBank登录号AAQ89364提供的蛋白序列基本上相同，也包括DKKl蛋白的同源蛋白。“DKK1蛋白的编码基因”的核苷酸序列与GenBank登录号NM_012242.2提供的核苷酸序列基本上相同或其简并的变异体，也包括DKKl基因的同源基因。术语“AFP蛋白”的氨基酸序列与GenBank登录号AAH27881.1提供的蛋白序列基本上相同。“AFP蛋白的编码基因”的核苷酸序列与GenBank登录号NM_001134.1提供的核苷酸序列基本上相同或其简并的变异体。
[0054]基于本发明人的新发现，可以以DKKl蛋白或其编码基因作为测定肝细胞癌、特别是AFP阴性肝细胞癌的标志物(标记物)。通过分析待测样品(样本)中DKKl蛋白或其编码基因的表达情况，从而得知受试者的患病状况，为疾病的诊断或预后提供依据。所述的待测样品或待测样本是患者的体液，较佳地是血清。
[0055]可采用各种技术来检测DKKl的表达情况，这些技术均包含在本发明中。检测核酸可用的已有技术如(但不限于):基因芯片技术、探针杂交技术、聚合酶链反应(PCR)、Northern Blot等方法。检测蛋白可借助于质谱分析仪器等，或可通过Western Blot或ELISA等方法。
[0056]作为本发明的一种选择方式，通过定量或半定量的聚合酶链反应(PCR)法来分析样品中DKKl基因的表达情况以及表达量，从而可做出判断。较佳地，通过实时定量Realtime-PCR 实现检测。
[0057]基于本发明的新发现，本发明还提供了特异性识别DKKl蛋白或其编码基因的试齐U。任何可识别DKKl蛋白或其编码基因的试剂均包含在本发明中，用作检测AFP阴性肝细胞癌的标志物。所述的特异性识别DKKl蛋白或其编码基因的试剂例如是:特异性扩增DKKl蛋白的编码基因的引物；或特异性识别DKKl蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗DKKl蛋白的抗体。
[0058]本发明还提供了一种特异性识别DKKl蛋白或其编码基因的试剂的用途，用于检测AFP阴性肝细胞癌或AFP阴性肝细胞癌高危人群。
[0059]作为本发明的一种实施方式，所述的试剂是抗DKKl的抗体；更特别的例如是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0060]本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的抗原可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生，所述的动物如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
[0061]本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。[0062]所述的抗体可用于免疫化学技术中，检测标本中的DKKl水平，从而用于诊断AFP阴性肝细胞癌或判断患病风险(易感性)。
[0063]作为本发明的另一种实施方式，所述的试剂是特异性扩增DKKl基因的引物，在得知了 DKKl的核苷酸序列后，人们易于基于此设计出引物。作为本发明的更优选方式，所述的引物是引物对，具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。所述的引物对能够扩增获得合适长度的扩增产物，检测的特异性良好。
[0064]也可利用基因芯片技术来进行DKKl的检测。在得知了 DKKl的核苷酸序列后，人们易于基于此设计出探针。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照现有公知技术。
[0065]利用所述的抗体、探针或引物，可以检测体液中DKKl的水平，因而可用于检测AFP阴性肝细胞癌，可用于预测早期AFP阴性肝细胞癌的发生，或者用于制备检测AFP阴性肝细胞癌的制剂或试剂盒等，用于制备预测早期AFP阴性肝细胞癌的发生的制剂或试剂盒等。
[0066]本发明还提供了用于诊断AFP阴性肝细胞癌的试剂盒，该试剂盒包括:特异性识别DKKl蛋白或其编码基因的试剂。更佳地，所述的试剂盒还包括:特异性识别AFP蛋白或其编码基因的试剂；从而可通过先检测待测样品中AFP的表达情况来确定AFP阴性的样品；进一步地检测DKKl的表达情况；这种检测手段将使得肝细胞癌的检测更为准确、可极大地减少误诊漏诊。所述的试剂例如是:所述的特异性识别DKKl蛋白或其编码基因的试剂例如是:特异性扩增DKKl蛋白的编码基因的引物；或特异性识别DKKl蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗DKKl蛋白的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)。所述的特异性识别AFP蛋白或其编码基因的试剂例如是:特异性扩增AFP蛋白的编码基因的引物；或特异性识别AFP蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗AFP蛋白的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)。
[0067]所述的试剂盒中还可含有:核酸抽提试剂(如核酸抽提液)；和/或聚合酶链反应试剂(如dNTP，Taq酶)；和/或蛋白免疫印迹试剂；和/或酶链免疫反应试剂(如显色液或杂交液)。
[0068]作为一种优选方式，所述的试剂盒中还可含有:用于免疫化学分析的试剂，所述的试剂例如:第二抗体、染色齐U、显色剂等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等。更具体地，所述的试剂盒可以是一种基于酶联免疫反应(ELISA)技术的试剂盒，用于检测AFP阴性肝细胞癌或预测早期AFP阴性肝细胞癌的发生。ELISA技术以及基于该技术的检测试剂对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
[0069]作为另一种优选方式，所述的试剂盒中还可含有:(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于:Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或(B)各种提取DNA或RNA (即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于氯仿、异戊醇、NaCl等；或(C)提取DNA或RNA的试剂盒。
[0070]所述的特异性识别DKKl蛋白或其编码基因的试剂、或特异性识别AFPl蛋白或其编码基因的试剂也可固定于试纸上，制备成免疫胶体金试纸或类似检测材料。
[0071]此外，所述的试剂盒中还可含有本发明的试剂盒的使用说明书和/或标准操作程序。
[0072]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0073]1、材料和方法
[0074]1、肝组织标本及相应血清收集
[0075]肝组织标本共28例，其中正常人肝组织4例，来自复旦大学肝癌研究所肝外科肝移植捐赠者；肝硬化患者肝组织8例，来自苏州大学第一附属医院感染科肝硬化活检患者；肝细胞癌患者肝癌组织16例(其中8例患者血清AFP ( 20ng/ml，8例AFP>20ng/ml)，来自复旦大学肝癌研究所肝外科肝癌手术切除患者。并同时收集其相应血清28例。
[0076]2、RNA 抽提
[0077]用Trizol试剂抽提细胞总RNA,加入Trizol后充分吹打至不粘稠，按每毫升Trizol加200 μ I氯仿,剧烈振荡15秒后室温静置5min ；4°C, 10, OOOrpm高速离心15min ；小心将无色上层水相移入一新的RNase-Free的离心管中，按每毫升Trizol体积加500 μ I异丙醇，室温静置IOmin, 4°C, 10, OOOrpm离心IOmin ;弃上清,75%酒精(按每毫升Trizol至少用lml75%酒精)洗漆，4°C,8，OOOrpm离心IOmin,弃上清；室温干燥RNA沉淀5_10min(勿使RNA完全干燥)，用RNase-Free的H2O于55_60°C溶解lOmin，立即至于冰上。分光光度计法定量并检测纯度，取少量总RNA进行甲醛变性电泳，检查RNA完整性。
[0078]3、逆转录
`[0079]逆转录反应体系:按20 μ I反应体积、细胞总RNA I μ g量(表1)进行。
[0080]表1、逆转录反应体系
[0081]
__WU_
5 X PrimeScriptlM Buffer4 μ!
Random 6 primers (100 μΜ)I μ!
PrimeScriptINl RT Enzyme Mix II μ!
Oligo dT Primer (50 μΜ)I μ].(? RNAI ng
_RNase Free CidH2Q_加节 20 μ I_
[0082]反应条件:37°C 45min(反转录反应)，85°C 5sec(反转录酶的失活反应)，4°C保存。可加入ddH20稀释40倍备用。
[0083]4、半定量 PCR
[0084]以稀释后的cDNA模板进行半定量PCR扩增，PCR反应体系如表2。
[0085]表2.半定量PCR反应体系
[0086]
【权利要求】
1.DKKl蛋白或其编码基因在制备甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断试剂中的用途。
2.DKKl在制备甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断试剂盒中的用途。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂选自: 特异性扩增DKKl蛋白的编码基因的引物；或 特异性识别DKKl蛋白的编码基因或其转录本的探针；或 特异性抗DKKl蛋白的抗体。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的引物是引物对，核苷酸序列如SEQIDNO:1 和 SEQ ID NO: 2 所示。
5.一种用于测定甲胎蛋白阴性肝细胞癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有: (1)检测甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂；和 (2)检测DKKl蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂选自: 特异性扩增甲胎蛋白的编码基因的引物；或 特异性识别甲胎蛋白的编码基因或其转录本的探针；或 特异性抗甲胎蛋白的抗体。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测DKKl蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂选自: 特异性扩增DKKl蛋白的编码基因的引物；或 特异性识别DKKl蛋白的编码基因或其转录本的探针；或 特异性抗DKKl蛋白的抗体。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括: 核酸抽提试剂；和/或 聚合酶链反应试剂；和/或 蛋白免疫印迹试剂；和/或 酶链免疫反应试剂。
9.一种测定甲胎蛋白阴性肝细胞癌的方法，其特征在于，所述方法包括: (a)检测待测样品中甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量；和 (b)检测待测样品中的DKKl蛋白或其编码基因的表达情况或表达量，当甲胎蛋白检测为阴性时，若检测为DKKl阳性，则该待测样品的提供者为肝细胞癌高危。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，使用权利要求5所述的试剂盒进行测定。
【文档编号】G01N33/574GK103487581SQ201210190024
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年6月8日 优先权日:2012年6月8日
【发明者】覃文新, 沈秋瑾, 顾健人, 杨胜利 申请人:上海市肿瘤研究所