一种同步检测游离kappa轻链和游离lambda轻链浓度的新型检测方法及试剂盒的制作方法

专利名称：一种同步检测游离kappa轻链和游离lambda轻链浓度的新型检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫检测领域，特别涉及一种同步检测游离kappa轻链和游离lambda轻链的时间分辨荧光免疫分析方法及其试剂盒。
背景技术：
免疫球蛋白(Ig)轻链分为K (kappa)和入(lambda) 2个型别，每个Ig分子上只有一个型别的轻链，人类K (kappa)和\ (lambda)的比例为6 : 4。轻链为能自由通过肾小球基底膜的小分子蛋白质，在肾小管被重吸收回到血循环中，所以正常人尿中只有少量轻链存在。当发生代谢失调和多发性骨髓瘤时，血中会出现大量游离轻链，并由尿中排出，即为本周蛋白(Bence-Jones蛋白)。已有显著的基础和临床研究表明，血清游离轻链检测，可用于单克隆丙种球蛋白病初筛，其敏感性为88 % 98 % ;可用于AL淀粉样变性病早期诊断；可用于常规电泳方法无法检测到的不分泌性多发性骨髓瘤(NSMM)病人检测，其敏感性达65% 70%;此外对骨髓瘤病情进展具有重要预后作用，可对未定性单克隆丙种球蛋白病患者进行风险分层和治疗效果的快速评估，还可用于化疗或自身外周血干细胞移植后是否复发的监测。正常人血清游离轻链浓度为3 19mg/L,其中X型游离轻链为6 26mg/L, k /入比值为0. 26 I. 65。到目前为止,市场上尚无游离轻链的国际参考品,检测方法也没有统一，所以，不同厂家试剂盒的检测结果也不具可比性。目前市场上常用的检测方法为免疫比浊法，存在灵敏度和精密度均不够理想及会因抗原量过大而产生钩状效应等缺点。时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)是上世纪八十年代初发展起来的新的免疫测定技术。它是一种在荧光免疫分析的基础上发展起来的特殊荧光分析技术。荧光分析利用了荧光波长与其激发光波长的巨大差异，但当进行超微量分析时，激发光的杂散光会严重影响对荧光的检测。解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通荧光标记物的荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有非常少的稀土金属(Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长，可达l/2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。TRFIA所用的荧光标记物是镧系元素螯合物，利用这类荧光物质荧光寿命长及斯托克斯(Stokes)位移大的特点，通过波长和时间两种分辨技术，有效排除了非特异本底荧光的干扰，具有灵敏度高，标记物制备简单，稳定性好，标准曲线线性范围宽，操作方便等优点，成为最有发展前途的超微量分析技术和当前标记免疫分析发展到新阶段的代表。在实际应用中，通常还在突光标记物中加入一种增强液(Enhancement solution),可增强突光效果上百万倍。目前,还没有采用TRFIA检测游离lambda轻链的技术,更缺乏同步检测游离kappa轻链和游离lambda轻链的技术
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的方法中，对游离kappa轻链和游离lambda轻链分别进行检测，检测过程复杂和繁琐，灵敏度和精密度均不够理想及会因抗原量过大而产生钩状效应等缺点，提供一种同步检测游离kappa轻链和游离lambda轻链的方法及其试剂盒，该检测方法及其试剂盒灵敏度高，特异性强，稳定性好，操作简单、迅捷，能极大地提闻诊断效率。
本发明人经过大量的试验和研究，惊喜的发现，利用TRFIA可以比较容易地实现免疫双标记分析，同时测定游离kappa轻链和游离lambda轻链,从而完成本发明。因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是，一种用于同步检测游离kappa轻链和游离lambda轻链浓度的时间分辨荧光免疫分析的试剂盒，包括以下试剂I)同时针对人源抗体重链和轻链的抗体，2)用一种镧系元素标记的抗游离kappa轻链抗体，3)用另一种镧系元素标记的抗游离lambda轻链抗体，4)游离kappa轻链和游离lambda轻链的标准品，5)缓冲液，6)洗涤液，7)增强液。根据本发明，试剂I)为同时针对人源抗体重链和轻链的抗体。所述的同时针对人源抗体重链和轻链的抗体为来自非人源哺乳动物的抗人IgG抗体的多克隆抗体。较佳地，所述的同时针对人源抗体重链和轻链的抗体为兔抗人抗体，更佳地为兔抗人IgG H&L多克隆抗体。较佳地，所述的同时针对人源抗体重链和轻链的抗体为固相抗体。所述固相抗体的固相载体较佳地选用低荧光本底高吸附反应板，优选96孔板或48孔板。所述的固相抗体可以采用本领域常规的抗体包被固相载体的方法制备，较佳地包括如下步骤采用所述反应板作为固相载体，用所述同时针对人源抗体重链和轻链的抗体包被反应板，再用封闭液封闭，然后真空抽干，即得固相抗体。较佳地，在包被时，所述同时针对人源抗体重链和轻链的抗体用缓冲液稀释至I 10mg/L作为包被液；所述缓冲液是pH为9. 0 9. 8的Na2CO3-NaHCO3缓冲液；所述封闭液为含0. 2 (w/v) %明胶和2 (w/v) %蔗糖的50mmol/L、pH为7. 0 7. 4的Tris-HCl缓冲液。真空抽干后，所得的固相抗体(如反应板)较佳地可以在密封后置于_20°C冷冻保存。根据本发明，试剂2)为用一种镧系元素标记的抗游离kappa轻链抗体。所述的抗游离kappa轻链抗体为来自非人源哺乳动物的单克隆抗体或多克隆抗体；较佳地，所述的抗游离kappa轻链抗体为抗游离kappa轻链多克隆抗体,其仅与游离形式的kappa轻链结合，与完整抗体及其重链区和轻链区均不结合。更佳地，所述的抗游离kappa轻链抗体为兔抗人游离kappa轻链多克隆抗体。所述的抗游离kappa轻链抗体可以采用本领域常规的蛋白标记方法制备，较佳地包括如下步骤用r3+-n2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(R3+-DTTA)与抗游离kappa轻链抗体反应,其中R代表铕或衫,反应液经过柱层析分离纯化，即得。其中，所述的抗游离kappa轻链抗体与R3+-DTTA的质量比较佳地为I : 0. 2 0. 5。根据本发明，试剂3)为用另一种镧系元素标记的抗游离lambda轻链抗体。同样，所述抗游离lambda轻链抗体为来自非人源哺乳动物的单克隆抗体或多克隆抗体；较佳地，所述的抗lambda轻链抗体为多克隆抗体,其仅与游离形式的lambda轻链结合,与完整抗体及其重链区和轻链区不结合。更佳地，所述的抗游离lambda轻链抗体为兔抗人游离lambda轻链多克隆抗体。所述的抗游离lambda轻链抗体可以采用本领域常规的标记方法制备，较佳地包括如下步骤用R3+-DTTA与抗游离lambda轻链多克隆抗体反应，其中R代表钐或铕，反应液经过柱层析分离纯化，即得。其中，所述的抗游离lambda轻链多克隆抗体与R3+-DTTA的质量比较佳地为I : 0.2 0.5。根据本发明，试剂2)所述的抗游离kappa轻链抗体，具有一种镧系元素标记，试剂3)所述的抗游离lambda轻链抗体具有另一种镧系元素标记，所述的镧系元素较佳地选自铕和钐中的任何一种；在同一试剂盒中，标记所述抗游离kappa轻链抗体的镧系元素和所述抗游离lambda轻链抗体的镧系元素不相同。 根据本发明，试剂4)为游离kappa轻链和游离lambda轻链的标准品。较佳地，所述的标准品为游离kappa轻链和游离lambda轻链的混合标准品。更佳地，所述的标准品为包括0 600mg/L的所述游离kappa轻链与相同浓度的所述游离lambda轻链的混合标准品。最佳地，所述的混合标准品包括如下浓度的所述游离kappa轻链与相同浓度的所述游离 lambda 轻链0mg/L, 5mg/L, 20mg/L, 100mg/L, 200mg/L, 500mg/L。根据本发明，试剂5)为缓冲液。较佳地,所述的缓冲液为Tris-HCl缓冲液；更佳地，所述的缓冲液为含8mmol/L NaCl>0. lwt*%明胶、0. 2wt% IgG、50 ii mol/L 二乙烯三胺五乙酸、0. lml/L Tween-80 和 0. Iwt % NaN3 的 50mmol/L> pH7. 2 的 Tris-HCl 缓冲液。根据本发明，试剂6)为洗涤液。较佳地，所述的洗涤液为Tris-HCl缓冲液；更佳地，所述的洗漆液为含 14. Smmol /T, NaCl、0. 2ml/L Tween-80 和 0. 2wt% NaN3 的 SOmmoI /I,、pH7. 2 的 Tris-HCl 缓冲液。根据本发明，试剂7)为增强液。较佳地，所述的增强液为含有￠-二酮的缓冲液；更佳地，所述的增强液为含15y mol/L ￠-萘甲酰三氟丙酮、50 y mol/L三正辛基氧化膦和0. I (v/v) % TritonX-100的pH3. 2的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是，一种根据上述的试剂盒同步检测游离kappa轻链和游离lambda轻链浓度的时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)，依次包括以下步骤I)在包被有同时针对人源抗体重链和轻链的抗体的固相载体中，加入游离kappa轻链和游离lambda轻链标准品或待测样品以及缓冲液，进行孵育；2)用洗涤液洗涤后,加入用一种镧系元素标记的抗游离kappa轻链抗体和用另一种镧系元素标记的抗游离lambda轻链抗体，进行孵育；3)用洗涤液洗涤，然后加入增强液进行反应，之后进行时间分辨荧光检测。本发明用同时针对人源抗体重链和轻链的抗体作为捕获抗体，使用分别仅针对游离kappa轻链和游离lambda轻链的另外二种抗体作为标记抗体，利用双标记时间分辨荧光免疫分析检测原理，建立可同时检测游离kappa轻链和游离lambda轻链浓度的新型检测方法。较佳地，本发明采用兔抗人IgGH&L多克隆抗体为捕获抗体，采用Sm3+标记的抗人游离lambda轻链抗体和Eu3+标记的抗人游离kappa轻链抗体为标记抗体,其检测的原理如图I所示。根据本发明，步骤I)为在包被有同时针对人源抗体重链和轻链的抗体的固相载体中，加入游离kappa轻链和游离lambda轻链标准品或待测样品以及缓冲液，进行孵育。其中，所述固相载体较佳地为低荧光本底高吸附反应板，即将所述的同时针对人源抗体重链和轻链的抗体包被在反应板上；所述孵育的条件同常规，较佳地为25 37°C，I 2小时。孵育后，所述游离kappa轻链和游离lambda轻链标准品或待测样品中的游离kappa轻链和游离lambda轻链与固相的同时针对人源抗体重链和轻链的抗体形成免疫复合物。根据本发明，步骤2)为用洗涤液洗涤后，加入用一种镧系元素标记的抗游离kappa轻链抗体和用另一种镧系元素标记的抗游离lambda轻链抗体，进行孵育。其中，所述的抗游离kappa轻链抗体具有一种镧系元素标记,所述的抗游离lambda轻链抗体具有另一种镧系元素标记，所述的镧系元素较佳地选自铕和钐；在同一次检测操作中，标记所述的抗游离kappa轻链抗体的镧系元素和标记所述的抗游离lambda轻链抗体的镧系元素不相同。 因为镧系元素在受激发后发射波长和荧光寿命相对较大，时间分辨荧光免疫分析法可利用这些镧系元素波长和荧光寿命的不同，将标记物区别开来。从发射波长看，若选用Eu3+(615nm)与Tb3+(544nm)作双标记配对，区分较明显，但是要同时测定它们，就需用氟化脂肪P - 二酮螯合剂，而其对Eu3+的测定效果却较差，因而，Eu3+与Tb3+作双标记配对时，测定结果并不好。Eu3+与Sm3+的最大发射波长虽然只相差约30nm，但因多是窄发射峰，已能被充分分辨，在340nm激发光作用下，两者都能与0-NTA(0-二酮)形成高度发荧光的螯合物，且它们的荧光寿命相差显著(Sm3+为50s，Eu3+为730s)，可通过时间延迟充分分辨。因此，优选Eu3+和Sm3+作为配对的双标记用于时间分辨荧光免疫分析法。根据本发明，步骤2)中用洗涤液是为了洗涤步骤I)的孵育后的固相载体，所述的固相载体上载有所述的同时针对人源抗体重链和轻链的抗体，即捕获抗体，所述的捕获抗体与加入的游离kappa轻链和游离lambda轻链混合标准品或待测样品中的游离kappa轻链和游离lambda轻链(即抗原)因抗原-抗体的作用而结合，而游离的未与捕获抗体反应的其他成份，用洗涤液洗涤去除。本发明中，作为抗原，游离kappa轻链和游离lambda轻链复合物中的游离kappa轻链和游离lambda轻链都与固相载体上的同时针对人源抗体重链和轻链的抗体结合，但是这些游离轻链在其他的抗原表位还可以结合其他抗游离轻链抗体，即步骤2)所述的抗游离kappa轻链抗体和抗游离lambda轻链抗体。经过孵育后，分别形成了夹心复合物。孵育的方法同常规，较佳地为25 37°C，I 2小时。根据本发明，步骤3)为用洗涤液洗涤，然后加入增强液进行反应，之后进行时间分辨荧光检测。其中，所述的洗涤液如上所述，用洗涤液洗涤是为了去除游离的抗游离kappa轻链抗体和抗游离lambda轻链抗体。本发明中，增强液中的￠-二酮可以倍增荧光信号。加入增强液进行振荡反应后，形成高度发荧光的螯合物。反应的温度和时间，较佳的为25 37°C，5分钟。在340nm激发光作用下，所形成的螯合物发射很强的荧光，Sm3+的荧光寿命为50s，Eu3+的荧光寿命为730s，用时间分辨荧光仪器测定其荧光强度。荧光强度分别与样品中的游离kappa轻链和游离lambda轻链浓度成正比,对照标准曲线即可确定样品中抗原的量。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明采用高灵敏的时间分辨荧光免疫分析技术，建立了同时检测游离kappa轻链和游离lambda轻链的方法。该方法灵敏度高，特异性强，稳定性好，特别适用于血清，尿液或其他体液(如心包积液、腹水、尿液等)中游离kappa轻链和游离lambda轻链含量的检测。本发明所用试剂成本低，操作方法简单，分析系统可实现高度自动化，可提高临床检验的速度，又可大幅度降低人为误差，增加检出结果的可靠性，此外，同时检测游离kappa轻链和游离lambda轻链也可极大提高相关疾病的诊断效率。


以下结合

本发明的特征和有益效果。图I时间分辨荧光免疫分析同时检测游离kappa轻链和游离lambda轻链的原理示意图。图2为本发明检测游离kappa轻链和游离lambda轻链的双标记TRFIA标准曲线及精密度图。A图游离kappa轻链，B图游离lambda轻链。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所述的“室温”，为试验操作的实验室温度，为18 25°C。其中，下列实施例中的同时针对人源抗体重链和轻链的抗体购自Abcam公司兔抗人 IgG H&L 多克隆抗体(Rabbit anti-Human IgG H&L secondary antibody, ab6715);抗游离kappa轻链抗体为兔抗人游离kappa轻链多克隆抗体(Polyclonal Rabbit Anti-Humankappa Free Light Chains, Code No. /Code/Code-Nr. A0101),购自 dako 公司，抗游离lambda轻链抗体为兔抗人游离lambda轻链多克隆抗体(Polyclonal Rabbit Anti-HumanLambda Free Light Chains, Code No./Code/Code-Nr. A0101)购自 dako 公司；96 孔微孔板(8 X 12)为 Iabsystem 公司产品；Eu3+和 Sm3+标记盒为 PerkerElmer 公司产品；SephadexG-50为Amersham产品；其他试剂均为国产分析纯；全自动TRFIA检测仪(Auto DELFIA1235)为 Wallac 产品。实施例I试剂盒的制备每一个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下(1)1X96孔板(8条X 12孔，可以拆分为单孔)包被有兔抗人IgG H&L多克隆抗体。(2) 6 X游离kappa轻链/游离lambda轻链混合标准品，冻干品，包括6个浓度0mg/L, 5mg/L, 20mg/L, 100mg/L, 200mg/L, 500mg/L。使用前每瓶各用 Iml 蒸懼水溶解。(3) I X铕标记抗体I冻干品，使用时用0. 5ml蒸馏水溶解。(4) I X钐标记抗体2冻干品，使用时用0. 5ml蒸馏水溶解。(5) I X 缓冲液，30ml。(6) I X洗涤液，30ml，使用时以蒸馏水按I : 25稀释。(7) IX 增强液，15ml。下面是试剂盒中的各材料所含的具体成分及其制备方法。、
I、微孔反应板制备用50mmol/L pH 9. 6Na2C03_NaHC03的缓冲液将兔抗人IgG H&L多克隆抗体稀释至
Iu g/mL作为包被液,96孔微孔板每孔各加入100 u 1,4°C放置过夜,弃去包被液，用洗漆液(14. 5mmol/L NaCl、0. 2ml/L Tween-80 和 0. 2wt% NaN3 的 50mmol/L Tris-HCl pH7. 2)冲洗四次，加200iil含0. 2wt%明胶和2wt%庶糖的50mmol/L pH7. 2的Tris-HCl缓冲液封闭，4V放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20 V冷冻保存。2、游离kappa轻链/游离lambda轻链混合标准品制备将市售游离kappa轻链抗体和游离lambda轻链抗体纯品，用含0. 2wt % BSA,0. Iwt % NaN3的50mmol/L pH7. 8Tris_Hcl缓冲液将上述定值血清配成如下6个浓度 的包含游离kappa轻链和相同浓度的游离kappa轻链的混合物0mg/L, 5mg/L, 20mg/L, 100mg/L,200mg/L, 500mg/L,从而构成了系列浓度的混合标准品，而后将每种浓度的混合标准品以每 瓶Iml分装冻干，-20°C干燥保存。该各瓶冻干保存的混合标准品，使用时可各用Iml蒸馏水溶解，得到的标准品溶液中游离kappa轻链和游离lambda轻链的浓度相同，均分别为0mg/L, 5mg/L, 20mg/L,100mg/L,200mg/L,500mg/L。3、Eu3+标记的兔抗人游离kappa轻链多克隆抗体制备参照Eu3+标记试剂盒(生产厂商PerkerElmer公司)说明书操作。具体为取兔抗人游离kappa轻链多克隆抗体Img溶于0. 25mol/L NaHCO3液200 U I中，加入0. 2mgEu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)充分混匀，4°C反应24小时。反应液用Sephadex G_50柱(I X 20cm)层析,A280监测收集蛋白峰,合并峰管,定出蛋白含量。同时用PerkinElmer公司Eu3+标准液测定合并峰的Eu3+浓度。所得的标记率(Eu3+mol/IgG mol)是8. 91，蛋白回收率为87%。将收集的溶液稀释成Eu3+标记的兔抗人游离kappa轻链多克隆抗体浓度为0. 75mmol/L，每瓶0. 5ml分装，-20°C干燥保存。4、Sm3+标记兔抗人游离lambda轻链多克隆抗体制备参照Sm3+标记试剂盒(生产厂商PerkerElmer公司)说明书操作。具体为取兔抗人游离lambda轻链多克隆抗体Img溶于0. 25mol/L NaHCO3液200 U I中，加入0. 2mgSm3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Sm3+-DTTA)充分混匀，4°C反应24小时。反应液用Sephadex G_50柱(I X 20cm)层析,A280监测收集蛋白峰,合并峰管,定出蛋白含量。同时用PerkinElmer公司Sm3+标准液测定合并峰的Sm3+浓度。将收集的溶液稀释成Sm3+标记兔抗人游离lambda轻链多克隆抗体浓度为0. 73mmol/L,每瓶0. 5ml分装,_20°C干燥保存，即为试剂盒中的Sm3+标记兔抗人游离lambda轻链多克隆抗体冻干品。5、缓冲液8mmol/L NaCl、0. Iwt % 明胶、0. 2wt*% IgG、50 U mol/L 二乙烯三胺五乙酸、0. lml/L Tween-80 和 0. Iwt % NaN3 的 50mmol/L Tris-HClpH7. 2。6、洗漆液14. Smmol /T, NaCl、0. 2ml/L Tween-80 和 0. 2wt % NaN3 的 SOmmoI /I,Tris-HCl pH7. 2。7、增强液1升pH3. 2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15 Umol^-萘甲酰三氟丙酮，50 u mol三正辛基氧化勝和lmlTritonX-100。使用该试剂盒测定之前注意事项如下(I)使用之前将所有试剂取出回升至室温(18 30°C )
(2)使用之后立即将所有试剂放回2 8°C保存。(3)如果样品量大建议用多通道移移器，以减少各样本反应时间上的差异。(4)在所有恒温孵育过程中，避免光线照射。(5)取出需用数量的微孔板，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2 8°C。实施例2试剂盒的制备试剂盒中的材料除不含包被有兔抗人IgG H&L多克隆抗体 的96孔板以外，其它的同实施例I。试剂盒中的各材料的制备方法如下(I)Eu3+标记的兔抗人游离kappa轻链多克隆抗体制备参照Eu3+标记试剂盒(生产厂商PerkerElmer公司)说明书操作。具体为取兔抗人游离kappa轻链多克隆抗体Img溶于0. 25mol/L NaHCO3液200 U I中，加入0. 2mgEu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)充分混匀，4°C反应24小时。反应液用Sephadex G_50柱(I X 20cm)层析,A280监测收集蛋白峰,合并峰管,定出蛋白含量。同时用PerkinElmer公司Eu3+标准液测定合并峰的Eu3+浓度。所得的标记率(Eu3+mol/IgG mol)是6. 91，蛋白回收率为77%。将收集的溶液稀释成Eu3+标记的兔抗人游离kappa轻链多克隆抗体浓度为0. 95mmol/L，每瓶0. 5ml分装，_20°C干燥保存。(2) Sm3+标记兔抗人游离lambda轻链多克隆抗体制备参照Sm3+标记试剂盒(生产厂商PerkerElmer公司)说明书操作。具体为取兔抗人游离lambda轻链多克隆抗体Img溶于0. 25mol/L NaHCO3液200 U I中，加入0. 2mgSm3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Sm3+-DTTA)充分混匀，4°C反应24小时。反应液用Sephadex G_50柱(I X 20cm)层析,A280监测收集蛋白峰,合并峰管,定出蛋白含量。同时用PerkinElmer公司Sm3+标准液测定合并峰的Sm3+浓度。将收集的溶液稀释成Sm3+标记兔抗人游离lambda轻链多克隆抗体浓度为0. 88mmol/L,每瓶0. 5ml分装,_20°C干燥保存，即为试剂盒中的Sm3+标记兔抗人游离lambda轻链多克隆抗体冻干品。(3)试剂盒中的其他材料(游离kappa轻链/游离lambda轻链混合标准品，缓冲液，洗涤液，增强液)的制备方法均同实施例I。实施例3试剂盒的制备每一个盒中的试剂足够进行48个测量，盒中的材料如下(1)1X48孔板(4条X 12孔，可以拆分为单孔)包被有鼠抗人游离kappa轻链单克隆抗体。(2) 6 X游离kappa轻链和游离lambda轻链混合标准品，冻干品，包括6个浓度Omg/L, 5mg/L, 20mg/L, 100mg/L, 200mg/L, 500mg/L。使用前每瓶各用 Iml 蒸懼水溶解。(3) I X铕标记抗体冻干品，使用时用0. 5ml蒸馏水溶解。(4) I X钐标记抗体冻干品，使用时用0. 5ml蒸馏水溶解。(5) I X 缓冲液，30ml。(6) I X洗涤液，30ml，使用时以蒸馏水按I : 25稀释。(7) IX 增强液，15ml。试剂盒中的各材料的制备方法如下
I、微孔反应板制备用50mmol/L pH 9. 6Na2C03_NaHC03的缓冲液将兔抗人IgG H&L多克隆抗体稀释至IOii g/mL作为包被液,48孔微孔板各加入IOOii 1,4°C放置过夜,弃去包被液,冲洗四次，加200 ill含0. 2wt%明胶和2wt%庶糖的50mmol/L pH7. 2的Tris-HCl缓冲液封闭，4°C放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20°C冷冻保存。2、试剂盒中的其他材料(游离kappa轻链/游离lambda轻链混合标准品,Eu3+标记的鼠抗人游离kappa轻链多克隆抗体，Sm3+标记兔抗人游离lambda轻链多克隆抗体,缓冲液，洗涤液，增强液)的制备方法均同实施例I。实施例4采用TRFIA同步检测游离kappa轻链和游离lambda轻链的浓度采用实施例I提供的试剂盒进行检测。
一、实施例I的试剂盒中各材料的稀释6 X游离kappa轻链/游离lambda轻链混合标准品，冻干品,包括6个浓度0mg/L, 5mg/L, 20mg/L, 100mg/L, 200mg/L, 500mg/L。使用前每瓶各用 Iml 蒸懼水溶解。铕标记抗体冻干品，用0. 5ml蒸馏水溶解。钐标记抗体冻干品，用0. 5ml蒸馏水溶解。洗涤液，用蒸馏水按I : 25稀释。待测样品200例，取自上海交通大学医学院附属仁济医院健康体检人员，所有入选人员，其血液学和影像学检查均无异常。空腹抽静脉血2ml，分离出血清后，用于本发明检测。二、检测取上述制备的包被有兔抗人IgG H&L多克隆抗体的微孔反应板，加50iU游离kappa轻链/游离lambda轻链混合标准品或待测样品至各自的微孔中，加100 U I缓冲液，室温振荡反应I小时。洗涤后加200 Ul以缓冲液作稀释剂，I 100稀释铕标记的兔抗人游离kappa轻链多克隆抗体和钐标记的兔抗人游离lambda轻链多克隆抗体，室温振荡反应I小时。用洗涤液洗涤6次，加增强液200 Ul振荡5分钟后用全自动TRFIA检测仪测量荧光强度，从标准曲线分别计算样品中的游离kappa轻链和游离lambda轻链的含量。表I正常人血清游离kappa轻链和游离lambda轻链的含量
项目_参考值_'
kappa3.3 19.4 mg/L
lambda5.7-26.3 mg/L
kappa/lambda ratio0.26~1.65三、游离kappa轻链/游离lambda轻链的TRFIA性能指标考核I.灵敏度和线性范围游离kappa轻链/游离lambda轻链的TRFIA典型标准曲线和各浓度值的变异系数见图2。每个浓度点重复测10次，计算变变系数。图2显示各标准品浓度值的变异系数均小于10%。
以零参考标准品当作样品测量20次，计算其荧光均值及标准差，以该点荧光测定值减去2倍标准差所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出的浓度值为其灵敏度，经测定本试验灵敏度为0. 81mg/L(游离kappa轻链)和0. 35mg/L(游离lambda轻链)。2.准确度(回收试验)将实施例I中的冻干的系列标准品稀释为游离kappa轻链浓度11. 89, 51. 06,110. 33mg/L,加入至5个已知游离kappa轻链浓度的血清样本中(其游离 kappa 轻链浓度依次为 28. 65，56. 74，90. 92，154. 56，299. 68mg/L)。游离 lambda轻链浓度10. 67,58. 81,226. 03mg/L,加入至5个已知游离lambda轻链浓度的血清样品中(10. 59，23. 13，58. 63，116. 43，27 7. 45mg/L。通过计算实测值与理论值的比值，得出本实验在可测范围内其回收率。游离kappa轻链为95. 32%-101.6% ;游离lambda轻链为96. 78% -101. 24%。3.精密度取7份含不同浓度游离kappa轻链和游离lambda轻链的血清样本，样本来源和处理同实施例4，按相同的实验条件，在10天内重复检测定10次，每次实验时每份标本重复测10次，计算批内批间的变异系数。本方法的批内变异系数和批间变异系数均小于10 %，符合试剂盒规定要求。
权利要求
1.一种用于同步检测游离kappa轻链和游离lambda轻链浓度的时间分辨荧光免疫分析的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂 1)同时针对人源抗体重链和轻链的抗体， 2)用一种镧系元素标记的抗游离kappa轻链抗体， 3)用另ー种镧系元素标记的抗游离lambda轻链抗体， 4)游离kappa轻链和游离lambda轻链的标准品， 5)缓冲液， 6)洗涤液， 7)增强液。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述的同时针对人源抗体重链和轻链的抗体是来自非人源哺乳动物的抗人IgG抗体的多克隆抗体。
3.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述的同时针对人源抗体重链和轻链的抗体为固相抗体；所述固相抗体的固相载体为低荧光本底高吸附反应板。
4.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，试剂2)所述的用一种镧系元素标记的抗游离kappa轻链抗体是来自非人源哺乳动物的抗人游离kappa轻链的单克隆抗体或多克隆抗体；试剂3)所述的用另ー种镧系元素标记的抗游离lambda轻链抗体是来自非人源哺乳动物的抗人游离lambda轻链的单克隆抗体或多克隆抗体。
5.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，试剂4)所述的标准品为游离kappa轻链和游离lambda轻链的混合标准品。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的混合标准品包括O 600mg/L的所述游离kappa轻链与相同浓度的所述游离lambda轻链。
7.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述的镧系元素选自铕和钐中的任何一种。
8.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，试剂5)所述的缓冲液为Tris-HCl缓冲液；试剂6)所述的洗涤液为Tris-HCl缓冲液；试剂7)所述的增强液含有β - ニ酮。
9.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，试剂5)所述的缓冲液为含8mmol/LNaCl,O. Iwt % 明胶、O. 2wt % IgG、50 μ mol/L ニ こ烯三胺五こ酸、0. lml/L Tween-80 和 O. Iwt %NaN3的50mmol/L、pH7. 2的Tris-HCl缓冲液；试剂6)所述的洗涤液为含14. 5mmol/L NaCl、O. 2ml/L Tween-80 和 O. 2wt% NaN3 的 50mmol/L、ρΗ7· 2 的 Tris-HCl 缓冲液；试剂 7)所述的增强液为含15 μ mol/L β -萘甲酰三氟丙酮、50 μ mol/L三正辛基氧化膦和O. I (v/v) %TritonX-IOO的pH为3. 2的邻苯ニ甲酸氢钾缓冲液。
10.一种根据如权利要求I 9任一项所述试剂盒同步检测游离kappa轻链和游离lambda轻链浓度的时间分辨荧光免疫分析方法，依次包括以下步骤 1)在包被有同时针对人源抗体重链和轻链的抗体的固相载体中，加入游离kappa轻链和游离lambda轻链标准品或待测样品以及缓冲液，进行孵育； 2)用洗涤液洗涤后,加入用一种镧系元素标记的抗游离kappa轻链抗体和用另ー种镧系元素标记的抗游离lambda轻链抗体，进行孵育； 3)用洗涤液洗涤，然后加入增强液进行反应，之后进行时间分辨荧光检測。
全文摘要
本发明公开了一种同步检测游离kappa轻链和游离lambda轻链浓度的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括1)同时针对人源抗体重链和轻链的抗体，2)用一种镧系元素标记的抗游离kappa轻链抗体，3)用另一种镧系元素标记的抗游离lambda轻链抗体，4)游离kappa轻链和游离lambda轻链的标准品，5)缓冲液，6)洗涤液，7)增强液。本发明用一种同时针对人源抗体重链和轻链的抗体作为捕获抗体，使用分别仅针对游离kappa轻链和游离lambda轻链的另外两种抗体作为标记抗体，利用双标记时间分辨荧光免疫分析检测原理，建立可同时检测游离kappa轻链和游离lambda轻链浓度的新型检测方法。该方法灵敏度高，特异性强，稳定性好，可实现高度自动化。
文档编号G01N33/68GK102735845SQ201210192629
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者王金凤, 盛世乐 申请人:上海沪晶生物科技有限公司, 上海禾研生物技术有限公司