专利名称：大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术检测领域，涉及一种大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法。
背景技术：
大肠埃希氏菌(E. coli)属是肠杆菌科12个菌属中最重要成员，广泛存在于自然界并能引起人和动物共同感染的重要人畜共患病病原。依其致病机制可分为三类共生型、肠内致病型和肠外致病型。过去人们对肠内致病型E. coli研究较多，近年来肠外致病型E. coli备受关注。但E. coli菌体表面结构复杂，血清型种类繁多，不同地区流行的E. coli血清型也各不相同，且与肠杆菌科其他11个属细菌存在交叉反应，为E. coli·感染的血清学诊断和检测带来不少困难。目前，E. coli血清学检测方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光抗体试验(IFAT)和血清凝集试验(SAT)等。但这些血清学检测方法都存在着特异性等不足之处，且检测基本都是针对某一个血清型，因检测范围狭窄而使用受限。所以，尚缺乏通过单一抗原对所有血清型E. coli感染进行血清学诊断和检测的敏感、特异、快速、简便方法。OmpT是E. coli的特异性蛋白，由297个氨基酸构成，存在于所有E. coli中，具有高度保守性和属特异性。晶体结构显示，OmpT由10个β折叠构成、中心切面为13Χ16Α。的椭圆型花篮结构，蛋白活性位点位于细胞外。OmpT蛋白是菌血症的主要蛋白抗原，其既能诱导特异性抗体产生，亦能诱导机体的细胞免疫应答。鉴于OmpT蛋白具有这些重要的功能及良好的抗原性，本发明选取ompT基因，采用重组技术对其进行基因克隆和原核表达，表达产物进行亲和层析获得纯化的OmpT重组蛋白。经过重组表达的OmpT蛋白既保留了其良好的抗原性，又提高了 OmpT蛋白的产量。该抗原不仅具有高度的属特异性，且具有高纯度和高稳定性，提取纯化后适宜作为抗原包被酶标板建立间接ELISA检测方法。目前，尚无一种使用OmpT重组蛋白检测大肠埃希氏菌的ELISA检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供了一种大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法，解决目前对大肠埃希氏菌的检测范围狭窄，尚缺乏通过单一抗原对所有血清型E. coli感染进行血清学诊断和检测的敏感、特异、快速、简便方法。本发明通过以下技术方案来实现一、一种大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法，所述的检测抗原为OmpT重
组蛋白。OmpT重组蛋白是通过以下方法制备而成(I)提取大肠埃希氏菌的DNA ；(2)根据NCBI数据库已公布序列AE014075设计引物，PCR扩增出ompT基因，引物序列如下
OmpT-Tl :5，-CG |GGATCCj ATGCGGGCGAAACTTCT-3，(SEQ ID No. I)ompT~T2 :5’ -GGC lGTCG^Arl TTAAAAGGTGTACTTAAGACCAGC-3 (SEQ ID No. 2)(3)扩增的PCR产物回收和纯化；(4)PCR产物与T载体连接，连接产物转入感受态细胞，经过酶切鉴定，筛选阳性克隆，序列测定；(5) BamH I、Sal I双酶切阳性克隆的质粒以及pET_32a，构建pET-32a-ompT表达载体，转入感受态细胞，培养后挑取阳性克隆，双酶切鉴定；
(6)将阳性克隆的培养液用IPTG诱导表达OmpT重组蛋白。所述的PCR扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性45s，60. 5°C退火45s，72°C延伸90s，进行30个循环，最后72°C延伸IOmin。二、一种大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法,该方法包括以下步骤(I)待检血清按照1:640稀释后，与酶标板上的OmpT重组蛋白37°C孵育I. 5h，洗板三次；(2)加入辣根过氧化物酶标的兔抗牛IgG与待检血清37°C孵育I. 5h ；(3)加入TMB底物进行显色IOmin ；(4)终止反应后检测OD450, OD450值彡O. 335为阳性，OD450值< O. 335为阴性。该方法在检测大肠埃希氏菌中的应用。具体方法如下以提取的大肠埃希氏菌DNA作为PCR反应模板扩增出ompT基因，将其克隆进表达pET-32a质粒中，再转入表达宿主菌E. coli rosetta(DE3)中，将获得的含有阳性表达质粒的重组菌，按常规方法诱导表达，将表达蛋白经纯化、定量后包被酶标板，建立检测大肠埃希氏菌OmpT抗体的间接ELISA方法。I、大肠埃希氏菌OmpT蛋白表达质粒的构建按常规方法提取大肠埃希氏菌DNA作为PCR反应的模版扩增出ompT基因片段，经克隆、测序验证，将其克隆pET-32a表达质粒中，再转入表达宿主E. coli rosetta(DE3)中，双酶切、PCR鉴定及测序，结果均证明所得为阳性pET-32a-ompT质粒，重组菌命名为大肠埃希氏菌pET-ompT菌株。2、OmpT蛋白表达、鉴定及纯化、定量将经诱导表达的菌体12000r/min离心lOmin，将沉淀以10倍浓缩比例重悬于PBS中，超声破碎裂解菌体，离心取上清结合NI-NTA柱，用咪唑洗脱法纯化重组蛋白，取样经四亚群大肠埃希氏菌免疫血清和对照菌免疫血清Western blot鉴定及免疫原性、普遍性和特异性验证。并根据Bradford法确定蛋白浓度。3、酶标反应板的制备包被将OmpT重组蛋白作为抗原，用0. 05M pH7. 6 Tris盐酸缓冲液稀释后包被96孔板，包被浓度I μ g/孔，置湿盒中4°C 12-14小时，PBST洗板3次，每次3min，然后拍干；得到抗原OmpT包被酶标反应板。封闭用含1°/观4加满孔(约20(^1/孔)，371孵育，封闭lh，洗板三次，拍干密封；即得到OmpT包被酶标板。采用上述技术方案的积极效果本发明用大肠埃希氏菌的标志性基因OmpT制备的重组蛋白作为ELISA的检测抗原，与以往大肠埃希氏菌抗原相比，该重组抗原可规模化、标准化生产，且特异性强，适于大肠埃希氏菌属所有血清型细菌感染后抗体检测。
图I是重组表达质粒的鉴定结果。I DNA Marker, 2 PCR 鉴定，3 :双酶切鉴定。图2是OmpT重组蛋白表达图。M :蛋白Marker，I :空载体诱导前，2 :工程菌诱导2小时，3 :工程菌诱导3小时，4 工程菌诱导4小时，5 :工程菌诱导5小时，6 :工程菌诱导前，7 :空载体诱导5小时，8宿主菌诱导前。
图3是四个种系发育群代表菌免疫血清与OmpT重组蛋白免疫印迹图谱。A :0mpT重组蛋白与E. coli C83919血清免疫印迹，BI :0mpT重组蛋白E. coli2002-1血清免疫印迹，B2 :0mpT重组蛋白与E. coli J96血清免疫印迹，D :0mpT重组蛋白与E.coli 0157H:7EDL933 血清。
具体实施例方式本发明中生物材料的来源说明I、菌种大肠埃希氏菌C83919 :购自国家兽医微生物菌种保藏中心；大肠埃希氏菌2002-1 :奶牛乳房炎肠杆菌OmpA的免疫原性分析及对小鼠感染模型的免疫保护效果评估，呼锐，樊自尧，佟春玉，迟佳琦，李闰婷，丁兆凤，陈龙欣，陈亮，于立权，马金柱，宋佰芬，朱战波，崔玉东，中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集，2010年，363-366，并由申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；大肠埃希氏菌J96 :尿路致病性大肠杆菌临床株I型菌毛FimH基因检测及分析，尹晓琳，王秀荣，胡洁，冯惠东，魏林，河北医科大学学报，2003年第24卷第03期，136-138页，该菌种由河北医科大学基础医学院魏林老师赠送给本申请人，并由申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；另外，该生物材料还公开在奶牛乳房炎肠杆菌OmpA的免疫原性分析及对小鼠感染模型的免疫保护效果评估，呼锐，樊自尧，佟春玉，迟佳琦，李闰婷，丁兆凤，陈龙欣，陈亮，于立权，马金柱，宋佰芬，朱战波，崔玉东，中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集中，2010年，363-366，并由申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；大肠埃希氏菌0157H 7EDL933 :大肠杆菌0157噬菌体的分离鉴定及其初步应用，杜崇涛，硕士论文，授予单位吉林大学，导师冯书章，发表时间2008年；该菌种由吉林大学畜牧兽医学院杜崇涛老师赠送给本申请人，并由申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；弗氏志贺菌ATCC 12022，肺炎克雷伯菌ATCC 35281，普通变形杆菌ATCC 49027，绿脓杆菌ATCC27853，金黄色葡萄球菌ATCC 25923均购自中国药品生物制品鉴定所；牛巴氏杆菌CVCC 44702，鸡沙门氏菌CVCC 520，奇异变形杆菌CVCC 1969，无乳链球菌CAU0306，均购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心。2、引物ompT基因特异性引物是根据基因序列自行设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。3、辣根过氧化物酶标的兔抗牛IgG购自sigma公司。4、作为感受态细胞的DH5a和E.coli rosetta (DE3)购自博美科生物技术有限公司。
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制实施例I本实施例用于说明ompT基因的获得以及表达载体的构建，具体步骤如下I、按照大肠埃希氏菌ompT基因序列(GenBank Accession No. AE014075),利用01igo6. O软件分析，自行设计一对引物，引物两端分别加限制性酶切位点BamH I和Sal I(方框内)及保护性碱基。经计算机BLAST软件分析，具有较好的特异性。引物的核苷酸序列为ompT-Tl :5，-CG |GGATCC[ ATGCGGGCGAAACTTCT-3j (SEQ ID No. I)ompT~T2 :5’ -GGC lGTCG-\^ TTAAAAGGTGTACTTAAGACCAGC-3 (SEQ ID No. 2)2、以提取的E. coli 2002-1株菌体DNA作为模版进行PCR扩增，扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性45s，60. 5°C退火45s，72°C延伸90s，进行30个循环，最后72°C延伸IOmin0扩增出的ompT基因片段采用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段。3、扩增的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳后，紫外灯下切割目的条带，用DNA凝胶回收试剂盒(Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System)回收和纯化DNA,具体步骤参照说明书进行。4、将所得片段与T载体连接，将连接产物10 μ L加入到新制备的感受态细胞中，轻旋混匀。冰浴30min ;42°C热休克90s，立即冰浴2min。然后加入到ImL 37°C预热的液体LB培养基中，37°C 100r/min振摇45min ;5，000r/min离心2min,弃去800 μ L上清，余下的200 μ L培养液涂布于固体LB平板(含100μ g/mLAmp+)，37°C培养12h。5、挑取转化板上的单一菌落,无菌接至3mL LB/Amp+ (Amp+终浓度为100 μ g/mL)液体培养基中，震荡培养12h后，采用试剂盒提取小量质粒。6、取克隆重组质粒进行PCR和BamH I、Sal I双酶切鉴定。PCR反应体系及条件同上。混匀后37°C水浴2-3h，取出后全部上样，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。7、将pET_32a载体提取质粒，用BamH I和Sal I进行双酶切后，用DNA纯化/回收试剂盒回收。同时将质粒pMD18-T-0mpT用BamH I和Sal I进行双酶切，使用DNA纯化/回收试剂盒回收ompT基因片段。将目的片段与载体pET-32a连接。16°C连接过夜后，热转化至E. coli rosetta感受态细胞中，通过Amp抗性、PCR和限制性内切酶双酶切进行筛选和鉴定后，(如图1)，目的条带为lOOObp，将阳性克隆进行测序。实施例2本实施例说明重组蛋白的诱导表达以及纯化，具体步骤如下I、对于序列正确的菌落，挑取单个菌落接种于含Amp+的液体LB培养基中，37°C振荡过夜。取过夜培养物按2%的量接种于含Amp+的液体LB培养基中，37°C振荡培养至A600值O. 5 I. O，加IPTG至终浓度为ImM，继续在37°C振荡培养，并在培养的不同时刻(2、3、4、5、6h)各从培养物中取出ImL菌液转移到离心管中，10，000r/min离心5min，收集菌体沉淀，加入90 μ L 2 X上样缓冲液和10 μ L lmol/L DTT悬浮混匀，煮沸5min, 10，000r/min离心5min后立即使用，或-20 V储存，用前100 V加热5min。2、SDS-PAGE凝胶电泳组装好电泳设备，拔出样品梳，每孔加入10 μ L的样品，样品在浓缩胶中采用8v/cm的电压进行电泳，在分离胶中采用15V/cm的电压进行电泳。待溴酚蓝至分离胶底部约Icm时，停止电泳。取出凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液在摇床上染色30min左右，然后脱色至背景清晰，用清水冲洗、照相。SDS-PAGE表明，在IPTG的诱导下，转化有重组质粒的大肠杆菌rosetta(DE3)可高效表达融合蛋白；时间梯度结果表明，4h_5h的诱导量最高(如图2)。3、按最佳诱导时间培养重组菌,10, OOOg离心5min,沉淀重悬后超声波破碎， 4000r/min再离心IOmin,分别取10 μ L上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳(8%分离胶,5%浓缩胶)，以确定重组蛋白是否为可溶性表达，并用NI-NTA柱纯化。实施例3本实施例说明OmpT蛋白的抗原性以及特异性验证。I、按“半干法”进行将SDS-PAGE后的凝胶中的蛋白质转到NC膜上，用全菌体免疫血清和蛋白免疫血清分别作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗进行western-blotting检测表达的蛋白质。结果四个E. coli种系发育群小鼠免疫血清作为一抗的western-blotting均出现清晰可见的一条带(图3),表明表达的OmpT蛋白具有良好的抗原性和保守性，纯度高。2、用微量加样器向96孔聚苯乙烯微孔反应板(酶标板)，以每孔25 μ L加入稀释液(第一孔除外)。第一孔加入50 μ LOmpT纯化蛋白免疫小鼠血清，从第一孔血清中取出25 μ L加入到第二孔中，用加样器以吹打方式混合5次，混匀后用微量加样器吸取25 μ L加入第三孔中，同样采用吹打方式混匀，依次到第12孔，最后在第12孔取出25yL弃掉。每孔分别加入已制备的菌体抗原 25μ L :Α 群:Ε· coli C83919 ；B1 群E. coli 2002-1 ;B2 群E. coliJ96山群E. coli 0157H:7EDL933，验证各种系发育群E. coli抗原的保守性，结果E. coli四个种系发育群均与OmpT蛋白免疫血清发生凝集反应；同时，与9株非E. coli对照菌株做凝集实验以验证其特异性，结果9株非E. coli对照菌株均未与OmpT蛋白免疫血清发生凝集反应。实施例4本实施例用于说明大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法的建立(以牛血清检测为例)I、ELISA检测的试剂(I)包被液0. 05mol/L Tris-HCl 缓冲液，4°C保存。(2)样本稀释液含1%牛血清白蛋白(BSA)磷酸盐-吐温缓冲液。(3)封闭液含1%牛血清白蛋白(BSA)磷酸盐-吐温缓冲液。(4)酶标二抗兔抗牛 IgG/HRP。(5)底物缓冲液(磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)) 0. 2mol Na2HPO4 · 12H2025. 7mL, 0. Imol 朽1 樣酸 24. 3mL,去离子水 5OmL0
(6) TMB底物显色液0. Olg TMB干粉溶于ImL DMSO中，取底物缓冲液9. 9mL加30 μ L H2O2,再加入 DMSO 溶解的 ΤΜΒ100 μ L。(7)终止液(2Μ H2SO4):蒸馏水 178. 3mL，逐点加入浓 2M 的 H2SO4 21. 7mL。(8) O. 05%PBST :在上述 PBS 中加入 O. 5mL 的 Tween-20。2、反应板均一性测定从购买的酶标板中随机抽取8块，酶标板用3000倍稀释后的酶标二抗以100 μ L/孔包被，4°C包被过夜。PBST洗3次，每次间隔5min，洗涤后拍干，以200 μ L/孔加入5%脱脂乳封闭液，370C Ih,按上述方法再次洗涤。以100 μ L/孔加入TMB底物显色液，37°C避光反应lOmin，在酶标仪上测其0D450数值，计算各个孔间的标准差和变异系数，分析不同酶标板间的均匀度。经统计分析，各孔在0D450时平均值为I. 347，变异系数为4. 6%，小于5%， 表明这种酶标板均一性良好，能够满足ELISA检测试验的要求。3、最佳包被缓冲液的选择OmpT 蛋白抗原分别用碳酸盐缓冲液(pH9.6)、PBS (pH 7. 2),Tris-HCl (pH 7.6)、柠檬酸盐缓冲液(I. OM pH6. O)、水(pH7. O)进行包被，每种包被液体做4个重复，4°C过夜，血清根据最佳浓度稀释，以下按ELISA操作步骤进行，测其0D450值并计算P/N值，用Tris-HCKpH 7. 6)作为包被缓冲液时的P/N值都一直最大。所以，选择Tris_HCl(pH 7.6)作为最佳包被缓冲液。4、OmpT蛋白抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定阴阳性血清分别做40-1280倍稀释，与梯度稀释的包被抗原做交叉反应试验，每个稀释度做4个重复。结果当包被抗原浓度降低、阴阳性血清浓度减小时，0D450值不断变小。当抗原的稀释浓度为lyg/ L阴阳性血清的稀释倍数为1:640，此时P/N值最高。所以，确定最佳的抗原包被浓度为Iyg/孔，血清的稀释倍数为1:640。5、酶标二抗工作浓度的确定将OmpT蛋白和阴阳性血清分别作最佳稀释后进行ELISA操作，酶标二抗根据说明书分别作I :3000,1 :6000,1 :12000、I :24000梯度稀释进行ELISA试验，测其0D450时的值并计算P/N值。结果当抗原和血清最佳工作浓度确定后，酶标二抗以1:6000稀释时的P/N值最大，确定酶标二抗最佳稀释浓度为1:6000。6、封闭液的选择将OmpT蛋白抗原、一抗血清和酶标二抗分别按照已确定的最佳浓度进行稀释。分另Ij用5%脱脂奶粉、1%明胶、1%牛血清白蛋白和10%胎牛血清做封闭液，进行间接ELISA试验。测0D450时数值并计算P/N值。结果OmpT-ELISA用1%BSA_PBST封闭液效果最佳。7、封闭时间的确定采用已确定的最佳封闭液在37°C封闭30min、lh、l. 5h、2h，其它反应条件按以上确定进行，在0D450时测量其数值并做P/N计算，确定最佳的封闭时间。结果OmpT -ELISA37°C封闭Ih效果最好。8、血清稀释液的选择比较5%脱脂奶粉、l%BSA、PBS、Tris盐酸盐缓冲液作为血清稀释液时的P/N值，确定最佳的血清稀释液。结果1%BSA作为血清稀释液的效果明显好于Tris-HCl和PBS。9、抗原和血清反应时间的确定
抗原抗体反应会随着时间的增加，反应量也增加,但达到一定的时间后，反应即达到平衡，OmpT蛋白抗原按上述确定的最佳反应条件，阴性与阳性血清各做8个重复，37°C分另Ij作用O. 5h、lh、l. 5h、2h四个反应时间的验证。测其0D450时数值，确定P/N值最大的反应时间。结果OmpT蛋白抗原在37°C下与血清反应I. 5h时P/N值最大，阴性平均值也较小。10、酶标二抗的作用时间的确定OmpT蛋白抗原按最佳包被浓度包被酶标板，4°C过夜，将标准阳性、阴性血清以最佳稀释倍数稀释，酶标二抗作I :6000稀释，酶标二抗的作用时间设O. 5h、lh、l. 5h、2h四个反应组，每组阴性和阳性对照各做8个重复，按照ELISA操作程序进行，测其在0D450数值，比较P/N值确定反应时间。结果OmpT酶标二抗作用1.5h时，P/N值最大，且阳性值都大于
I.0，阴性值都小于O. 2，因此OmpT-ELISA酶标二抗的作用时间确定为I. 5h。11、底物显示时间的确定
按照已确定的ELISA反应程序依次包被、封闭、加入阴阳性血清，各做8个重复，再和酶标二抗反应I. 5h之后加入TMB底物显色，370C孵育反应设5min、IOmin, 15min、20min四个显色时间，测定在0D450时数值。选取阳性平均值接近I. O,阴性OD平均值比较小，且P/N值最大的一组作为最佳的底物显色时间。结果在37°C条件，与底物作用IOmin的阳性0D450值可以达到1.0以上，而阴性0D450值在O. 2以下，P/N值最大，底物显色时间确定为IOmin012、间接ELISA方法阳性临界值的确定用OmpT蛋白抗原包被酶标板，按照前面已建立的间接ELISA检测方法，检测170份血清凝集试验判定为阴性的牛血清。每份血清做三次重复,记录样本的0D450值并计算平均值(X)和标准差⑶。当样本0D450值彡X+3S时，判定此血清为阳性血清；相反，判定为阴性血清。结果间接ELISA方法阴阳血清的判定值为O. 335。即血清样品0D450值彡O. 335就可以判断为阳性，< O. 335为阴性。13、特异性和敏感性试验用已建立间接ELISA方法，对170份E. coli凝集实验为阴性和170份全菌疫苗免疫凝集实验为阳性的牛血清稀释640倍后进行检测。阴性血清的检出率体现所建立间接ELISA方法的特异性，阳性血清的检出率体现所建立的间接ELISA方法的敏感性。即间接ELISA方法特异性=(ELISA阴性血清数量)/ (全菌凝集实验阴性血清数量)X 100% ；ELISA方法敏感性=(ELISA阳性血清数量)/ (全菌疫苗免疫阳性血清数量)X 100%。结果间接ELISA方法的特异性为96. 5%，敏感性为100%。14、检测灵敏度试验将阳性和阴性血清平行倍比稀释，按建立的间接ELISA方法检测血清中抗体的含量，将P/N ^ 2. I的最大血清稀释度作为ELISA检测方法的灵敏度。结果通过对血清的倍比稀释后检测发现，当血清稀释度达到1:6400时，P/N值仍大于2. 1，说明所建立的间接ELISA方法有很高的灵敏度。15、重复性试验(I)批内重复性试验用同一次纯化的OmpT重组蛋白包被酶标板，取8份不同的血清，在一起按已确立的间接ELISA检测程序测定，每份样品做6个平行孔，结果进行统计学分析。结果检测样品的变异系数(CV)在2%-9%之间，都小于10%。此方法有很好的重复性。(2)批间重复性试验用同一次纯化的OmpT重组蛋白抗原包被4块酶标板，取8份不同待测样本，在4个时间按照已确立的间接ELISA检测程序测定样本，每份血清样本设6个平行孔，结果进行统计学分析；用4次不同批次纯化的OmpT重组蛋白抗原包被酶标板，取8份不同的血清样本在同样条件下进行检测，每份血清样本设6个平行孔，结果进行统计学分析。结果检测样品的变异系数(CV)在2%-9%之间，都小于10%。此方法有很好的重复性。实施例5本实施例用于说明大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测板的制备及检测流程，具体步骤如下
(I)将已纯化重组OmpT蛋白用(λ 05M Tris-HCKpH 7. 6)缓冲液稀释10 μ g/mL后，用微量加样器吸取稀释好的样品加入孔内，100 μ L/孔，4°C冰箱12 14h，PBST洗板3次，每次3min，然后拍干；洗涤冰箱过夜后取出ELISA板，甩干内容物，加入洗液PBST，200 μ L/孔，震荡5min，甩干，洗涤3次，最后一次甩干拍打干净；(2)加入 1%BSA-PBST, 100 μ L/ 孔，37°C lh，洗板 3 次后密封。(3)待检血清稀释加入I :640稀释的待检血清到包被好的酶标反应板，100 μ L/孔，37°C孵育，I. 5h，洗板三次；(4)加酶标物被检测物种的特异IgG抗体或采用酶标记的SPA，100yL/孔，37。。I. 5h，洗板三次；(5)显色将配置好的TMB底物溶液100 μ L/孔加入，37°C避光IOmin ；(6)终止反应加入终止液2mol/L的H2S0450 μ L/孔，室温下5min ；(7)确定血清阴阳性临界值，按照前面已建立的间接ELISA检测方法，检测阴性的血清。每份血清做三次重复，记录样本的0D450值并计算平均值(X)和标准差(S)。当样本0D450值彡x+3S时，判定此血清为阳性血清；相反,判定为阴性血清。(8)结果判断利用酶标仪，空白孔调零，读取450nm波长处吸光度，即0D450值。大于临界值的为阳性，小于临界值的为阴性。试验例I本试验例用于验证本发明的大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测板的准确性，具体步骤如下取10份已经感染大肠埃希氏菌的阳性血清，以及被9株对照菌(弗氏志贺菌ATCC12022、肺炎克雷伯菌ATCC 35281、普通变形杆菌ATCC 49027、绿脓杆菌ATCC27853、牛巴氏杆菌CVCC 44702、鸡沙门氏菌CVCC 520、奇异变形杆菌CVCC 1969、无乳链球菌CAU0306、金黄色葡萄球菌ATCC 25923)感染后的抗体血清，应用本发明的ELISA检测板进行检测，判定方法同实施例5。结果发现，本发明的ELISA检测板准确率可达100%，可以作为检测大肠埃希氏菌的一种简单有效的方法。
权利要求
1.一种大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法，其特征在于所述的ELISA中酶标板上的检测抗原为OmpT重组蛋白。
2.根据权利要求I所述的大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法,其特征在于所述的OmpT重组蛋白是通过以下方法制备而成 (1)提取大肠埃希氏菌的DNA； (2)根据NCBI数据库已公布序列AE014075设计引物，PCR扩增出ompT基因，引物序列如下ompT-Tl :5’ -CG i|GGATCd ATGCGGGCGAAACTTCT-3，(SEQ ID No. I)ompT-T2 :5’ -GGC |GTCGACl TTAAAAGGTGTACTTAAGACCAGC-3j (SEQ ID No. 2) (3)扩增的PCR产物回收和纯化； (4)PCR产物与T载体连接，连接产物转入感受态细胞，经过酶切鉴定，筛选阳性克隆，序列测定； (5)BamHI,Sal I双酶切阳性克隆的质粒以及pET_32a，构建pET-32a-ompT表达载体，转入感受态细胞，培养后挑取阳性克隆，双酶切鉴定； (6)将阳性克隆的培养液用IPTG诱导表达OmpT重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法,其特征在于所述的PCR扩增条件为941预变性5111111，941变性458，60. 5°C退火45s，72°C延伸90s，进行30个循环，最后72°C延伸IOmin。
4.一种大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法,其特征在于该方法包括以下步骤 (1)待检血清按照1:640稀释后，与酶标板上的OmpT重组蛋白37°C孵育I.5h，洗板三次； (2)加入辣根过氧化物酶标的兔抗牛IgG与待检血清37°C孵育I.5h ； (3)加入TMB底物进行显色IOmin； (4)终止反应后检测OD450,OD450值彡0. 335为阳性，OD450值< 0. 335为阴性。
5.权利要求I或4所述的方法在检测大肠埃希氏菌中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法，所述的ELISA中酶标板上的检测抗原为OmpT重组蛋白。检测方法包括以下步骤待检血清按照1:640稀释后，与酶标板上的OmpT重组蛋白37℃孵育1.5h，洗板三次；加入辣根过氧化物酶标的兔抗牛lgG与待检血清37℃孵育1.5h；加入TMB底物进行显色10min；终止反应后检测OD450，OD450值≥0.335为阳性，OD450值＜0.335为阴性。本发明用大肠埃希氏菌的标志性基因OmpT制备的重组蛋白作为ELISA的检测抗原，该重组抗原可规模化、标准化生产，且特异性强，适于大肠埃希氏菌属所有血清型细菌感染后抗体检测。
文档编号G01N33/569GK102707054SQ201210199910
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者佟春玉, 崔玉东, 朱战波, 马金柱 申请人:黑龙江八一农垦大学