专利名称：目标诱导链释放和限制性内切酶酶切循环的信号放大技术建立及赭曲霉素a的检测的制作方法
技术领域：
本发明属于化学发光检测技术领域，特别涉及一种信号放大技术的研制和一种化学发光探针的制备，在其应用上涉及赭曲霉素A(Ochratoxin A, 0ΤΑ)含量的检测。
背景技术：
根据世界卫生组织(WHO)统计报告表明，食源性疾病已经成为当今世界上分布最广泛、最常见的疾病之一。食源性相关疾病的发病率居各类疾病总发病率的前列，并成为当前国际上最突出的公共卫生问题。造成食源性相关疾病的食品安全问题主要集中在生物毒素危害、化学危害、食品微生物危害、寄生虫危害等几个方面。在粮食供应中，毒素可由许多途径产生，如农业生产、工业加工以及储藏运输活动等；这些有害物质在ng/g pg/g、甚至更低的水平上对人类的身体有害。食品中霉菌毒素污染是一个特殊问题，这是由于 真菌感染的谷物豆类、水果干、花生、啤酒和葡萄汁等加工后还会存在于食品中。每年都有很多人由于食品中有害物质而感染疾病[Ligler F S，Taitt C R，Shriver-Lake L C，Sapsford K E，Shubin Y，Golden J P.2003. Analytical and Bioanalytical Chemistry,377 :469-477] 0例如，最常见的疾病胃肠炎，其就是由于摄入受金黄色葡萄球菌肠毒素(SEs)污染的食物所引起的。赭曲霉毒素A是天然存在的霉菌衍生代谢产生的一种真菌毒素，能使人的肾脏受损、动物的产蛋率下降，并有致畸、致癌作用，而且赭曲霉毒素A还可通过母亲的血液转入到乳汁中婴儿摄取[张艺兵，鲍蕾，褚庆华.2006.北京化学工业出版社；Duarte S C, Pena A, Lino C Μ. 2010. Food Microbiology, 27 187-198 ；EekekogluP, Sabuncuoglu S, Sydin S, Sahin G. 2010.Belma Giray Toxicon, 55 :507-513 ;DuarteS, Bento J, Pena A, Lino C M, Delerue-Matos C, Oliva-Teles T, Morais S, Correia M,Oliveira MBP P,Alves M R, Pereira J A. 2010. Science of the Total Environment,408 :1195-1198]。因此，很多国家都对食品中的OTA含量都有限制。OTA检测技术已经得到长足的发展。现在OTA检测方法主要是色谱技术，包括薄层色谱(TLC)，气相色谱(GC)，高效液相色谱(HPLC)，液相色谱-质谱联用(LC-MS)，固相萃取-液相色谱-电喷雾质谱联用(SPE-LC-ESI-MS)，毛细管电泳法(CE)等。此外，固相微萃取-液相色谱-荧光检测也已经报道过了。自从Cruz-Aguado和Penner在2008年发现了具有选择性识别OTA的DNA适体后，科研人员相继研究出了一系列基于OTA适体的检测OTA的新方法。这开辟了一种 OTA 真菌毒素检测的新局面[Wang Z P, Duan N, Hun X, Wu S J. 2010. Analytical andBioanalytical Chemistry. 398，2125-2132.]。尽管这些OTA检测方法自身有很多优势，但仍然需要寻找一些新方法来提高测定的灵敏度和选择性。提高生物传感器灵敏度的有效方法之一就是建立新的信号放大技术。一些信号放大技术如聚合酶链反应(PCR)，滚环放大(RCA)，环介导等温放大(LAMP)和限制性内切酶信号放大都已经见诸报道了。在这些方法中，限制性内切酶信号放大方法是借助切口酶为工具，以循环利用为原理，使一个待测目标物产生多个信号单元。这种切口酶的酶切循环信号放大技术在分析检测中取得了高的灵敏度，开辟了新的信号放大原理和分析测定技术，这种方法测定的灵敏度较普通方法(没有经过切口酶的酶切循环信号放大过程)提高了许多[Jia H X,Li Z P, Liu C H,Cheng Y Q. 2010. Angewandte Chemie International Edition,49 :5498-5501]。本发明的目的是利用DNA聚合酶聚合作用和切口酶酶切作用原理构建以一个目标待测物产生多个信号单元的信号放大技术，以功能化的纳米粒子为标记物，实现高灵敏度对OTA行进测定。本发明所提供的方法包括以下步骤(I)制备功能化的纳米粒子。所述的方法，其所述的纳米粒子为表面具有活性基团的二氧化硅纳米粒子、金纳 米粒子、磁性纳米粒子、量子点、聚合物纳米粒子、脂质体以及没有活性基团的金纳米粒子。(2)利用化学发光试剂对功能化的纳米粒子进行修饰，制备化学发光纳米粒子。所述的方法，其所述的化学发光试剂为鲁米诺、鲁米诺衍生物；光泽精、洛粉碱、过氧化草酸酯类以及吖啶酯类及其衍生物。(3)利用识别作用DNA5对化学发光纳米粒子进行修饰，得化学发光纳米粒子探针。(4)利用适体DNAl和互补DNA2对磁性微珠进行修饰制备功能化的磁性微珠(FMBl)。(5)利用DNA4对磁性微珠进行修饰制备另外一种用于捕获后续DNA的功能化的磁性微珠FMB2。(6)利用OTA与适体DNAl的作用，将(4)中制备的功能化磁性微珠表面的DNA2置换下来，释放DNA2 ;将释放出的DNA2与模板DNA3反应，生成部分互补的双链，在DNA聚合酶和切割酶的作用下，实现生长于切割的循环，生成大量的短链DNA。(7)所述的方法，其所述的对短链DNA产生作用的酶为聚合酶Phi29，进行切割的酶为限制性内切酶Nb. BbvCI。(8)以化学发光纳米粒子为探针，利用功能化磁性微珠表面DNA3捕获作用连接
(6)生成的短链DNA，引起功能化磁性微珠表面化学发光试剂浓度的变化。(9)化学发光检测。将(8)中捕获有化学发光探针的磁性微珠进行化学发光测定，据此实现对OTA的检测。
图I为本发明的实验原理示意图。图2不同目标物的检测结果图。图3为化学发光强度与OTA浓度的标准曲线图。
具体实施例方式下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但本发明的实施方法不限于此。I本发明所用的试剂
4-氧-4-[[3-(三乙氧硅基)丙基]氨基]-2-丁酸(OTSPAB)从上海信达化学工业有限公司(上海，中国)购进。四乙氧基硅烷(TEOS)，正己醇，曲拉通X-100 (TX-100)和环己烷都是从上海化工厂购进(上海，中国)。N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和I-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)是从Sigma (St. Louis, USA)购进的。N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)是从 Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. (Tokyo, Japan)买进的。DNA聚合酶Phi29(10Ul·! L—1)(包含Phi29聚合酶反应缓冲溶液)和三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液(dNTPs) (IOmM)和 Nb. BbvCI (10U μ Γ1)(包含缓冲液 2)都是从 New England BiolabsCo. Ltd. (Ipswich,MA, USA)买进。OTA 是从 Sigma-Aldrich (USA)购进。(注意:0ΤΑ 是一种具有很强的致癌作用的药品，因此特别注意的是尽量避免与它接触。受污染的OTA原料，赭曲霉毒素和法华林必须妥善处理。)轻基化磁性微珠(MBl) (I μ m-1. 5 μ m, IOmg ml/1)和轻基化磁性微珠(MB2) (100-200nm, 5mg mL—1)是从天津贝思乐色谱技术开发中心买进的(天津，中国)。所有的试剂都是分析纯并且使用前不需要进一步进行纯化。结合缓冲液(BB)(IOmM Tris, pH8. 5,120mM NaCl，5mM KCl，和 20mM CaCl2)用于在适体和 OTA 之间的结合反应。2本发明所用的DNA由赛百盛基因技术有限公司(北京，中国)合成，序列如下 2. I DNAl 5/ -NH2-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3'2. 2 DNA2 5/ -CAC CCA CAC CCG ATC-3'2. 3 DNA3 5'-ACT CCC CGG ATT CCTCAGC GAT CGG GTG TGG GTG-3'2.4 DNA4 :5'-NH2_AAC TTA ACT CCC CGG-3'2. 5 DNA5 :5'-ATT CCT CAG AGG TAC-3'。3化学发光纳米粒子探针的制备3. I功能化二氧化硅纳米粒子的合成。将I. 77mL表面活性剂TX-100，7. 5mL环己烧和I. 8mL助表面活性剂正己醇用磁力搅拌器混合30min.。然后，加入0. 48mL水，并持续搅拌至混合物形成均匀的油包水微乳液体系。加入IOOyL TE0S，然后加入60yLNH3 · H20(28-30wt. % )开始水解反应。持续搅拌12h，然后加入100 μ L OTSPAB和60 μ LΝΗ3·Η20并继续搅拌。12h后，加入25mL丙酮破乳。在8000rpm下，离心IOmin.，收集产物。用乙醇和水超声、离心洗涤数次，室温干燥。3. 2 ABEI标记二氧化硅纳米粒子。将三滴0. IM HCl滴入0. 0980g ABEI中，然后用水稀释至IOmL获得0. 036M浓度的ABEI溶液。然后取I. OmL准备好的功能化二氧化硅纳米粒子分散于3. OmL的磷酸盐缓冲液中，加入IOmg NHS和20mg EDC，在37摄氏度下反应60分钟。最后加入ABEI溶液，在室温下轻轻晃动反应12小时。所得ABEI标记二氧化硅纳米粒子保存在4摄氏度的环境中。3. 3 DNA修饰的ABEI标记二氧化硅纳米粒子制备。首先,将2mg的ABEI标记二氧化硅纳米粒子加入到0. IM磷酸盐缓冲液中。然后加入90mg的NHS和180mg的EDC，在37摄氏度下反应一小时。生成的产物用2. OmL的0. IM磷酸盐缓冲液冲洗3次。最后，往上述所得溶液里加入5. O X IO-7M DNA5，在37摄氏度下恒温反应12小时，得化学发光纳米粒子探针。然后用2. OmL的0. IM磷酸盐缓冲液冲洗3次，分散在2. OmL磷酸盐缓冲液中，在4摄氏度下保存。4功能化磁性微珠(FMB)的制备。
4. I功能化磁性微珠(FMBl)的制备。将150 μ L KT7M的DNAl和2000 μ L O. IM的咪唑缓冲液(pH为6. 8)混合，37°C下反应30min，再加入1000 μ L O. IM的EDC和50 μ L磁珠，继续反应12h，得DNAl修饰的磁性微珠。然后用PBS洗三次，定容至500 μ L。于I. 5mL样品管加入50 μ L的DNAl修饰的磁性微珠，再加入50 μ L，IO^7M的DNA2，37°C下杂交4h，用PBS缓冲液洗三次，稀释至50 μ L制得功能化的磁性微珠。4. 2 功能化磁性微珠(FMB2)的制备。将 150 μ L 的 DNA4 (I(T7M)和 2000 μ L O. IM的咪唑(pH为6. 8)混合，37°C下反应30min，再加入1000 μ L O. IM的EDC和50 μ L磁珠继续反应12小时。用PBS洗三次，然后稀释至500 μ L，得DNA4修饰的磁性微珠。50ΤΑ含量的检测。5. I取含OTA的样品溶液50 μ L加入到200 μ L的FMBl溶液，37摄氏度反应大约50分钟，然后混合物在磁力架上分离。5. 2将上述5. I的上清液转移到装有DNA3溶液的试管中。然后加入Phi29缓冲溶 液(6yL),1.25mM dNTPs (6 μ L)，Phi29 (O. 5 μ L)，在37摄氏度下反应大约10分钟，再加入Nb. BbvCl (O. 5 μ L)和缓冲液2。在37摄氏度下放置一段时间后，加入FMB2和化学发光纳米粒子探针，反应30分钟。然后磁力分离，进行检测。5. 3四个输送管路中两个用来输送样品和载流-缓冲溶液，另两个输送CoCl2和H2O2溶液。用六通阀采样品进行注射，每次采样体积为100 μ L，所注射的样品随着载流在第一个交汇处混合，然后该混合物再在第三个交汇处与CoC12+H202混合溶液在流通池前段混合，发生化学反应产生化学发光，利用光电倍增管检测发光信号，从而根据化学发光信号的强度来确定所测溶液的浓度。6样品制备。从农产品市场里选取12个小麦样品，样品先经过粉碎机粉碎，然后再用试验筛筛分(Imm孔径)。然后取20g研细样品和5g NaCl倒入到IOOmL烧瓶里，再加入提取液(甲醇和水，体积比为8 2)。待完全混合后转入均质机中，高速搅拌2分钟。然后过滤，将所得溶液IOmL转移到50mL烧瓶里混匀。将所得溶液再进一步用玻璃纤维滤纸过滤直到所得滤液澄清。滤液用BB稀释后按上述检测方法进行分析检测。7结果与讨论7. I标准曲线的绘制与样品的测定。7. 2标准曲线的绘制。配制不同浓度的OTA标准溶液，测定其化学发光信号，发光信号与OTA浓度成良好的线性关系，线性范围为1.0X10_12mol L—1 I. OX 10_1(lmOl L_S检测限为 4. I X 10-13moI I/1 (如图 3)。7. 3在最佳实验条件下，对提取好的小麦样品上清液进行检测，测定结果如表I所
/Jn ο7. 4利用加标回收法对方法的的可行性进行了考察。将不同浓度的OTA加入小麦样品中。回收率的实验结果列于表I。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、代替、组合、简化，较为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.基于目标诱导链释放和限制性内切酶酶切循环的信号放大技术建立及其在赭曲霉素A超灵敏度检测中的应用，其特征包括以下步骤 (a)首先，将适体和适体互补序列固定在磁珠表面，在有目标物存在时，适体互补序列从磁珠表面脱落。经磁性分离后，将适体互补序列与模版DNA杂交，在DNA聚合酶的作用下，适体互补序列会沿着模版生长，形成完全互补双链DNA。
(b)将步骤(a)的生成的双链DNA用切割酶切割，得到一条短链DNA，同时得到新的生长位点，在聚合酶酶和切割酶的作用下，生长和切割会不断进行产生大量短链DNA。
(c)将(b)所得短链DNA用化学发光探针进行测定，从而实现对目标物的检测。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(a)中的适体为赭曲霉素A适体(DNAl)。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(a)中适体互补序列为赭曲霉素A适体互补序列(DNA2)，其与赭曲霉素A适体(DNAl)部分互补。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(a)中的模版DNA为聚合模版DNA3，其与赭曲霉素A适体互补序列部分互补。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(a)中的酶为DNA聚合酶Phi29。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(b)中的酶为限制性内切酶Nb.BbvCI0
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(c)中探针为DNA和ABEI标记的羧基化的二氧化硅化学发光纳米粒子。
全文摘要
本发明实施例公开了一种基于目标诱导链释放和限制性内切酶酶切循环的新型信号放大技术和化学发光检测赭曲霉素A的方法。将赭曲霉素A适体(DNA1)和赭曲霉素A适体互补序列(DNA2)固定于磁珠表面，在赭曲霉素A存在时，DNA1与赭曲霉素A作用，导致DNA2从磁珠表面脱落；经过磁性分离后，将DNA2与聚合模板DNA3杂交，形成部分互补DNA双链，在DNA聚合酶Phi29的作用下，DNA2沿着模板DNA3生长，从而形成完全互补的双链DNA；生成的双链DNA的一条链被限制性内切酶Nb.BbvCI切割，从而生成一条短链DNA；被切割的DNA形成一个新的生长点，并在聚合酶Phi29和限制性内切酶Nb.BbvC的作用下，继续进行生长和切割，由于生长和切割的不断进行，从而产生大量的短链DNA；再利用DNA和化学发光试剂标记的化学发光纳米粒子为探针对该短链DNA进行测定，实现赭曲霉素A的测定。
文档编号G01N21/76GK102830113SQ201210208159
公开日2012年12月19日 申请日期2012年6月14日 优先权日2012年6月14日
发明者混旭, 刘芳 申请人:青岛科技大学