专利名称：一种内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒及采用该试剂盒对待测样品中内脂素进行定性和定量的方法。
背景技术：
胖肥症是脂肪在人体组织过多堆积为特征的一种病状，已成为威胁公众健康的重要疾病之一。肥胖不仅并发引起肺压增加，关节和骨头超负荷，而且也最终导致危及生命的重要疾病发生，如心血管疾病，II型糖尿病和癌症等。多方面的研究已证实，内脂素是导致肥胖症发生的相关生物活性分子。内脂素(Visfatin，也称为PBEF和Nampt)是52 kDa大小的细胞浆内蛋白，由473个氨基酸组成，富集于内脏脂肪；最早是通过构建活性外周淋巴细胞的cDNA文库而分离 出来的，进一步研究发现，它是一种新型影响糖脂代谢的脂肪细胞因子，具有促进脂肪形成和类似胰岛素活性作用。在肥胖症的发展过程中，血浆内脂素水平明显增加。研究也发现，其mRNA在实验动物如小鼠的内脏脂肪中高度表达，在肝脏、骨骼肌、骨髓、淋巴组织及胎膜均有表达，同样，对动物脂代谢有调节的作用。不仅如此，内脂素也有其它生物学功能。它可以使烟酰胺磷酸核糖转移酶活性升高，正调节烟酰胺嘌呤二核苷酸的生物合成。也有研究报道，内脂素促进B细胞成熟和抑制中性粒细胞凋亡。最新研究发现，在动脉硬化巨噬细胞中测到内脂素的存在，内脂素能够激活单核细胞金属蛋白酶9，由此推测，内脂素也是和炎症发生有极大相关性的活性因子；此夕卜，内脂素可刺激TNF-α，白细胞介素I β (IL-Ιβ)及IL_6等炎症因子表达。Berndt等发现，血浆内脏脂肪素的浓度与体重指数(BMl)及体脂百分比(Percentbody fat)密切相关。研究显示，内脂素可以促进脂肪细胞的分化成熟，促进脂肪的生成和聚集，血浆中内脂素的浓度也明显升高，从而导致肥胖。也有研究表明，肥胖者在体重减轻后，其血浆内脂素呈现下降。Chen等的临床研究结果也证实，内脂素在II型糖尿病患者中有明显升高，且与腰臀比(Waist-to-Hip Ratio, WHR)直接相关。如上所述，人们对肥胖病的研究已积累了大量的研究结果，并取得了丰硕的成果，但仍没有一种快捷、准确，进行预测诊断与内脂素相关疾病的方法。传统的方法是，测定血压、血糖、血脂、胰岛素、瘦素以及尿蛋白等多种指标，以综合评估与内脂素相关疾病的发生和发展。也有通过全血粘度、血浆粘度、红细胞压积、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数等非直接相关指标来完成对胖肥症的评估；但是，这些方法的缺点是很难通过某一项的检测来作出判定，必须是多种方法的综合判定故此，检测项目繁多，检出率低，工作量大，费用高。近几年，也有利用基因芯片技术，来分析和评估个体基因的多态性，即基因型，预测肥胖症发生的遗传几率，不过，其准确性，实用性，经济性有待确认和验证。有鉴于此，研发出一种能直接定性并定量测定人体血清、血浆和其它生物液体中内脂素/内脏脂肪素的免疫诊断试剂盒，它具有快速准确、灵敏度高、高通量、价格低廉等优点，对与内脂素相关疾病的预防和治疗有极大的指导意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种能直接定性并定量测定人体血清、血浆和其它生物液体中内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒，它具有快速准确、灵敏度高、高通量、价格低廉等优点，对与内脂素相关疾病的预防和治疗有极大的指导意义。为了解决上述技术问题，本发明提供的一种内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒，包括(1)抗内脂素抗体和包含内脂素全蛋白局部或者整个肽段且能与所述抗内脂素抗体发生特异性抗原-抗体反应的内脂素多肽；(2)反应剂和检测剂，用于通过竞争抑制性酶联免疫检测待测样品中内脂素存在以否并确定其含量的物质。优选地，所述内脂素多肽为氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示的多肽
内脂素多肽NH2-CVTKSYSFDEIRKNAQLNIELEAAHH(SEQ ID NO: I)。优选地，该试剂盒还包括标准内脂素多肽，所述标准内脂素多肽是由内脂素多肽与KLH钥蓝蛋白螯合而成。更优地，所述标准内脂素多肽通过以下方式制备用生物素标记内脂素多肽，而后将生物素标记的内脂素多肽置于透析袋中，通过透析出去其中的小分子化合物，再于等摩尔量的KLH钥蓝蛋白在室温避光孵育，并立刻置于含O. 1%叠氮钠的I XPBS中透析过夜，而后定量其浓度，冻干保存或在使用时通过倍比稀释制备梯级浓度的标准内脂素多肽。优选地，所述内脂素多肽标记有生物素，所述反应剂还包括识别生物素标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素标记有辣根过氧化物酶。优选地,该试剂盒还包括包被有特异二抗的酶标板,所述特异二抗能与所述抗内脂素抗体发生特异性抗原-抗体反应。更优地，所述酶标板为96孔酶标板，所述特异二抗一般为针对免疫动物的种属特异二抗。另外，本发明还提供了一种内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测方法，包括如下步骤
步骤一、制备内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括(1)抗内脂素抗体和包含内脂素全蛋白局部或者整个肽段且能与所述抗内脂素抗体发生特异性抗原-抗体反应的内脂素多肽；(2)反应剂和检测剂，用于通过竞争抑制性酶联免疫检测待测样品中内脂素存在以否并确定其含量的物质。步骤二、通过竞争抑制性酶联免疫检测待测样品中内脂素存在以否并确定其含量。优选地，所述内脂素多肽为氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示的多肽
内脂素多肽NH2-CVTKSYSFDEIRKNAQLNIELEAAHH(SEQ ID NO: I)。优选地，该试剂盒还包括标准内脂素多肽，所述标准内脂素多肽是由内脂素多肽与KLH钥蓝蛋白螯合而成。更优地，所述标准内脂素多肽通过以下方式制备用生物素标记内脂素多肽，而后将生物素标记的内脂素多肽置于透析袋中，通过透析出去其中的小分子化合物，再于等摩尔量的KLH钥蓝蛋白在室温避光孵育，并立刻置于含O. 1%叠氮钠的I XPBS中透析过夜，而后定量其浓度，冻干保存或在使用时通过倍比稀释制备梯级浓度的标准内脂素多肽。
优选地，所述内脂素多肽标记有生物素，所述反应剂还包括识别生物素标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素标记有辣根过氧化物酶。该试剂盒还包括包被有特异二抗的酶标板，所述特异二抗能与所述抗内脂素抗体发生特异性抗原-抗体反应。更优地，所述酶标板为96孔酶标板，所述特异二抗一般为针对免疫动物的种属特异二抗。从原理上讲，在本发明的一个具体方案中，用种属特异二抗包被酶标微孔板，洗涤封闭后，加抗内脂素抗体，进行室温温育反应，再洗涤之后，加入生物素标记的内脂素多肽和正常的标准内脂素多肽(未用生物素标记)为标准结合反应组。同时，样品测定反应组也混合加入生物素标记的内脂素肽和待检测样品。这样，各反应组内混合物均与已结合在二抗上的高度特异性的抗内脂素抗体发生分子相互竞争结合反应，至竞争结合反应完成后，充分洗涤，只有通过抗原-抗体特异结合反应而完全结合在抗内脂素抗体的生物素标记内
脂素多肽与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素形成强结合复合物，经最后洗涤并紧接着加入酶显色底物，最终经酶催化反应。这样，反应显色的强度与二抗-内脂素抗体-生物素标记的内脂素多肽-辣根过氧化物酶链霉亲和素形成的复合物成正比，而与标准内脂素多肽及样品中内脂素量成反比。根据确定加入标准内脂素多肽的已知浓度，绘制出每次实验测定的标准曲线，由此，计算出样品中相应内脂素的实际量。相比于现有技术，本发明是充分结合抗原抗体反应的特异性和酶反应的快速及敏感性，建立和发展起的一种可以精确测定内脂素的酶免疫检测方法，通过采用能竞争结合抗内脂素抗体配体的内脂素多肽，结合竞争抑制性酶联免疫检测的优点，能直接定性并定量测定人体血清、血浆和其它生物液体中内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒，它具有快速准确、灵敏度高、高通量、价格低廉等优点，对与内脂素相关疾病的预防和治疗有极大的指导意义。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例I :待测样品中内脂素的检测试验
本实施例中采用的设置有I个96酶标板由美国瑞博奥生物科技有限公司生产，每个孔板内已包被种属特异二抗，而后依次进行如下各步骤的操作
I、加样
撕开酶标板上的保护膜，将100 μ I经样品稀释液A稀释过的样品加入孔板内，然后放在摇床上室温下摇动I至2小时，或者亦可在4° C下反应12-18小时。2、洗膜
洗涤液清洗从孔板内吸出样品，用300μ I I倍的洗涤液清洗，之后放在摇床上室温摇动5分钟，再重复此清洗步骤两次。也可以直接使用洗板机洗涤。3、配制生物素标记的内脂素多肽工作液
短暂离心生物素标记内脂素多肽离心管，将5μ I的生物素标记内脂素多肽加入到5ml的样品稀释液A中，上下吹打均匀。最终生物素标记内脂素多肽的浓度应为10ng/ml。4、配制不同浓度的标准品工作液短暂离心内脂素多肽标准品离心管，将10 μ I的内脂素多肽标准品加入990 μ I的内脂素多肽工作液，获得1000ng/ml的标准品并用内脂素多肽工作液按10倍稀释，分别获得100ng/ml, 10ng/ml, lng/ml, 100pg/ml, lOpg/ml, Opg/ml 的标准品工作液。5、配制样品工作液
样品介绍所用样品取自36至76岁治疗前肝癌患者血清，将样品血清用样品稀释液A稀释2倍(根据不同样品浓度可按不同倍数稀释)，同样将10 μ I的样品用内脂素多肽工作液按4倍稀释，保证内脂素多肽工作液的浓度为10ng/ml。
6、配制阳性对照工作液
短暂离心正对照离心管，加入103 μ I样品稀释液B和2μ I IOX生物素标记内脂素多肽。7、加入标准品，样品和阳性对照
加入ΙΟΟμ I不同梯度的标准品，样品和阳性对照于微孔板上，设两个重复。用保护膜盖住微孔板放在摇床上室温条件下摇动2. 5小时，亦可在4° C下反应12-18小时。而后从微孔板内吸出反应液，重复步骤2的洗膜步骤。8、加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素
向每个方格加入100 μ I稀释过的辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白链菌素，然后放在摇床上室温条件下摇动I至2小时，亦可在4° C下反应12-18小时。而后从方格内吸出辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，重复步骤2的洗膜步骤。其中，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素商购自美国宝德公司公司(产品号554066)，使用前，需要用封闭液进行20，000倍稀释。另外，需要说的是，在本实施的步骤I至步骤4中，用到如下溶液，其成分可配制方法如下
样品稀释液(20XPBS):氯化钾16g，氯化钠640g，磷酸二氢钾16g，磷酸氢二钠92g,溶解于2. 6L纯化水后，再加纯化水至4升。样品稀释液A (20 XPBS):氯化钾16g，氯化钠640g，磷酸二氢钾16g，磷酸氢二钠92g，溶解于2. 6L纯化水后，加入I. 8%叠氮钠，再用纯化水定容至4升。样品稀释液B (5 XPBS):氯化钾4g，氯化钠160g，磷酸二氢钾4g，磷酸氢二钠23g,溶解于2. 6L纯化水后，再用纯化水定容至4升。封闭液的配制方法如下先将20XPBS稀释成I XPBS (20XPBS 200ml，纯化水3800ml )，然后配制10%牛血清白蛋白(牛血清白蛋白400g，I X PBS加至4升)，最后配制封闭液(10%牛血清白蛋白4升，酪蛋白4升，混匀)。20X洗涤液(20XTBS)配分如下2M三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7. 5) 800ml,5M氯化钠4800ml (氯化钠1461g，纯化水3. 3升，溶解后纯化水加至5升)，混匀后，纯化水加至8升，吐温160ml。使用时，将20X洗涤液倍比稀释即可。标准内脂素多肽的制备通过肽段NH2-CVTKSYSFDEIRKNAQLNIELEAAHH与KLH钥蓝蛋白螯合，此26肽段定位于内脂素的第467至491个氨基酸，由吉尔生化(上海)有限公司合成。标准内脂素多肽的制备方法按照Thermo Scientific公司生产的生物素标记内脂素多肽。将内脂素多肽置于透析袋中，于IX PBS中透析过夜去除小分子化合物如Tris，甘氨酸。EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo Cat#21435)与等量内脂素多肽在室温避光孵育半个小时，立即置于含O. 1%叠氮钠的IXPBS中透析过夜，次日以BCA ProteinAssay Kit (Pierce Cat#23225)测出生物素标记内脂素多肽浓度，分装冻干。抗内脂素抗体的制备方法将乳化好的内脂素多肽20(^g免疫新西兰兔，隔10至14天再用相同剂量进行第二次免疫，再隔7至10天用减半剂量免疫，从新西兰兔耳缘静脉采少量血清进行ELISA实验检测抗体效价，如效价达到I :100000以上则进行心脏采血，米用 GE 亲和层析柱 HiTrap Protein A HP (Cat#17-0403-01)与 HiTrap Protein GHP(Cat#17-0404-01)串联纯化血清制成冻干干粉抗体。当然，在本发明的其他实施例用也会根据需要采用本领域内其他常用技术制备抗内脂素抗体。种属特异二抗Aff iniPure Goat anti-rabbit IgG (H+L) (Catiilll-OO5-OO3)购自Jackson Tmmuno 公司。9、检测
加入100 μ I的TMB One-Step底物反应液于室温下孵育O. 5小时，再加入50 μ I的终止液。于酶标仪450nm滤光片进行读数。将数值代入生物分析软件SigmaPlot，以X轴为标准品浓度，Y轴为吸光值求出样品血清中内脂素的浓度。酶标板0D450检测结果如表一所不
表一
权利要求
1.一种内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒，其特征在于包括(1)抗内脂素抗体和包含内脂素全蛋白局部或者整个肽段且能与所述抗内脂素抗体发生特异性抗原-抗体反应的内脂素多肽；(2)反应剂和检测剂，用于通过竞争抑制性酶联免疫检测待测样品中内脂素存在以否并确定其含量的物质。
2.根据权利要求I所述的内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述内脂素多肽为氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示的多肽。
3.根据权利要求2所述的内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括标准内脂素多肽，所述标准内脂素多肽是由内脂素多肽与KLH钥蓝蛋白螯合。
4.根据权利要求3所述的内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述标准内脂素多肽通过以下方式制备用生物素标记内脂素多肽，而后将生物素标记的内脂素多肽置于透析袋中，通过透析出去其中的小分子化合物，再于等摩尔量的KLH钥蓝蛋白在室温避光孵育，并立刻置于含O. 1%叠氮钠的IXPBS中透析过夜，而后定量其浓度，冻干保存或在使用时通过倍比稀释制备梯级浓度的标准内脂素多肽。
5.根据权利要求I所述的内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述内脂素多肽标记有生物素，所述反应剂还包括识别生物素标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素标记有辣根过氧化物酶。
6.根据权利要求3所述的内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括包被有特异二抗的酶标板，所述特异二抗能与所述抗内脂素抗体发生特异性抗原-抗体反应。
7.一种内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤 步骤一、制备内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括(1)抗内脂素抗体和包含内脂素全蛋白局部或者整个肽段且能与所述抗内脂素抗体发生特异性抗原-抗体反应的内脂素多肽；(2)反应剂和检测剂，用于通过竞争抑制性酶联免疫检测待测样品中内脂素存在以否并确定其含量的物质； 步骤二、通过竞争抑制性酶联免疫检测待测样品中内脂素存在以否并确定其含量。
8.根据权利要求7所述的内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测方法，其特征在于所述内脂素多肽为氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示的多肽。
9.根据权利要求7所述的内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测方法，其特征在于，该试剂盒还包括标准内脂素多肽，所述标准内脂素多肽是由内脂素多肽与KLH钥蓝蛋白螯合而成，包括如下步骤用生物素标记内脂素多肽，而后将生物素标记的内脂素多肽置于透析袋中，通过透析出去其中的小分子化合物，再于等摩尔量的KLH钥蓝蛋白在室温避光孵育，并立刻置于含O. 1%叠氮钠的IXPBS中透析过夜，而后定量其浓度，冻干保存或在使用时通过倍比稀释制备梯级浓度的标准内脂素多肽。
10.根据权利要求I所述的内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括包被有特异二抗的酶标板，所述特异二抗能与所述抗内脂素抗体发生特异性抗原-抗体反应；所述内脂素多肽标记有生物素，所述反应剂还包括识别生物素标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素标记有辣根过氧化物酶。
全文摘要
本发明公开了一种内脂素的竞争抑制性酶联免疫检测试剂盒，包括(1)抗内脂素抗体和包含内脂素全蛋白局部或者整个肽段且能与所述抗内脂素抗体发生特异性抗原-抗体反应的内脂素多肽；(2)反应剂和检测剂，用于通过竞争抑制性酶联免疫检测待测样品中内脂素存在以否并确定其含量的物质，所述内脂素多肽为氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的多肽。本发明还公开了采用该试剂盒对待测样品中内脂素进行定性和定量的方法。本发明的方案能直接定性并定量测定人体血清、血浆和其它生物液体中内脂素，并具有快速准确、灵敏度高、高通量、价格低廉等优点，对与内脂素相关疾病的预防和治疗有极大的指导意义。
文档编号G01N33/68GK102721818SQ20121021580
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者张英, 蒋卫东, 黄若磐 申请人:广州瑞博奥生物科技有限公司