专利名称：高效液相色谱法测定组合物中巯基化合物含量的方法
技术领域：
本发明涉及组合物中巯基化合物含量的检测方法，以及甲酸的新用途，更具体的，涉及甲酸作为稳定剂，在使用高效液相色谱分析法测定组合物巯基化合物的含量及稳定其有关物质的应用。
背景技术：
巯基化合物中以二巯基类的有机化合物的实际应用较多见，它重要的代表是二巯丁二酸(DMSA)及其钠盐(Na-DMSA)、二巯丙磺酸及其钠盐(Na-DMPS)等，其主要的应用之一是作为金属、类金属解毒药，用于治疗锑、汞、砷、铅、铜等急、慢性中毒及肝豆状核变性(铜代谢障碍)。随着现代工业、交通、电子产业的迅速发展以及对重金属的大量开采和应用，自然界中空气、土壤、水源及食物中的生物链受到重金属的污染日愈严重，人们对重金属，尤其 是铅的接触和吸收在逐渐增加。目前我国儿童铅中毒的发生率为30% 50%。铅中毒普遍性和严重性，目前已成为严重危害我国儿童健康的重大隐患之一，严重影响到儿童的发育和健康成长。目前，临床上最有代表性的重金属解毒剂就是二巯丙磺酸钠(Na-DMPS)、二巯丁二酸钠(Na-DMS)、二巯丙醇(BAL)、二巯丁二酸(DMSA)等。其中二巯丁二酸因其口服有效，疗效确切，毒性低，使用方便，已被国内外作为首选的重金属解毒剂，用于解救铅、汞、砷、镍、铜等金属中毒。国内临床上解毒剂使用较多的剂型是注射液，例如二巯丙醇注射液、二巯丁二钠注射液，而口服的目前只有二巯丁二酸成人胶囊，品种极少，尚未见适合儿童口服的专用剂型，所以开发此类药品具有现实而迫切的意义。与此同时，目前该类药品在对应的质量控制标准领域也缺乏简便易行的方法，这可能与产品本身因含有巯基而导致不稳定等因素有关。对临床口服应用最广泛的二巯丁二酸而言，现行除《中国药典》2000版和2010版有提出质量标准外，各国药典包括USP (31版)、BP (2008年)以及JP (15改正版)均未收载该品种，而且《中国药典》上收载的质控标准都过于简单，含量测定采用沉淀滴定法，因其降解的有关物质很不稳定而使质控标准的制定难度加大。因为二巯类化合物分子结构中含有活泼的巯基官能团，尤其在含水的溶液中不稳定，其中一种不稳定现象之一包括巯基官能团分子内或分子间互相缩合形成双硫键，例如申请人经质谱分析确定，二巯丁二酸在水中部分降解成双硫化物(R-S-S-R)这种有关物质。而在采用反相高效液相色谱法分析该类化合物的含量和有关物质时，样品供试液和流动相中必然含有水，这样就无法避开产品的不稳定和有关物质增多的问题。显然，在采用高效液相色谱分析过程中，如果因为流动相含水的问题以及样品分析的前处理、测试过程中导致了二巯化合物含量的降低和有关物质的增大，那么很容易给二巯类解毒药品例如胶囊、片剂等固体制剂产品本身固有的稳定性造成误会，因为固体产品的含量偏低或有关物质的增大都可能是分析测试过程中造成的，进而无法体现产品本来固有的准确含量，造成测试数据的偏差。以二巯丁二酸为例，现有的分析方法包括沉淀滴定法、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱荧光法(HPLC-FR)、高效液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等。其中的沉淀滴定法，是中国药典采用的方法，不但误差大，对降解的杂质的测定也无能为力。荧光衍生化法是基于HPLC的方法，但是对样品的荧光化处理程序繁琐，还需要配备专门的荧光检测器。液质联用法操作成本高，也不便捷，不能普适于一般性药厂对产品的质控要求。一些文献中也尽管采用单独的HPLC法，但是经申请人试验发现，对样品测试的稳定性难以达到满意的水平，在含水的流动相中巯基化合物容易部分降解，特别是随着测定时间的延长，巯基化合物不断的降解，容易导致测得的含量比实际的含量偏低
发明内容
本发明的目的是公开一种高效液相色谱法测定组合物中巯基化合物含量的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。本发明还涉及甲酸的新用途，在使用高效液相色谱分析法测定组合物中巯基化合物的含量时作为稳定剂的应用。本发明所述的高效液相色谱法测定组合物中巯基化合物含量的方法，其特征在于，流动相为含有甲酸的水相与有机相的混合物，色谱柱为反相色谱柱，检测器为紫外检测器；所述有机相为甲醇或乙腈；所述水相是磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、离子对试液或纯水；有机相水相甲酸=50 500 949 460 I 40，体积比；以样品供试液的体积计，样品供试液中，甲酸体积百分比为O. 5 10. 0% ；样品供试液的存储环境优选为O 8°C的低温存储；所述磷酸盐缓冲液为I 100mmol/L的磷酸盐溶液、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，磷酸二氢铵中的一种或几种；所述醋酸盐缓冲液为I lOOmmol/L的醋酸钠、醋酸铵、醋酸钾的一种或几种；所述离子对试剂溶液为I lOOmmol/L的离子对试剂四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵、四甲基溴化铵或四甲基硫酸氢铵；所述的巯基化合物是所有含两个或多个巯基官能团的有机化合物，优选为2，3- 二巯基丁二酸及其钠盐、2，3- 二巯基丙烷磺酸及其钠盐、2，3- 二巯基-I-丙醇或1，4- 二巯基-2，3- 丁二醇。进一步优选为2，3- 二巯基丁二酸；所述反相色谱柱为C18或C8填料的反相色谱柱,检测波长是200 285nm，流速是0. 5ml/min I. 5ml/min ;流动相的洗脱方式为等度洗脱或梯度洗脱,优选为等度洗脱；采用上述的色谱柱、流动相和检测器进行检测的过程，为常规的，如《天麻饮片中天麻素的含量测定方法的研究》(徐金章、杨水新，《中成药》2011,23(11)，P795-797)等文献报导的过程；优选的，包括如下步骤(I)色谱条件
色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶(250mmX4. 6mm, 5 μ m)；流动相将甲醇、水和甲酸按以下体积比混合甲醇水甲酸= 200 400 796 588 4 12 ;洗脱方式单通道等度洗脱；流速0.8ml/min I. 2ml/min ；检测波长210 254nm ；柱温25 35°C ;进样量:10 50 μ I ； (2)稀释溶剂的配制向所述的流动相中添加甲酸，按体积计，甲酸添加量为流动相的O. 5 2. 0%，为稀释用的溶液A ；(3)供试品溶液和对照品溶液的配制取含巯基化合物的样品，用甲醇溶解，并用溶液A稀释，配制成每ImL中含巯基化合物O. 05 3. Omg的供试品溶液；另取对应的含巯基化合物对照品，同法配制成每ImL中含巯基化合物O. 05 3. Omg的对照品溶液，并且均放置于4 8°C的低温环境中待测；(5)取供试品溶液和对照品溶液各10 50 μ I注入液相色谱仪，进行检测分析；检测分析的过程，是公知的，本领域的技术人员，可以根据《HPLC测定二巯丁二酸的有关物质》(乐健等，《中国药学杂质》2011，46(13) ,Ρ1030-1033)等文献报导的方法，通过标准曲线进行分析检测，本发明不再赘述；本发明所述的高效液相色谱法是指高效液相色谱法的单独使用，不包括与质谱法的联合使用，高效液相色谱-质谱法的联合使用方法不在本专利约束的范围内。本发明具有以下有益的效果与仅仅包含有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、离子对试液或单独的纯水作流动相相比较而言，这些流动相中如果加入了适量的甲酸，可以明显解决或减缓巯基化合物在供试液和流动相中的极端不稳定现象而造成的含量测定误差，对二巯丁二酸而言，还可避免磷酸盐缓冲液的色谱图峰形造成分叉的影响，起到优化色谱图峰形的好处。而且，同时在样品供试液中也加入适量的甲酸，结合流动相中加入的甲酸，那么，在整个样品前处理和色谱分析测试过程，可以很好的保证巯基化合物的含量测定的稳定性和可重复性，为起草含巯基官能团化合物的质控标准提供了可靠的保证。同时为巯基化合物降解出的有关物质的精密测定提供了重要的参考价值。
图I为实施例I的检测结果。图2为对比实施例I的检测结果。图3为实施例2的检测结果之一。图4为实施例2的检测结果之二。
具体实施例方式实施例I二巯丁二酸的有关物质液相分析方法仪器和色谱条件
色谱仪Angilent 1100型高效液相色谱仪；色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填料，Angilent SB C184. 6 X 250mm, 5 μ m ；检测波长234nm，流速I. Oml/min ;洗脱方式为单通道等度洗脱；柱温35°C。流动相和溶液A :流动相为甲醇、水和甲酸的混合物，体积比为，甲醇水甲酸=240 752 8 ；溶液A :采用流动相。实施步骤测定方法
取二巯丁二酸颗粒剂I. O克，约相当于二巯丁二酸66. 7mg,置于25ml量瓶中，加甲醇适量超声约5min后，甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过后取续滤液作为母液，量取母液2ml，置于IOml量瓶中，加溶液A稀释至刻度，摇匀，制成每ImL中约含二巯丁二酸530 μ g的溶液，作为供试品溶液；另量取该供试品溶液适量，加流动相制成每Iml中约含二巯丁二酸10. 6 μ g的溶液，作为对照品溶液。取对照品溶液50μ I注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20% ;再准确量取上述两种溶液各50 μ I注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍。灵敏度试验方法逐级稀释供试品溶液浓度，按信噪比3 1测定。实验结果本方法具备较好的灵敏度，二巯丁二酸的最低检出量为55ng。专属性试验碱破坏取本品适量，置25ml量瓶中，加入O. lmol/L氢氧化钠溶液适量，漩涡振荡混匀，并置室温下过夜24小时后，用甲醇定容到刻度后，照测定方法项下的方法及色谱条件进行测定，并记录HPLC色谱图。酸破坏取本品适量，置25ml量瓶中，加入4mol/L盐酸溶液适量，漩涡振荡混匀，并置室温下过夜24小时后，用甲醇定容到刻度后，照测定方法项下的方法及色谱条件进行测定，并记录HPLC色谱图。氧化破坏取本品适量，置25ml量瓶中，加入5%过氧化氢溶液适量，漩涡振荡混匀片刻后，加甲醇定容到刻度后，照测定方法项下的方法及色谱条件进行测定。高温破坏取本品适量，置25ml量瓶中，加入去离子水约2ml，漩涡振荡混合均匀，并置烘箱100°c的温度下15min，取出，放冷，加甲醇定容到刻度后，照测定方法项下的方法及色谱条件进行测定，并记录HPLC色谱图。结果表明本品经强氧化剂、高温、酸和碱破坏后，各降解产物之间和降解产物与主药之间，在有关物质项下的HPLC色谱条件下均能被检出，且得到较好的分离。另外，二巯丁二酸的色谱峰形对称性极好，出峰时间在4. 879min,其部分降解的有关物质(双硫物R-S-S-R)的出峰时间在8. 639min,与二巯丁二酸之间得到良好的分离，且能被有效检测出。按面积归一化看，有关物质为O. 13%，没有出现二巯丁二酸明显的向该双硫物部分降解的迹象，甲酸对促进二巯丁二酸稳定性起到重要作用。具体见附图I。对比实施例I
仪器和色谱条件基本同实施例1，除了流动相和溶液A不同外。流动相甲醇-O. 04mol/l磷酸二氢钠水溶液(加I. 6g/L硫酸氢四丁基铵，并以磷酸调pH至3. 2) =900-100，体积比。溶液A :采用流动相。实施步骤取实施例I中由甲醇稀释制成的母液，加本流动相制成每Iml中约含二巯丁二酸530 μ g的溶液作为供试品溶液,另量取该供试品溶液适量,加流动相制成每Iml中约含二巯丁二酸10. 6 μ g的溶液，作为对照品溶液。同实施例I的方式进行分析。结果显示，在没有向流动相和溶液A中添加促稳定剂甲酸的情况下，二巯丁二酸的色谱峰的尾端有明显的分叉，与实施例I比较，含量略低，而有关物质偏高达0.9%。具体见附图2。实施例2 二巯丁二酸的液相分析的含量稳定性试验仪器和色谱条件Angilent 1100型高效液相色谱仪及Angilent LC ChemStation色谱工作站；色谱柱Angilent C18 4. 6X250mm,5ym ;流速为I. Oml/min,单泵单通道走流动相；检测波长为234nm ;柱温35°C ;进样量为50 μ I。流动相一(供含量测定和各项方法学验证)为甲醇、水和甲酸的混合物，体积比，甲醇水甲酸=240 753 7 ；流动相二(供稳定性试验项下的参照对比)体积比，甲醇25mmol/l醋酸钠缓冲液(含lOmmol/1的四丁基硫酸氢铵，以乙酸调pH3. 5) = 350 650 ；含量测定的方法取二巯丁二酸颗粒剂I. O克(约相当于二巯丁二酸66. 7mg)，置于25ml量瓶中，力口甲醇适量，超声5min后，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，量取续滤液1ml，置于25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成每Iml中约含二巯丁二酸106. 7μ g的溶液。精密量取50 μ 1，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取二巯丁二酸对照品适量，用甲醇适量溶解，并用流动相定量稀释制成每Iml中约含二巯丁二酸106. 7μ g的溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算。标准曲线取二巯丁二酸对照品适量，加甲醇配成浓度2. 88mg/ml的对照品贮备液。精密吸取上述贮备液适量，置25ml量瓶中，用流动相配成系列浓度的标准溶液，精密量取50 μ I注入液相色谱仪。照含量测定项下的方法和色谱条件测定，测定结果见表I。表I标准曲线测定结果
权利要求
1.甲酸在使用高效液相色谱分析法测定组合物中巯基化合物的含量时作为稳定剂的应用。
2.高效液相色谱法测定组合物中巯基化合物含量的方法，其特征在于，流动相为含有甲酸的水相与有机相的混合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，色谱柱为反相色谱柱，检测器为紫外检测器。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机相为甲醇或こ腈；所述水相是磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、离子对试液或纯水。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，有机相水相甲酸=50 500 949 460 I 40，体积比。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，以样品供试液的体积计，样品供试液中，甲酸体积百分比为0. 5 10. 0%。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液为I lOOmmol/L的磷酸盐溶液、磷酸ニ氢钠、磷酸氢ニ钠、磷酸ニ氢钾、磷酸氢ニ钾，磷酸ニ氢铵中的一种或几种； 所述醋酸盐缓冲液为I lOOmmol/L的醋酸钠、醋酸铵、醋酸钾的ー种或几种； 所述离子对试剂溶液为I lOOmmol/L的离子对试剂四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵、四甲基溴化铵或四甲基硫酸氢铵。
8.根据权利要求2 7任一项所述的方法，其特征在于，所述的巯基化合物是所有含两个或多个巯基官能团的有机化合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的巯基化合物为2，3-ニ巯基丁ニ酸及其钠盐、2，3- ニ疏基丙烧横酸及其钠盐、2，3- ニ疏基-I-丙醇或1，4- ニ疏基-2，3- 丁ニ醇。进ー步优选为2，3-ニ巯基丁ニ酸。
10.高效液相色谱法测定组合物中巯基化合物含量的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)色谱条件 色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶(250mmX4. 6mm, 5 u m)； 流动相将甲醇、水和甲酸按以下体积比混合甲醇水甲酸=200 400 796 -588 4 12 ; 洗脱方式单通道等度洗脱；流速0. 8ml/min I. 2ml/min ； 检测波长:210 254nm ； 柱温25 35°C ； 进样量10 50ii I ; (2)稀释溶剂的配制向所述的流动相中添加甲酸，按体积计，甲酸添加量为流动相的-0.5 2. 0%，为稀释用的溶液A ； (3)供试品溶液和对照品溶液的配制取含巯基化合物的样品，用甲醇溶解，并用溶液A稀释,配制成姆ImL中含巯基化合物0. 05 3. Omg的供试品溶液； 另取对应的含巯基化合物对照品，同法配制成姆ImL中含巯基化合物0. 05 3. Omg的对照品溶液， 并且均放置于4 8°C的低温环境中待测；(5)取供试品溶液和对照品溶液各10 50iU注入液相色谱仪，进行检测分析。
全文摘要
本发明公开了一种高效液相色谱法测定组合物中巯基化合物含量的方法，公开了甲酸在使用高效液相色谱分析法测定组合物中巯基化合物的含量时作为稳定剂的应用，流动相为含有甲酸的水相与有机相的混合物。本发明与仅仅包含有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、离子对试液或单独的纯水作流动相相比较而言，可以明显解决或减缓巯基化合物在供试液和流动相中因极端不稳定现象而造成的含量测定误差，对有些巯基化合物还可避免磷酸盐缓冲液的色谱图峰形造成分叉的影响，起到优化色谱图峰形的好处。可以很好的保证巯基化合物的含量测定的稳定性和可重复性。
文档编号G01N30/06GK102759586SQ20121022592
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月2日 优先权日2012年7月2日
发明者倪睿, 史家骏, 陈志明, 马晋隆 申请人:上海现代药物制剂工程研究中心有限公司