专利名称：一种食品中微生物生长曲线自动测绘的方法
技术领域：
本发明涉及一种食品中微生物生长曲线自动测绘的方法。
背景技术：
世界贸易的全球化同时也带来了食品安全风险。近年来，世界范围内屡屡发生食品安全事件，如美国爆发感染大肠的“菠菜中毒事件”，感染沙门菌的花生酱“沙门事件”，日本上万人葡萄球菌肠毒素导致的雪印牛奶中毒、英国的疯牛病、法国的李斯特氏菌感染、泰国的禽流感等等。全球每年发生食源性疾病高达数十亿例，发达国家发生食源性疾病的概率也相当高。每年由数十亿例食源性疾病而导致的医疗费增加、不安全食品的召回、以及产品的销毁带来的经济损失不可估量！更有甚者，由于抗生素的滥用，全球频频出现食源性致病菌的耐药菌株，其迅速增加与扩散，对相关感染的治疗与救治带来极大挑战。食品中微生物污染，尤其是耐药微生物污染，是导致食源性疾病发生和发展的主要原因。实时快速准确地监测食品中的微生物特征，并获得其菌落总数及其耐药性，对预防和控制食源性微·生物感染，保证人类健康、防止经济损失具有重要意义。目前，食源性致病菌的检测方法主要有培养鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、多聚酶链式反应(PCR)、电阻抗技术以及全自动微生物分析系统等。培养鉴定法是将经过前处理的样本接种于营养肉汤，然后肉眼观察细菌的菌落生长，进行阴阳判定。对于阳性样本，再通过药敏实验鉴定。该方法大多要耗费6名天时间，而且程序复杂，所用试剂繁多，费时费力，等结果出来，疫情可能已经发生；ELISA是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来的一种检测技术，它既可测抗原，也可测抗体。该方法灵敏度和特异性较强，但所需试剂昂贵，且需多次洗涤及培养过程；PCR技术采用体外酶促反应合成特异性DNA片段，再通过扩增产物来识别细菌。PCR具有灵敏度高、特异性强、快速等特点，但假阳性和假阴性率过高是影响其应用的关键问题。电阻抗技术原理是细菌在培养基内生长繁殖的过程中，将会使培养基的阻抗发生变化，通过检测培养基的电阻抗变化情况，判定细菌在培养基中的生长繁殖特性，即可检测出相应的细菌。该法具有检测速度快、灵敏度高等优点，但由于电路的稳定性问题，导致假阳性率过高；法国生物梅里埃集团公司出品的Vitek-AMS自动微生物检测系统属当今世界上最为先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。它无须经过微生物分离培养和纯化过程，就能直接从样品检出特殊的微生物种类和菌群来。但该系统和配套试剂价格昂贵且需依赖进口，严重制约了我国食源性致病菌研究水平的提高。因此，灵敏、快速、准确而且价格便宜的食源性致病菌实时监测设备的研究迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是要克服现有方法不足之处而提供一种自动、快速、准确和可视化的食品中微生物生长曲线实时测绘方法。为了实现上述技术目的，本发明的技术方案是，一种食品中微生物生长曲线自动测绘的方法，包括以下步骤步骤一取25g食品样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，以8000r/min的速度进行均质2min,制成I :10的样品勻液；步骤二 设立微生物生长曲线自动测绘装置，包括传感系统、读数系统和显示系统三部分，其中传感系统包括带有密封盖的检测管、控温装置、二电极、压电体声波传感器和自激励电路，所述的检测管设于控温装置内，所述的二电极由底部插入检测管内，其中一电极连接自激励电路的输入端，另一电极连接压电体声波传感器的输入端，压电体声波传感器的输出端连接至自激励电路，所述的读数系统包括分频计、驱动电路和单片机，所述的分频计的输入端连接至自激励电路，自激励电路的输出端连接至驱动电路，所述的单片机分别连接至自激励电路和驱动电路，所述的显示系统包括显示器，所述的显示器通过MAX232串口连接至单片机；步骤三取9mL培养基和ImL由步骤一所得到的样品匀液加入至微生物生长曲线自动测绘装置的检测管中，拧紧密封盖；
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步骤四将检测管插入控温装置中，调节控温装置温度为(37±0. 2) V ；步骤五启动微生物生长曲线自动测绘装置；步骤六传感系统中压电体声波传感器对与其串接对象检测管中培养体系的电参数变化有灵敏的频率响应，读数系统将检测到的培养体系的频率信号转换成计算机可识别的数字信号发送给单片机，单片机以频移-时间方式通过显示器实时输出培养体系响应曲线，当检测管中有微生物生长时，微生物可将培养基中电惰性的大分子物质分解为电活性的小分子物质，当微生物浓度达到106cfu/mL左右时，检测管中培养体系的电参数发生较显著变化，导致压电体声波传感器的频移发生显著改变，获得食品中微生物实时生长曲线，实时数据自动以TXT格式保存。所述的一种食品中微生物生长曲线自动测绘的方法，培养基为液体培养基，所述的液体培养基为广谱液体培养基，所述的广谱液体培养基成分为牛肉粉3g，酵母浸膏
I.5g,葡萄糖IOg,生长因子，蒸懼水IOOOmL, pH值为7. 0 7. 2。所述的一种食品中微生物生长曲线自动测绘的方法，所述的生长因子包括L-脯氨酸20mg，L-丝氨酸20mg，L-丙氨酸40mg，L-异亮氨酸70mg，L-亮氨酸98mg，L-门冬氨酸50mg, L-酪氨酸5mg, L-谷氨酸15mg, L-苯丙氨酸IOOmg, L-精氨酸盐酸盐IOOmg, L-赖氨酸盐酸盐80mg, L-纟颜氨酸70mg, L-苏氨酸50mg, L-组氨酸盐酸盐50mg, L-色氨酸15mg,L-甲硫氨酸45mg, L-胱氨酸2mg,甘氨酸150mg。所述的一种食品中微生物生长曲线自动测绘的方法，电极为一对经钝化处理的不锈钢棒直接封入聚碳酸酯中，并将端面磨平，得到位于同一平面的一对圆形平面电极，电极的电极常数为0. 58cnTl. OOcm,电极常数=平面电极面积/圆形平面电极之间的距离，距离指两圆心之间的距离。所述的一种食品中微生物生长曲线自动测绘的方法，控温装置是使用电阻丝绕在一个用紫铜材料做成的套筒上。所述的一种食品中微生物生长曲线实时自动测绘的方法，平面电极与压电体声波传感器通过导线串联。本发明对比已有技术来说，从食品中微生物生长规律出发，提出了用测绘微生物生长曲线来进行微生物分析的新方法，是对传统分析方法的技术创新；通过实验研究发现压电体声波传感器可将微生物生长信息转化为可测的频率信息，从而为设计快速、高效的新型绘制装置提供了设计原理。在新的检测方法和设计原理的指导下设计制作出食品中微生物生长曲线自动测绘装置。本发明的技术效果在于I、压电体声波传感器的使用避免了双电层电容的影响，提高了电信号的稳定性，增强了信噪比；2、压电体声波传感器与平面电极结合后显著提高了检测的精确度。3、传感系统、读数系统以及显示系统的组合可实现装置的自动化处理，能实时、快速地获取食品中微生物的频移-时间测绘曲线，为食品中微生物的深入研究提供理论依据。
·图I本发明装置的结构示意图；其中I -传感系统、II -读数系统、III -显示系统I为检测装置(1-1为密封盖,1-2为检测管，1-3为微生物，1-4为培养基,1-5为控温装置，1-6为电极)，2为压电体声波传感器，3为自激励电路，4为分频计，5为驱动电路，6为单片机，7为MAX232串口 ；图2为本装置的工作流程图；图3为食品中微生物生长过程电导(A)和电容(B)的变化率；图4为食品中微生物实时测绘生长曲线(A)，空白曲线(B)和平板计数法所得生长曲线(C)；图5为鲜奶中不同初始浓度(cfu/mL)微生物生长曲线A-1. I X IO6, B-7. 9 X IO4, C—9. 8 X IO3, D-1. 3 X IO3, E—97, F—12图6为米粉中微生物实时生长曲线A-米粉经过121° C，IOmin处理；B，C-米粉经过80° C，2min处理；D，E，F-未经处理的米粉。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。本发明的基本思想是结合压电体声波传感器、平面电极及外围数据处理装置实现食品中微生物生长曲线的实时测绘，为食品中微生物的深入研究奠定理论基础。食品中微生物生长曲线实时测绘装置见图1，包括传感系统、读数系统和显示系统三部分，其中传感系统由压电体声波传感器、检测探头、检测管、控温装置及自激励电路构成；读数系统由分频计、驱动电路、单片机及MAX232数据接口构成；显示器由显示界面及配套软件构成；其中检测探头为自制的平面电极，材料为钝化处理的316不锈钢棒嵌入聚碳酸酯中，磨平，抛光；压电体声波传感器(9MHz AT-切型，两面镀银)购至北京707厂，平面电极与压电体声波传感器通过导线串联。压电体声波传感器对检测管中微生物的生长有灵敏的频率响应，为消除外界因素影响，通过差分法统一用频移值表示(A F=F0-Fi,其中Ftl为起始频率,Fi为i时测得的频率值)，获得频移响应信号。而信号的采集由计算机控制，首先由计算机通过MAX232数据接口发指令给单片机，采集检测管中的信号，计算机控制采集信号通道，采集的信号输入频率计，将其分为段信号和位信号传给单片机，单片机通过数据接口传给显示系统，以频移-时间形式自动绘制出实时的响应曲线。所有的频移和时间数据，以TXT格式自动保存。工作条件环境温度10° C 30° C ;相对湿度< 85% ;大气压力86. OkPa 106. OkPa ；使用电源AV (220 ± 22) V，50Hz ± IHz。由于微生物在代谢过程中会分解电惰性的葡萄糖、氨基酸等大分子物质为电活性的小分子，那么培养基体系的性质，如电导率和介电常数会随时间发生变化，这种变化恰恰反应了微生物的生长信息。图3给出了 4192A LF阻抗分析仪测定的IO5CfuAiL的大肠杆 菌在培养基中生长过程的电参数变化情况，其纵坐标以电参数的变化相对于初始电参数值的变化率来表示，横坐标为微生物的生长时间，曲线A和B分别表示食品中微生物生长过程的电导和电容的变化率。由图可知,微生物在生长过程中，电导增加大约16%，而电容变化为10%左右。结果表明，微生物菌落数量的测定问题可以转化为电学测量的问题。电磁振荡理论表明，LC电路的频率f与自感系数L、电容C的关系是
/ = ^Olc0)由公式可知，线圈自感系数、电容变化可改变振荡频率，用相应的测频电路可以记录这种频率的变化。由于微生物在生长过程中液体培养体系电参数会发生变化，进而可以解决食品中微生物生长信息转换为可测信息的技术问题。实际电路中使用的振荡器是压电体声波传感器，其工作原理与LC振荡电路的原理基本相同，但频稳性更好，可以减少检测过程中的噪音，所以，在检测系统中采用压电体声波传感器。实施例I利用食品中微生物生长曲线自动测绘装置及如图2所示方法对IO5CfuAiL的大肠杆菌的生长过程曲线(参见图4曲线A，图4曲线B为空白参比)进行实时测绘并与平板计数法所获得的生长曲线(参见图4曲线C)进行对照。从图4可知，在ab段，大肠杆菌处于迟缓期，在一段时间里并不马上分裂，大肠杆菌的数量维持恒定，或增加很少，培养基的性质变化也不明显，所以频移没有明显变化；在be阶段，为大肠杆菌指数生长期，大肠杆菌生理代谢作用使培养基中的碳水化合物、类脂及蛋白质转化为电活性物质，显著地改变了培养基性质，压电体声波传感器对这一变化有灵敏的频移响应，频移开始显著变化的点所对应的时间定义为微生物检出时间(MDT)，可为是否有微生物生长提供理论依据。从平板计数法获取的生长曲线则需要人为从静态培养装置中无菌操作吸取菌液至平板中培养24h，绘制一条曲线需要接种数次，时间至少要滞后48h，费时耗力，需要大量培养装置，且无法实时获得动态曲线。实施例2利用食品中微生物生长曲线自动测绘装置测定了不同细菌初始浓度的鲜奶样品的典型生长曲线，其结果如图5所示。由图可知，细菌初始浓度越大，MDT越小，反之，细菌初始浓度越小，MDT越大。在细菌初始浓度约为10-106Cfu/mL时，细菌初始浓度的对数与MDT之间存在线性关系，具体关系式如下LgC=I. 216-0. 432MDT(4)式中C是鲜奶样品中的微生物的初始浓度，MDT是微生物检出时间，其相关系数大约0. 96，说明MDT和被测样品中细菌初始浓度对数呈线性关系。根据检测所得MDT就可推算出样品中的细菌数量，进而可以进行微生物的定量分析。实施例3利用食品中微生物生长曲线自动测绘装置对米粉中的微生物生长曲线进行实时测绘，其结果参见图6，曲线A为米粉经过121° C，IOmin处理后的生长曲线，曲线B和C为 米粉经过80° C，2min处理后的生长曲线，曲线D、E和F为未经处理的米粉中微生物的生长曲线。从图6可知，曲线A无明显的频移变化，无微生物检出时间，可推断米粉经121° C，IOmin处理后，其中的微生物可被完全抑制；曲线B和C大概在10小时后才出现显者的频移变化，表明经80° C，2min处理后米粉中微生物的生长受到抑制，大部分微生物被杀死；曲线D、E和F在3小时之内就出现了显著的频移，表明未经处理的米粉中微生物的数量较多，会对米粉的品质造成一定的影响。从以上结果可知，通过对食品中微生物实时生长曲线的分析可判定食品对象的微生物活性状态，为食品的加工方式提供理论依据。
权利要求
1.一种食品中微生物生长曲线自动测绘的方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤一取25g食品样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，以8000r/min的速度进行均质2min，制成I :10的样品匀液； 步骤二 设立微生物生长曲线自动测绘装置，包括传感系统、读数系统和显示系统三部分，其中传感系统包括带有密封盖的检测管、控温装置、二电极、压电体声波传感器和自激励电路，所述的检测管设于控温装置内，所述的二电极由底部插入检测管内，其中一电极连接自激励电路的输入端，另一电极连接压电体声波传感器的输入端，压电体声波传感器的输出端连接至自激励电路，所述的读数系统包括分频计、驱动电路和单片机，所述的分频计的输入端连接至自激励电路，自激励电路的输出端连接至驱动电路，所述的单片机分别连接至自激励电路和驱动电路，所述的显示系统包括显示器，所述的显示器通过MAX232串口连接至单片机； 步骤三取9mL培养基和ImL由步骤一所得到的样品匀液加入至微生物生长曲线自动·测绘装置的检测管中，拧紧密封盖； 步骤四将检测管插入控温装置中，调节控温装置温度为(37±0.2)°C ； 步骤五启动微生物生长曲线自动测绘装置； 步骤六传感系统中压电体声波传感器对与其串接对象检测管中培养体系的电参数变化有灵敏的频率响应，读数系统将检测到的培养体系的频率信号转换成计算机可识别的数字信号发送给单片机，单片机以频移-时间方式通过显示器实时输出培养体系响应曲线，当检测管中有微生物生长时，微生物可将培养基中电惰性的大分子物质分解为电活性的小分子物质，当微生物浓度达到IO6CfuAiL左右时，检测管中培养体系的电参数发生较显著变化，导致压电体声波传感器的频移发生显著改变，获得食品中微生物实时生长曲线。
2.根据权利要求I所述的一种食品中微生物生长曲线自动测绘的方法，其特征在于，培养基为液体培养基，所述的液体培养基为广谱液体培养基，所述的广谱液体培养基成分为牛肉粉3g，酵母浸膏1.5g，葡萄糖10g，生长因子，蒸馏水1000mL，pH值为7. 0 7. 2。
3.根据权利要求2所述的一种食品中微生物生长曲线自动测绘的方法，其特征在于，所述的生长因子包括L-脯氨酸20mg，L-丝氨酸20mg，L-丙氨酸40mg，L-异亮氨酸70mg，L-亮氨酸98mg,L-门冬氨酸50mg,L-酪氨酸5mg,L-谷氨酸15mg,L_苯丙氨酸IOOmg, L-精氨酸盐酸盐lOOmg，L-赖氨酸盐酸盐80mg，L-缬氨酸70mg，L-苏氨酸50mg，L-组氨酸盐酸盐50mg, L-色氨酸15mg, L-甲硫氨酸45mg, L-胱氨酸2mg,甘氨酸150mg。
4.根据权利要求I所述的一种食品中微生物生长曲线自动测绘的方法，其特征在于，电极为一对经钝化处理的不锈钢棒直接封入聚碳酸酯中，并将端面磨平，得到位于同一平面的一对圆形平面电极，电极的电极常数为0. 58cnTl. 00cm。
5.根据权利要求I所述的一种食品中微生物生长曲线自动测绘的方法，其特征在于，控温装置是使用电阻丝绕在一个用紫铜材料做成的套筒上。
6.根据权利要求I所述的一种食品中微生物生长曲线实时自动测绘的方法，其特征在于，平面电极与压电体声波传感器通过导线串联。
全文摘要
本发明公开了一种食品中微生物生长曲线自动测绘的方法，其主要贡献在于1)从食品中微生物生长规律出发，提出了用测绘微生物生长曲线来进行微生物分析的新方法，是对传统分析方法的技术创新；2)通过实验研究发现压电体声波传感器可将微生物生长信息转化为可测的频率信息，从而为设计快速、高效的新型测绘装置提供了设计原理。3)在新的检测方法和设计原理的指导下设计制作出食品中微生物生长曲线自动测绘装置。本发明所构建的装置可实现食品中微生物生长曲线的实时、自动测绘，依据所获得的生长曲线可进行食品中微生物的深入研究，如食品加工方法、食品货架期、微生物抑菌性研究等等，由于该装置具有操作简便、结果准确等特点，有望在食品加工、储存以及经营中的微生物相关研究中推广应用。
文档编号G01N27/07GK102749516SQ20121023044
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月4日 优先权日2012年7月4日
发明者任佳丽, 周逸阳, 张慧, 李忠海, 林亲录, 马丽娜 申请人:中南林业科技大学