专利名称：一种油菜花粉及其制剂的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种油菜花粉及其制剂的质量控制方法，更具体的说是测定油菜花粉及其制剂中总留醇含量的方法。背景技术：
油菜花粉为蜜蜂科昆虫中华蜂蜜Apis cerana Fabricius等工蜂所采集的十字花科植物油菜Brassica campestis Linn.的干燥花粉，目前国内的普乐安片与普乐安胶囊是采用油菜花粉为主要原料制备而成的。花粉是被子植物雄蕊花药和孢子植物小孢叶上的小孢子囊内的小颗粒状物，是植物的雄性生殖细胞。花粉内含各种丰富的营养物质，具有多种的生物学活性，在治疗前列腺疾病方面有独到的效果。目前市场上已经有“前列康”、“舍尼通”等花粉制品，表现出良好的疗效。这些药物在临床长期使用，已被证明能有效地改善良性前列腺增生症状及并发症，长期使用无毒副作用，同时花粉促进机体代谢及造血、免疫功能，因此适合老年人长期使用。前列康牌普乐安制剂由浙江康恩贝公司生产，是纯油菜花粉制剂，临床用于肾气不固，腰膝酸软，尿后余浙或失禁，及慢性前列腺炎、前列腺增生具有上述症候者。浙江医院谢海宝等用前列康治疗前列腺增生100例的观察结果，减轻症状有效率93. 0%，用药后51例经B超测定前列腺体积有明显缩小，总有效率95. 0%。浙江兰溪市中医院俞大毛用前列康治疗40例前列腺增生患者，总有效率90%。油菜花粉中含多种留体化合物，其中留醇类物质已被证实与抗前列腺增生活性药效有相关性，留醇类物质的含量直接影响到产品的治疗效果。但在目前国内油菜花粉及其制剂质量标准中均无总留醇的含量测定，无法有效的评判产品的质量，保证产品的疗效。从国内外研究看，总留醇的含量测定一般紫外-可见分光光度法，通过显色反应测定总留醇的含量，常用Liebennann-Burchard比色法或改进的Liebennann-Burchard比色法，根据留醇类化合物能与醋酐、浓硫酸发生特征颜色反应(Lieberman反应)的性质测定甾醇含量。但由于花粉中并非单一成份，其它成份会影响其检测，用常规的检测方法存在缺陷，不能保证方法的专一性，同时检测准确性差。任玉翠等在《十二种蜂花粉的黄酮甙及甾醇类成分的含量测定》的研究中(中国医院药学杂志，1990，10 (4) :147-148)),采用薄层色谱展开后，显色确定薄层上留醇色斑，然后吸取留醇色斑再处理后用Liebennann-Burchard显色反应进行含量测定，处理过程复杂，操作繁琐，而且采用薄层色谱测量非常不准确，误差很大；同时我们对正对油菜花粉中总留醇含量测定采用Liebennann-Burchard显色反应及采用改进的Liebennann-Burchard显色反应时发现,样品吸光度变化快,几分钟内吸光度达到最大值，然后迅速下降，显色极不稳定，造成了测定准确率下降，。由于无稳定的显色时间段，故油菜花粉及其制剂的总留醇含量测定不宜简单的采用Liebennann-Burchard显色反应或改进的Liebennann-Burchard显色反应进行测定；董素哲等在《松花粉质量的初步研究》(第九届全国药用植物及植物药学术研讨会，297-298)中，用浓硫酸直接显色测定总甾醇含量，采用本法显色不完全，显色反应同样会随时间长短有所变化，同时由于浓硫酸本身会对检测有影响，由此含量测定值不够准确，含量检测值偏高。
发明内容
本发明提供了一种油菜花粉及其制剂中总留醇含量的检测方法，通过对总留醇含量的检定，可用于控制油菜花粉及其制剂的内在质量。、
本发明对供试样品进行前处理后，进行显色反应，然后采用紫外-可见分光光度法测定油菜花粉及其制剂中的总留醇含量，以控制其质量。为实现上述目的，本发明具体步骤如下(I)供试品溶液处理取供试样品并 进行前处理，称取处理后样品，加入有机溶剂多次提取样品中脂溶性成分，直至提取完全，过滤后将滤液蒸干，加入10%氢氧化钠-乙醇溶液进行皂化，直至皂化完全，用有机溶剂萃取皂化液，分离萃取液即得供试品溶液。(2)显色反应取上述供试品溶液，制于具塞玻璃试管中，水浴加热挥尽其中的有机溶剂，加入香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸溶液，混匀，密塞，60°C _80°C水浴保温10-30分钟，取出，冷却至室温，加入冰醋酸，摇匀，使得吸光度在0. 3-0. 7之间。根据￠-谷甾醇对照试验，其中香草醛加入量为样品中总甾醇含量的100-1000倍，高氯酸加入量为样品中总留醇含量的1000-10000倍。(3)测定方法随行试剂作空白，以甾醇类物质为对照，在542nm测定供试品和对照品的吸光度，按外标法计算总留醇含量，即得样品总留醇含量。本发明中对油菜花粉及其制剂的前处理方法为，取油菜花粉及其制剂，去包衣或外包装后余纯油菜花粉，用70°C减压干燥2小时，并研磨成粉，过筛。具体如下(I)油菜花粉原料，取油菜花粉原料，用70°C减压干燥2小时，置研钵中研磨成粉，过80目筛即得。(2)普乐安片，取普乐安片若干，用润湿的洁净纱布小心擦去表面薄膜衣层，70°C减压干燥2小时，置研钵中研磨成粉，过80目筛即得。(3)普乐安胶囊，取普乐安胶囊若干，去胶囊壳，取出胶囊内容物，将内容物70°C减压干燥2小时，置研钵中研磨成粉，过80目筛即得。本发明中提取样品中脂溶性成分的有机溶剂可采用无水乙醇、石油醚、正己烷、乙醚、氯仿中的一种或几种等，为达到更好的脂溶性成分提取效果，可采用搅拌提取、回流提取、索氏提取、超声提取、超临界二氧化碳提取中的一种。为达到最好的皂化效果，加入氢氧化钠-乙醇溶液后，可置于80_95°C水浴中加热回流2小时。甾醇类物质对照品可选用￠-谷甾醇、胆甾醇等。本发明中显色反应最佳反应条件试验如下0 -谷甾醇对照品(上海中药标准化研究中心，纯度彡98%)，高氯酸溶液(70%,密度I. 76g/ml)、香草醛、冰醋酸、氯仿等试剂均为分析纯。I、对照品溶液的制备精密称取￠-谷甾醇对照品10. 13mg于IOmL量瓶中，加三氯甲烷适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密移取I. OmL于IOmL量瓶中，用三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为 0. 1013mg/mL。2、测定波长的选择分别精密移取0. 5mL^-谷甾醇对照品溶液、I. OmL上述发明制备的供试品溶液于IOmL具塞玻璃管中，85°C水浴挥尽溶剂，加入0. 6mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0. 8mL高氯酸，混匀，密塞，70°C水浴保温30min，取出，流水迅速冷却至室温，精密加入冰醋酸4. 6mL,摇匀，随行试剂作空白，在900-190nm进行波长扫描，对照品和供试品溶液均在在542nm有最大吸收峰，故选择542nm为总甾醇含量测定的检测波长。3、显色条件的选择采用四因素三水平L9 (34)正交试验优选显色条件，正交设计因素水平表设计如下表I显色条件正交设计因素水平表
权利要求
1.一种油菜花粉及其制剂中的总留醇含量的检测方法，包括以下步骤 1)供试品溶液处理 取供试样品并进行前处理，称取处理后样品，加入有机溶剂多次提取样品中脂溶性成分，直至提取完全，过滤后将滤液蒸干，加入10%氢氧化钠-乙醇溶液进行皂化，直至皂化完全，用有机溶剂萃取皂化液，分离萃取液即得供试品溶液； 2)显色反应 取上述供试品溶液，制于具塞玻璃试管中，水浴加热挥尽其中的有机溶剂，加入香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸溶液，混匀，密塞，60°C _80°C水浴保温10-30分钟，取出，冷却至室温，加入冰醋酸，摇匀，使得吸光度在0. 3-0. 7之间； 3)测定方法随行试剂作空白，以留醇类物质为对照，在542nm测定供试品和对照品的吸光度，按外标法计算总留醇含量，即得样品总留醇含量。
2.根据权利要求I所述的检测方法，对油菜花粉及其制剂的前处理方法为，取油菜花粉及其制剂，去包衣或外包装后余纯油菜花粉，用70°C减压干燥2小时，并研磨成粉，过筛。
3.根据权利要求I所述的检测方法，样品脂溶性成分的提取步骤中有机溶剂可采用无水乙醇、石油醚、正己烷、乙醚、氯仿中的一种或几种。
4.根据权利要求I所述的检测方法，为达到更好的脂溶性成分提取效果，可采用搅拌提取、回流提取、索氏提取、超声提取、超临界二氧化碳提取中的一种。
5.根据权利要求I所述的检测方法，显色反应中香草醛加入量为样品中总留醇含量的100-1000倍，高氯酸加入量为样品中总留醇含量的1000-10000倍。
6.根据权利要求I所述的检测方法，皂化步骤中加入氢氧化钠-乙醇溶液后，可置于80-95°C水浴中加热回流2小时。
7.根据权利要求I所述的检测方法，留醇类物质对照品可选用￠-谷留醇、胆甾醇。
8.根据权利要求I所述的检测方法，本发明具体步骤如下 1)供试品溶液的制备 取油菜花粉或其制剂，进行前处理后，70°C减压干燥2小时，置研钵中研磨成粉，过80目筛，称取0. 5g样品，置具塞锥形瓶中，加入50ml有机溶剂，密塞称定重量，超声处理60min，摇匀，过滤，移取过滤液10. Oml于烧瓶中，减压蒸干后加入20ml 10%氢氧化钠-乙醇溶液，95°C水浴回流2小时，放冷，用正己烷萃取3次，每次20ml，合并正己烷萃取液，减压浓缩正己烷液至50ml ； 2)显色反应 移取Iml供试品溶液于IOml具塞玻璃试管中，85°C水浴挥尽溶剂，加入0. 6ml 5%香草醛-冰醋酸溶液，0. 8ml 70%高氯酸，混匀，密塞，70°C水浴保温30min，取出，流水迅速冷却至室温，用冰醋酸定容至6ml，摇匀，即得； 3)测定 用上述同样方法对留醇对照品显色反应，采用紫外-可见分光光度法，随行试剂作空白，于542nm测定吸光度，并制定标准曲线，按外标法计算样品总留醇含量，即得。
全文摘要
一种油菜花粉及其制剂的质量控制方法。本发明涉及一种普乐安片质量控制方法，属于中药现代化领域。一种普乐安片的质量控制方法，包括(1)普乐安片供试品溶液的制备；(2)显色反应；(3)采用紫外-可见分光光度法测定。经分析方法验证，其精密度、重现性、稳定性和回收率符合中国药典2010版一部附录《中药质量标准分析方法验证指导原则》的要求。本发明的优点是通过使用紫外-可见分光光度法，对普乐安片中所含总甾醇进行了定量测定，测试精密度高，可靠性好。通过对普乐安片中总甾醇的监控，可有效控制产品的内在质量。
文档编号G01N21/31GK102749300SQ201210254079
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月18日 优先权日2012年7月18日
发明者吴健, 徐勇, 王如伟, 王建方, 盛卫国, 瞿伟, 胡江宁, 闵会 申请人:浙江现代中药与天然药物研究院有限公司