专利名称：氧化分解后的白朮挥发油的hplc指纹图谱的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种中药材中抗癌有效成分指纹图谱的建立方法，具体是一种氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的建立方法，属于药物分析技术领域。
背景技术：
白Jtt为临床常用中药之一，为菊科植物白Jtt (Atractylodes macrocephalaKoid.)的干燥根茎，主产于浙江、安徽等地。白朮挥发油是白朮抗肿瘤活性部位，在白朮中约含1.4%，挥发油中约含40种不同化学物质，含量最高的成分是苍术酮，占挥发油总量的60%。
目前，多采用气相色谱法对白朮挥发油中的化学成分及其相对含量进行分析。但是，白朮挥发油与其他药材挥发油明显不同，白朮挥发油中苍朮酮的性质不稳定，易发生氧化分解，采用气相色谱对白朮挥发油进行分析测定过程中，测定程序的升温过程会对挥发油中不稳定成分及苍朮酮的稳定造成影响，氧化分解前、后的GS-MS色谱图明显不同。查阅文献可知，有采用HPLC法，对氧化分解前白朮挥发油中单一成分一苍朮酮的定量分析；在指纹图谱的研究中，有报道采用GS法探讨了不同提取方法得到的挥发油其色谱结果差异；采用直观推导式演进特征投影算法，比较不同产地白朮挥发油GS-MS数据，以白朮挥发油质控表征白术药材的质量控制；采用高效毛细管电泳法比较了不同产地白朮药材指纹图谱差异，建立白朮药材指纹图谱分析方法。目前白朮挥发油药用研究主要是集中在氧化分解前的白朮挥发油，焦点是如何阻止其中含量多、性质不稳定成分一苍朮酮的氧化分解。但是上述对氧化分解前白朮挥发油的质量评价方式单一，不足以系统、全面的表明氧化分解后的白朮挥发油的整体质量，亟需探索可全面反映氧化分解后的白朮挥发油质量的标准控制手段。
发明内容
本发明旨在提供一种氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的建立方法，为氧化分解后的白朮挥发油的药用原料、产品生产工艺流程中的各个步骤的质量控制提供依据。本发明是通过以下技术方案实现的氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，所述的氧化分解后的白朮挥发油为由白朮药材中提取得到的白朮挥发油经氧化分解后，其中苍朮酮的分解率达100%的白朮挥发油，所述的建立方法包括以下步骤
(1)供试品溶液的制备精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成I. 5mg mL—1的溶液，此溶液为供试品溶液；
(2)混合对照品溶液的制备用乙腈溶解精密称取的苍朮酮、￠-桉叶醇、白朮内酯I、白朮内酯III，制得混合溶液A ;精密称取P -榄香烯，用体积比为I: I的乙腈-乙酸乙酯的溶液溶解，配制成浓度为IOOPg ml/1的溶液B ;混合溶液A中加入溶液B，再加入乙腈，配制成苍Jtt酮0. 60mg mL' P -桉叶酉享0. 40mg mL'白Jtt内酯I 50Mg mL'白Jtt内酯III 40I^g mL' P -榄香烯20Mg ml/1的混合对照品溶液；
(3)指纹图谱的制作
色谱条件Hypersil ODS2色谱柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;检测波长200nm 240nm,流动相流速为I. OmL柱温为室温；流动相A为乙腈，流动相为B为水，流动相A与B的体
积比为 60:40，采用线性梯度洗脱方式0-30min，40%B — 10%B ；30-45min, 10%B — 10%B ；在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各5W进样量，进行高效液相色谱分析，得到氧化分解后的白朮挥发油的指纹图谱。由白朮中提取得到的白朮挥发油的氧化分解可通过多种方式，例如室外光照及室外非光照下放置，室内适宜温度加热或室内放置等。本发明所述的氧化分解的方式由白朮中提取得到的白朮挥发油的氧化分解是通过将白朮挥发油置于密闭、透光的玻璃容器中， 并将玻璃容器置于室外非光照条件下进行氧化分解。本发明所述的氧化分解方式使得白朮挥发油中的不稳定成分完全氧化分解，氧化分解后的白朮挥发油各成分相对稳定。所述的指纹图谱建立方法中进行高效液相色谱分析时，最佳采样时间为40min。所述的白朮挥发油中的苍朮酮的分解率的检测是采用高效液相色谱检测的，所述的检测方法为
(1)供试品溶液的制备精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成I. 5mg mL—1的溶液，此溶液为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备精密称取苍朮酮，用甲醇溶解配制成0.60mg ml/1的溶液，此溶液为对照品溶液；
(3)苍朮酮分解率的检测
色谱条件Hypersil 0DS2色谱柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;检测波长220nm,流动相流速为
I.OmL HiirT1，柱温为室温；流动相A为体积比为35:30:35的甲醇-乙腈-水，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积比为20:80 ;
在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5W进样量，进行高效液相色谱分析。进一步，本发明采用同一个氧化分解前的白朮挥发油供试品，以苍朮酮的最大吸收波长220nm为检测波长，比较各流动相获得的苍朮酮峰面积，确认流动相乙腈_水作为氧化分解前、后的白朮挥发油的HPLC色谱条件更加科学。进一步，按照本发明所述的建立方法，使用选定的、不同的检测波长进行高效液相分析，对不同检测波长下的色谱数据进行汇总分析，确定了 200nm 240nm之间的任意检测波长均可体现氧化分解后的白朮挥发油中各物质的相对含量。进一步，本发明选取不同产地的白朮药材，提取挥发油，获得氧化分解后的白朮挥发油，按本发明所述的方法进行高效液相色谱分析，通过210、220、240nm三个选定的检测波长，采集、分析及比较色谱图，确定了其共有模式。在以下的实验中，未详细描述的各种过程、方法、仪器、试剂是本领域公知的常规方法。实验I :流动相的选择对比考察
I.I仪器与试剂高效液相色谱仪，甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，三组流动相分别为
I组流动相A为甲醇，B为水；
II组流动相A为乙腈，B为水；
III组流动相A为体积比为60:40的甲醇-乙腈，B为水。I. 2分析方法色谱条件Hypersil 0DS2色谱柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;检测波长220nm，流动相流速为I. OmL mirT1，柱温为室温；流动相A与B的体积比为70:30，采用线性梯度洗脱方式0-30min，70%A — 100%A。I. 3供试品溶液的制备
白朮药材干燥根茎，粉碎，粉末颗粒100%过20目筛；采用超临界二氧化碳萃取法 (SPE法)，萃取得到白朮挥发油；用乙腈溶解白朮挥发油配制成I. 5mg mL-1的溶液。1.4 HPLC 结果
三组流动相的色谱结果见图I至图3。色谱结果分析
I)由图I看出，色谱基线漂移严重，成45度倾斜。实验过程记录表明，柱压很高，在200Pka以上。苍朮酮的峰面积1190。2)由图2看出，色谱基线相对平稳。实验过程记录表明，柱压较低，由113Pka梯度前变成50Pka梯度后。苍朮酮的峰面积2236。3)由图3看出，色谱基线漂移严重，成35度倾斜。实验过程记录表明，柱压由梯度前的142Pka变成梯度后121Pka。苍朮酮的峰面积1413。4) III组流动相的苍朮酮的峰面积1413与I组的相比，苍术酮的峰面积增加18. 74% ； II组流动相的苍术酮的峰面积2236与I组的相比，苍术酮的峰面积增加87. 90%。据此认为，II组(流动相A为乙腈，B为水)流动相较III组和I组流动相的灵敏度更高，柱压低，基线平稳。选择II组(流动相A为乙腈，B为水)流动相作为挥发油色谱图采集更加科学。实验2 :不同检测波长的高效液相色谱法指纹图谱分析考察
2.I白朮挥发油的提取
白朮药材干燥根茎，粉碎，粉末颗粒100%过20目筛；采用超临界二氧化碳萃取法(SPE法)，萃取得到白朮挥发油。2. 2氧化分解后的白朮挥发油的制备
2.2. I白朮挥发油的处理由白朮中提取得到的白朮挥发油的氧化分解是通过将白朮挥发油置于密闭、透光的玻璃容器中，并将玻璃容器置于室外非光照条件下进行氧化分解。2. 2. 2所述的白朮挥发油中的苍朮酮的分解率的检测是采用高效液相色谱检测的，所述的检测方法为
(1)供试品溶液的制备精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成
I.5mg mL—1的溶液，此溶液为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备精密称取苍朮酮，用甲醇溶解配制成0.60mg ml/1的溶液，此溶液为对照品溶液；
(3)苍朮酮分解率的检测
色谱条件Hypersil 0DS2色谱柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;检测波长220nm,流动相流速为I. OmL IirT1,柱温为室温；流动相A为体积比为35:30:35的甲醇-乙腈-/K，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积比为20:80 ;
在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5W进样量，进行高效液相色谱分析。直到苍朮酮的分解率达到100%，得到氧化分解后的白朮挥发油。2. 3供试品溶液的制备
精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成I. 5mg ml/1的溶液，此溶液为供试品溶液。2. 4混合对照品溶液的制备· 用乙腈溶解精密称取的苍朮酮、￠-桉叶醇、白朮内酯I、白朮内酯III，制得混合溶液A ;精密称取榄香烯，用体积比为1:1的乙腈-乙酸乙酯的溶液溶解，配制成浓度为100吒 mL—1的溶液B ;混合溶液A中加入溶液B，再加入乙腈，配制成苍朮酮0. 60mg mL'3 -桉叶醇 0. 40mg mL' 白 Jtt 内酯 I 50Mg mL' 白 Jtt 内酯III 40I^g mL' P -榄香烯20Mg ml/1的混合对照品溶液。2. 5指纹图谱分析
2.5. I供试品溶液的指纹图谱分析
色谱条件Hypersil 0DS2色谱柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;检测波长为200nm 240nm,流动相流速为I. OmL柱温为室温；流动相A为乙腈，流动相为B为水，流动相A与B的
体积比为 60:40，采用线性梯度洗脱方式0-30min，40%B — 10%B ；30-45min, 10%B — 10%B。在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液5W进样量，进行高效液相色谱分析。2. 5. 2混合对照品溶液的指纹图谱分析
色谱条件Hypersil 0DS2色谱柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;检测波长210nm,流动相流速为I. OmL mirT1,柱温为室温；流动相A为乙腈,流动相为B为水,流动相A与B的体积比为60:40，采用线性梯度洗脱方式0-30min，40%B — 10%B ；30-45min, 10%B — 10%B。在上述色谱条件下，精密吸取混合对照品溶液5W进样量，进行高效液相色谱分析。2. 6色谱图处理
色谱图积分条件设置峰高> 2，峰面积> 10，保留时间5min之前的峰定为试剂峰。2. 7色谱结果
在上述色谱条件下，采集的检测波长分别为200nm、205 nm、210 nm、215 nm、220 nm、230nm、240nm的供试品溶液色谱图以及检测波长为210 nm的混合对照品溶液色谱图见
图11，图中1_白朮内酯III，2-@-桉叶醇，3-白朮内酯I ,4-苍朮酮，5-3-榄香烯；各检测波长采集的色谱图见图4至图11。对图4至图10中的色谱数据进行汇总，结果见表I。表I不同检测波长的色谱分析结果
权利要求
1.氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述的氧化分解后的白朮挥发油为由白朮药材中提取得到的白朮挥发油经氧化分解后，其中苍朮酮的分解率达100%的白朮挥发油，所述的建立方法包括以下步骤 (1)供试品溶液的制备精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成I. 5mg mL—1的溶液，此溶液为供试品溶液； (2)混合对照品溶液的制备用乙腈溶解精密称取的苍朮酮、￠-桉叶醇、白朮内酯I、白朮内酯III，制得混合溶液A ;精密称取P -榄香烯，用体积比为I: I的乙腈-乙酸乙酯的溶液溶解，配制成浓度为IOOPg ml/1的溶液B ;混合溶液A中加入溶液B，再加入乙腈，配制成苍Jtt酮0. 60mg mL' P -桉叶酉享0. 40mg mL'白Jtt内酯I 50Mg mL'白Jtt内酯III 40I^g mL' P -榄香烯20Mg ml/1的混合对照品溶液； (3)指纹图谱的制作 色谱条件Hypersil ODS2色谱柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;检测波长200nm 240nm,流动相流速为I. OmL柱温为室温；流动相A为乙腈，流动相为B为水，流动相A与B的体积比为 60:40，采用线性梯度洗脱方式0-30min，40%B — 10%B ；30-45min, 10%B — 10%B ； 在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各5W进样量，进行高效液相色谱分析，得到氧化分解后的白朮挥发油的指纹图谱。
2.根据权利要求I所述的氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，由白朮中提取得到的白朮挥发油的氧化分解是通过将白朮挥发油置于密闭、透光的玻璃容器中，并将玻璃容器置于室外非光照条件下进行氧化分解。
3.根据权利要求I或2所述的氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述的指纹图谱建立方法中进行高效液相色谱分析时，采样时间为40min。
4.根据权利要求I或2所述的氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述的白朮挥发油中的苍朮酮的分解率的检测是采用高效液相色谱检测的，所述的检测方法为 (1)供试品溶液的制备精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成I. 5mg mr1的溶液，此溶液为供试品溶液； (2)对照品溶液的制备精密称取苍朮酮，用甲醇溶解配制成0.60mg ml/1的溶液，此溶液为对照品溶液； (3)苍朮酮分解率的检测 色谱条件Hypersil ODS2色谱柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;检测波长220nm,流动相流速为I. OmL HiirT1，柱温为室温；流动相A为体积比为35:30:35的甲醇-乙腈-水，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积比为20:80 ; 在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5W进样量，进行高效液相色谱分析。
5.根据权利要求3所述的氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述的白朮挥发油中的苍朮酮的分解率的检测是采用高效液相色谱检测的，所述的检测方法为 (I)供试品溶液的制备精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成I. 5mg mr1的溶液，此溶液为供试品溶液；(2)对照品溶液的制备精密称取苍朮酮，用甲醇溶解配制成0.60mg ml/1的溶液，此溶液为对照品溶液； (3)苍朮酮分解率的检测 色谱条件Hypersil ODS2色谱柱,4. 6mmX 250mm, 5Mm ;检测波长220nm,流动相流速为I.OmL HiirT1，柱温为室温；流动相A为体积比为35:30:35的甲醇-乙腈-水，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积比为20:80 ; 在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5W进样量，进行高效液相色谱分析。
全文摘要
本发明涉及一种中药材中抗癌有效成分指纹图谱的建立方法，具体是一种氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的建立方法，包括供试品溶液的制备、混合对照品溶液的制备、指纹图谱的制作，通过对4个产地的氧化分解后的白朮挥发油HPLC指纹图谱对比，确定了其共有峰。采用本发明所提供的方法所建立的HPLC指纹图谱，可有效地表征氧化分解后的白朮挥发油的质量，有利于控制氧化分解后的白朮挥发油的药用原料、产品生产工艺流程中的各个步骤的质量。
文档编号G01N30/06GK102798686SQ201210254120
公开日2012年11月28日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者阎克里 申请人:山西省肿瘤医院