胶体金法丙型肝炎病毒(hcv)快速诊断试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种胶体金法丙型肝炎病毒(HCV)快速诊断试剂盒及其制备方法。在支撑板上分别固定了上样垫、胶体金标记的鼠抗人抗体以及吸附在硝酸纤维膜上的含HCV多抗原的阳性检测线、吸附在硝酸纤维膜上的含羊抗鼠的阴性检测线，该试剂盒上的阳性线采用HCV多抗原按一定比例配伍的方法，具有检测灵敏度高、特异性好、操作简单、成本低廉以及快速易普及的特点，最重要的是可以有效筛选现在市售检测试剂盒检测的假阴性特点。
【专利说明】胶体金法丙型肝炎病毒(HCV)快速诊断试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及丙型肝炎病毒的检测。
【背景技术】
[0002]丙型肝炎病毒(HCV)在1989年由美国Choo等人第一次从受感染的黑猩猩血液中分离出来，据世界卫生组织统计，全球估计约有1.7亿人被HCV感染，我国约有四千万左右。丙型肝炎慢性转化率为50% -75%，其中约有20%可进一步发展为肝硬化、肝纤维化、肝癌，严重危害人类健康。然而到目前为止，世界上仍没有疫苗问世，也无有效地治疗方法，临床普遍运用的聚乙二醇干扰素联合利巴韦林的方法对相当一部分人是无效的，由于HCV的复杂性，因此可能在短时间难有有效地疫苗问世，预防感染可能是有效的方法。HCV的传播途经主要是通过血源传播，其中包括输血后感染和使用血液制品引起的感染，约占输血后肝炎的70%。因此从血源预防对于减少输血引起的感染将是一个重要的手段。
[0003]酶联免疫法(ELISA) HCV抗体诊断时目前常用的HCV检测方法，到目前为止已经发展到了第三代，在国内普遍采用HCV的core、NS3、NS4和NS5抗原混合包被进行检测，在国外增加入了 E抗原的配伍使用。ELISA法检测有很多不足之处，比如检测时间长、稳定性相对较低，需要专业的技术人员操作以及重要的灵敏度和特异性问题，需要对其进一步改进，另外现在市售的ELISA法基本都是采用间接法检测，采用双抗原法可能更好的解决其灵敏度和特异性问题，但是由于抗原标记影响抗原的一些问题，因此到目前为止，还没有成功的检测试剂盒出售。
[0004]免疫层析胶体金法是新型的免疫学检测方法，它具有检测方便、快速、稳定性对检测人员要求不高的优点，越来越受到研究者的关注，然而不足的可能是其灵敏度比ELISA法稍低，且开发难度大、对抗体、抗原要求纯度和稳定性要求更高。
[0005]到目前为止，国内外虽有部分公司研制开发了胶体金法HCV抗体诊断试剂盒，由于E抗原容易变性等问题，大多公司还是没有将E抗原运用到检测中，这对于一部分假阴性的检测是非常不利的。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种快速检测丙型肝炎病毒的试剂盒。
[0007]本发明的目的就是针对市场现有产品中存在的缺陷，提供了一种快速定型检测血液或血浆中HCV抗体检测胶体金法检测试剂盒，为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:胶体金法HCV抗体检测试剂盒，包括了在无纺布或玻璃纤维包被的溶有胶体金标记的鼠抗人抗体，阳性检测线上硝酸纤维膜包被的是按一定比列配伍的HCV抗原，包括core、El、E2、NS3、NS4、NS5六个蛋白，阴性检测线上硝酸纤维膜包被的是羊抗鼠抗体。
[0008]以上所用的鼠抗人抗体和羊抗鼠抗体为无色透明液体，浓度为2mg/ml，用SDS-PAGE检测仅有一条带，纯度大于95% ；
[0009]所用的HCV混合抗原为无色透明液体，混合抗原包括HCV的core，EI，E2，NS3，NS4，NS5等6个抗原，混合前的单抗原通过高压液相层析检测仅有一个主峰，SDS-PAGE检测一条带，纯度大于95% ；
[0010]HCV混合抗原用碳酸盐缓冲液和终浓度为3%的BSA混合液将core、El、E2、NS3、NS4、NS5按照15: 7: 3: 12: 10: 9的比例进行配伍；
[0011]本发明的另一个目的是提供胶体金法HCV抗体检测试剂盒的制备方法，具体的实施方法如下。
【具体实施方式】
[0012]1.主要材料
[0013]1.1 试剂:
[0014]一定比例配伍的HCV core, El，E2，NS3, NS4, NS5等抗原皆为基因工程重组表达纯化抗原，为自产(具体生产方法见下面方法)；鼠抗人抗体和羊抗鼠抗体为北京康为世纪公司生物有限公司产品；氯金酸为sigma公司产品；硝酸纤维膜为美国PALL公司产品；牛血清白蛋白(BSA)为Roche公司产品；其他试剂全部为分析纯，购自国药集团。
[0015]1.2临床血清:在医院或血站收集的600份血清，检测出的HCV阳性400份，阴性200 份。
[0016]1.3现有市场产品:HCV检测试剂盒分别为科华的酶联免疫法(立可读)试剂盒和厦门波生生物HCV抗体胶体金法检测试剂盒。
[0017]2.方法:
[0018]2.1胶体金垫的制备:
[0019]通过还原法制备40nm-50nm左右的胶体金溶液，颜色变得鲜红清亮后分别三份进行实验，第一份用0.1moVLK2CO3调PH为8.0，第二份调PH为8.5，第三份调PH为9.0。然后在溶液中分别加入lmg、l.5mg、2.0mg鼠抗人抗体,缓慢逐滴加入,继续搅拌35分钟后,再加入终浓度为3%的BSA和终浓度为I %的TWEEN20继续搅拌10分钟，然后4°C，12000rpm离心45分钟，小心吸取上清弃去；用胶体金溶液重新定容至100ml，按Iml溶液铺30cm2的比例均匀铺在玻璃纤维或无纺布上，置于干燥间，37°C，湿度25%条件下干燥3小时，制成胶体金垫。
[0020]2.2样品垫的处理:
[0021]将玻璃纤维或无纺布浸泡于50ml 0.01mol/L PH = 7.4的磷酸盐缓冲液中(含终浓度3% BSA, 0.05%的TWEEN20)中I小时，37°C烘干，真空封装，4°C保存备用。
[0022]2.3HCV多抗原制备、配伍和包被；
[0023]2.3.1抗原制备
[0024]HCV抗原的生产过程:通过PCR扩增技术，分别将HCV core、El、E2、NS3、NS4、NS5 基因的序列(具体序列见 GenBank 数据库，http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/EU234065)构建到pET-his载体(来自Addgene网站)中，然后转化到BL21 (DE3)细菌，在IPTG诱导作用下，进行蛋白表达；表达的蛋白通过GE公司的Ni柱子进行纯化，纯化的蛋白经过高效液相色谱(HPLC)和SDS-PAGE分析显示纯化的蛋白纯度达到95%以上，可作为冻干粉保存。
[0025]2.3.2配伍和包被[0026]用碳酸盐缓冲液和终浓度为3 %的BSA混合液将core: El: E2: NS3: NS4: NS5 按照 15: 7: 3: 12: 10: 9 的比例将配伍好的HCV El、E2、NS3、NS4, core、NS5 混合抗原稀释到 0.5mg/ml、lmg/ml 和 1.5mg/ml，用点膜机将包被液划到硝酸纤维膜上，37°C干燥4小时，4°C保存备用。
[0027]用磷酸盐缓冲液和终浓度为3%的BSA混合液将羊抗鼠抗体稀释到2mg/ml，用点膜机将包被液划到硝酸纤维膜上，37°C干燥4小时，4°C保存备用。
[0028]2.4切割装配:
[0029]将上样垫、胶体金标记的鼠抗人抗体结合物垫、带有HCV抗原和羊抗鼠的硝酸纤维膜、吸样垫装配成反应板，用切条机切成4mm试剂条，进行装卡后，装入铝箔袋制成成品。
[0030]2.5检测方法和结果判断:
[0031]取50ul-100ul左右待测血液或血浆滴在上样垫上，反应大约25分钟左右，根据颜色反应用肉眼直接观测结果，如果在阳性和阴性都出现带，则证明样品有HCV感染或携带有HCV，如果只在阴性处有红色带，则说明样品可能无HCV感染。
[0032]2.6最佳参数确定实验:
[0033]将上诉包被的不同剂量抗原抗体组合配对，利用国家HCV抗体国家参考品(胶体金类)进行测试分析，确定最近组合参数值。
[0034]2.7临床血清效果检测
[0035]分别用本试剂盒、上海科华公司生产的HCV ELISA(立可读)检测试剂盒和厦门波生生物生产的HCV抗体胶体金法检测试剂盒对医院或血站取得的300血清。
[0036]3 结果
[0037]3.1参数确定:
[0038]根据最后检测结果显示，试剂纸最近标记PH约为9.0 ;鼠抗人胶体金标记抗体最佳量1.5mg/100ml胶体金溶液,按比列配伍的HCV混合抗原的最佳标记量为lmg/ml,羊抗鼠抗体为2mg/ml，最佳的胶体金工作液为PH为9.0的含0.01 %的氯金酸和I %柠檬酸钠水溶液，并加入了 3% BSA和1% TWEEN20，检定最佳时间为15-30分钟。
[0039]3.2血清检测分析
[0040]结果显示，科华公司ELISA试剂盒300份血清中检出145份阳性⑴，155份阴性(-)，波生HCV抗体胶体金试剂盒检出130份阳性，170份阴性(含三份±)，而本试剂盒共检出151份阳性和149份阴性，总结如下表:
【权利要求】
1.一种胶体金法胶体金法丙型肝炎病毒(HCV)快速诊断试剂盒，包括了在无纺布或玻璃纤维包被的溶有胶体金标记的鼠抗人抗体，阳性检测线上硝酸纤维膜包被的是按一定比列配伍的HCV抗原，包括core、El、E2、NS3、NS4、NS5六个蛋白，阴性检测线上硝酸纤维膜包被的是羊抗鼠抗体。
2.如权利要求1所述胶体金法胶体金法丙型肝炎病毒(HCV)快速诊断试剂盒，其特征在于，阳性检测线上硝酸纤维膜包被的是按一定比列配伍的HCV抗原，包括core、EU E2、NS3、NS4、NS5六个蛋白，按照15: 7: 3: 12: 10: 9的比例进行配伍。
3.如权利要求1所述胶体金法胶体金法丙型肝炎病毒(HCV)快速诊断试剂盒，其特征在于，在无纺布或玻璃纤维包被的溶有胶体金标记的鼠抗人抗体，其浓度为浓度为2mg/ml。
4.如权利要求1所述胶体金法胶体金法丙型肝炎病毒(HCV)快速诊断试剂盒，其特征在于，阴性检测线上硝酸纤维膜包被的是羊抗鼠抗体，其浓度为2mg/ml。
5.如权利要求2所述胶体金法胶体金法丙型肝炎病毒(HCV)快速诊断试剂盒，其特征在于,将HCV core、E1、E2、NS3、NS4、NS5六个基因构建在pET_hi s载体中，转化到BL21 (DE3)细菌，在IPTG诱导作用下，进行蛋白表达，蛋白进过Ni柱子进行纯化。
6.如权利要求2所述胶体金法胶体金法丙型肝炎病毒(HCV)快速诊断试剂盒，其特征在于，HCV core、El、E2、NS3、NS4、NS5 六个基因序列分别是 SEQ ID N0.1-N0.6。
7.一种胶体金法HCV抗体检测试剂盒的制备方法，包括下列步骤: a、胶体金垫的制备； b、样品垫的处理； C、HCV多抗原制备、配伍和包被； d、切割装配。
【文档编号】G01N33/576GK103575884SQ201210259659
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月25日 优先权日:2012年7月25日
【发明者】韩涛, 高博, 孙伟, 李永涛, 谢胜华, 刘宝君 申请人:上海纽卓生物科技有限公司