专利名称：木豆叶药材指纹图谱的建立及其指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药药材的质量控制方法，具体涉及木豆叶药材高效液相色谱法指纹图谱的构建方法和标准指纹图谱。
背景技术：
木豆叶为豆科植物木豆iCajanus cajan (L. )MiIlsp)的干燥叶片及嫩枝。木豆英文常用名为Pigeonpea，别名黄豆树、豆蓉树、三叶豆、千年豆、树豆、蓉豆、柳豆、花豆、米豆等，主要分布于长江以南的海南、云南、广西、贵州、广东以及福建、湖南、四川、江西、浙江、 台湾等省区，资源较丰富。《陆川本草》记载木豆叶“平、淡、有小毒”。《中华药海》对此作了进一步说明木豆叶“平、淡、有小毒、入心径”主治小儿水痘、痛肿。民间常将木豆叶用于治疗外伤、烧伤感染、褥疮、止痛、消肿、止血等，取得了很好的疗效。木豆叶中主要含有牡荆苷、 异牡荆苷等多种黄酮类成分，具有降血压、止痉挛、抗感染、抗菌、辐射保护以及清除自由基的作用。以木豆叶为君药组成的复方具有补肾健骨、活血祛瘀、消炎镇痛及提高免疫功能等作用。此外木豆叶水提物还可以改善去势大鼠血管内皮功能、保护大鼠、小鼠由脑缺血、缺氧造成的损伤。
木豆叶水提物的临床疗效明显，作用确切，是一味很有研究价值的中草药，但其化学成分众多，药理作用广泛。目前，木豆叶水提物的质量控制多采用牡荆苷、异牡荆苷作为指标。但是，仅仅依靠单一或几个化学成分并不足以反映药材的整体质量。指纹图谱现已成为当前中药支链研究的一个热点，它是中药生产质量的一种新型标准，可以确保中药的一致性、疗效的安全性及可靠性，能够全面反映中药材所含化学成分的种类与数量，从整体上控制药材的质量。发明内容
本发明的目的为木豆叶药材的质量控制和真伪鉴别提供一个新的方法，通过建立木豆叶药材指纹图谱的方法，并由此方法得到木豆叶药材共有模式的指纹图谱。
为达到本发明的目的所采用的技术方案用高效液相色谱法建立木豆叶药材指纹图谱的方法，具体包括如下步骤(a)对照品溶液的制备精密称取牡荆苷对照品，用甲醇配制成每ImL含牡荆苷O.05 O.2mg的溶液，作为对照品溶液；(b)供试品溶液的制备精密称取木豆叶药材粗粉，加入蒸馏水回流提取，滤过，取续滤液适量滤膜滤过，即得供试品溶液；(c)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为甲醇与冰醋酸组成的梯度洗脱液；紫外检测波长为220 300nm ；(d)测定精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
进一步优选的方法可以通过下述步骤实施(a)对照品溶液的制备精密称取牡荆苷对照品，用甲醇配制成每ImL含牡荆苷O.05 O.2mg的溶液，作为对照品溶液；(b)供试品溶液的制备精密称取木豆叶药材粗粉(二号筛)1.O 5. Og,置于100 500mL具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水50 250mL，密塞，回流提取lh，放冷，滤过，滤液用蒸馏水定容至100 250mL，适量滤膜滤过，即得供试品溶液；(c)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采·用梯度洗脱，流动相为甲醇与1. 0% 3. 0%冰醋酸组成的梯度洗脱液；柱温20 40°C ;紫外检测波长为220 300nm ;流速0. 5 1. 2mL · mirf1 ;时间IOOmin 140min ；(d)测定精密吸取供试品溶液10 20 μ L注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
本发明最佳的检测方法可以通过下述步骤实施(b)供试品溶液的制备精密称取木豆叶药材粗粉(二号筛)5.0g，置于250mL具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水IOOmL,密塞，回流提取lh，放冷，滤过，滤液用蒸馏水定容至IOOmL, 以0. 22 μ m微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；(c)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为甲醇与1.0%冰醋酸组成的梯度洗脱液，柱温40°C ;检测波长为268nm ;流速为1. OmL · mirT1 ;分析时间为 125min。
在步骤(c)中，所述的梯度洗脱，优选梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行O分钟时，流动相A为10%的甲醇溶液、流动相B为90%的1. 0%的冰醋酸水溶液；10分钟时，流动相A为20%的甲醇溶液、流动相B为80%的1. 0%的冰醋酸水溶液 10分钟时，流动相A为22%的甲醇溶液、流动相B为78%的1. 0%的冰醋酸水溶液 40分钟时，流动相A为24%的甲醇溶液、流动相B为76%的1. 0%的冰醋酸水溶液 65分钟时，流动相A为33%的甲醇溶液、流动相B为67%的1. 0%的冰醋酸水溶液 80分钟时，流动相A为70%的甲醇溶液、流动相B为30%的1. 0%的冰醋酸水溶液 100分钟时，流动相A为80%的甲醇溶液、流动相B为20%的1. 0%的冰醋酸水溶液； 115分钟时，流动相A为93%的甲醇溶液、流动相B为17%125分钟时，流动相A为100%的甲醇溶液、流动相B为0%
具体见下表的1.0%的1.0%的1.0%的冰醋酸水溶液； 的冰醋酸水溶液。
权利要求
1.一种木豆叶药材指纹图谱的建立方法，其特征在于采用高效液相色谱法，具体包括如下步骤 (a)对照品溶液的制备精密称取牡荆苷对照品，用甲醇配制成每ImL含牡荆苷0.05 0. 2mg的溶液，作为对照品溶液； (b)供试品溶液的制备精密称取木豆叶药材粗粉，加入蒸馏水回流提取，滤过，取续滤液适量滤膜滤过，即得供试品溶液； (c)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为甲醇与冰醋酸组成的梯度洗脱液；紫外检测波长为220 300nm ； (d)测定精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
2.如权利要求I所述的木豆叶药材指纹图谱的建立方法，其特征在于 所述步骤 (a)对照品溶液的制备精密称取牡荆苷对照品，用甲醇配制成每ImL含牡荆苷0.05 0. 2mg的溶液，作为对照品溶液； (b)供试品溶液的制备精密称取木豆叶药材粗粉(二号筛)I.0 5. Og,置于100 500mL具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水50 250mL，密塞，于100°C水浴中回流lh，放冷，滤过，滤液用蒸馏水定容至100 250mL，适量滤膜滤过，即得供试品溶液； (c)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为甲醇与I. 0% 3. 0%冰醋酸组成的梯度洗脱液；柱温20 40°C ;紫外检测波长为220 300nm ;流速0. 5 I. 2mL mirf1 ;时间IOOmin 140min ； (d)测定精密吸取供试品溶液10 20 ii L注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
3.如权利要求I所述的木豆叶药材指纹图谱的建立方法，其特征在于 所述步骤 (b)供试品溶液的制备精密称取木豆叶药材粗粉(二号筛)5.0g，置于250mL具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水IOOmL,密塞，回流提取lh，放冷，滤过，滤液用蒸馏水定容至IOOmL,以0. 22 y m微孔滤膜滤过，即得供试品溶液； (c)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为甲醇与I.0%冰醋酸组成的梯度洗脱液，柱温40°C ;检测波长为268nm ;流速为I. OmL mirT1 ;分析时间为125min0
4.如权利要求3所述的木豆叶药材指纹图谱的建立方法，其特征在于 步骤(C)色谱条件中所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行 ·0分钟时，流动相A为10%的甲醇溶液、流动相B为90%的I. 0%的冰醋酸水溶液； ·10分钟时，流动相A为20%的甲醇溶液、流动相B为80%的I. 0%的冰醋酸水溶液； ·10分钟时，流动相A为22%的甲醇溶液、流动相B为78%的I. 0%的冰醋酸水溶液； ·40分钟时，流动相A为24%的甲醇溶液、流动相B为76%的I. 0%的冰醋酸水溶液； ·65分钟时，流动相A为33%的甲醇溶液、流动相B为67%的I. 0%的冰醋酸水溶液； ·80分钟时，流动相A为70%的甲醇溶液、流动相B为30%的I. 0%的冰醋酸水溶液； ·100分钟时，流动相A为80%的甲醇溶液、流动相B为20%的I. 0%的冰醋酸水溶液；115分钟时，流动相A为93%的甲醇溶液、流动相B为17%的I. 0%的冰醋酸水溶液； 125分钟时，流动相A为100%的甲醇溶液、流动相B为0%的I. 0%的冰醋酸水溶液。
5.一种如权利要求I所述的指纹图谱的建立方法所得木豆叶药材的指纹图谱，其特征在于指纹图谱中有12个特征共有峰，其中S号色谱峰为牡荆苷参照峰，最强峰为6号色谱峰，图谱总长度为125min，具体如下 I号峰，平均相对保留时间RRT为O. 5832，RSD为O. 14%，平均相对峰面积RPA为I. 9761，RSD 为 42. 34% ； 2号峰，平均相对保留时间RRT为O. 6455，RSD为O. 11%，平均相对峰面积RPA为I. 8675，RSD 为 47. 96% ； 3号峰，平均相对保留时间RRT为O. 6632，RSD为O. 11%，平均相对峰面积RPA为2. 8239，RSD 为 46. 81% ； 4号峰，平均相对保留时间RRT为O. 7834，RSD为O. 07%，平均相对峰面积RPA为2. 6873，RSD 为 49. 52% ； 5号峰，平均相对保留时间RRT为O. 8132，RSD为O. 08%，平均相对峰面积RPA为2. 9968，RSD 为 34. 89% ； 6号峰，平均相对保留时间RRT为O. 8720，RSD为O. 51%，平均相对峰面积RPA为3. 2290，RSD 为 39. 56% ； 7号峰，平均相对保留时间RRT为I. 0587，RSD为O. 00%,平均相对峰面积RPA为I. 2261，RSD 为 55. 55% ； 8号峰，平均相对保留时间RRT为I. 1262，RSD为O. 03%，平均相对峰面积RPA为O. 7136，RSD 为 33. 81% ； 9号峰，平均相对保留时间RRT为I. 1852，RSD为O. 05%，平均相对峰面积RPA为I. 0179，RSD 为 14. 74% ； 10号峰，平均相对保留时间RRT为2. 0149，RSD为O. 12%,平均相对峰面积RPA为.2.4653，RSD 为 58. 56% ； 11号峰，平均相对保留时间RRT为2. 4052，RSD为O. 20 %，平均相对峰面积RPA为I.0804，RSD 为 55. 30%。
全文摘要
本发明木豆叶药材指纹图谱的建立及其指纹图谱，涉及中药药材的质量控制方法，具体是建立HPLC指纹图谱以检测木豆叶药材提取液的方法。方法包括(a)对照品溶液的制备；(b)供试品溶液的制备；(c)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为甲醇与1.0%～3.0%冰醋酸组成的梯度洗脱液；柱温20～40℃；紫外检测波长为220～300nm；流速0.5～1.2mL·min-1；时间100min～140min；(d)测定高效液相色谱法测得指纹图谱。本发明的有益效果能有效表征木豆叶药材的质量，有利于监控药材的质量；具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好；可快速、准确地鉴别药材的真伪优劣。
文档编号G01N30/88GK102980965SQ201210270949
公开日2013年3月20日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者黄松, 丁婕, 赖小平, 陈建南, 詹丽玲, 孙琳, 李婧, 王培培 申请人:东莞广州中医药大学中医药数理工程研究院