专利名称：一种猪支原体肺炎雾化活疫苗及其制备与检验方法
技术领域：
本发明属于药物制剂技术领域，涉及ー种疫苗及其制备与检验方法，具体涉及ー种猪支原体肺炎雾化活疫苗及其制备与检验方法。
背景技术：
猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体感染引起的ー种接触性慢性呼吸道传染病。本病遍布全球，并且易与其它病原发生混合感染，引起更严重的肺部病变，产生更大的经济损失。疫苗免疫是预防该病的主要方法。目前市场上可供选择的疫苗主要分为进ロ灭活疫苗和国产弱毒疫苗。猪支原体肺炎灭活疫苗免疫后由于不能阻制猪肺炎支原体野毒对支气管纤毛的定植，因此无法产生完全的保护。猪支原体肺炎活疫苗(168株)是国内唯一一个大量推广使用的弱毒疫苗，临床使用效果显著，实验室的攻毒保护试验表明，其保护效率要高于进ロ灭活疫苗，然而该活疫苗目前所采用肺内注射免疫途径不利于大規模推广。若能将猪支原体肺炎活疫苗制成雾化剂型，则不仅能提高疫苗接种的方便性，而且大大节省了劳 动カ和劳动时间，达到更好推广免疫该疫苗的目的。由于猪鼻甲骨与气管解剖结构的特点，只有粒径为I IOym的微粒经气雾以适当的角度可以进入下呼吸道。较粗的颗粒大部分落在上呼吸道鼻腔黏膜上，无法对疫苗起到靶向作用。如果微粒太细(<0.5i!m)，则进入肺泡囊后又随呼气排出，所以必须将猪支原体肺炎雾化活疫苗的粒径控制在I IOym内。本发明在气溶液胶的发生方式与发生设备上对之进行了控制。气溶胶在发生方式上总体可分为物理凝集法、化学凝集法、机械分散法和气流分散法。对于微生物气溶胶，具有严格的选择性，一般常用气流分散法进行。而液相气流分散法又可细分为水力式、吹气式、离心式、振动式和超声波法等等。考虑到本发明既需要在单位时间内喷出较多量的疫苗气溶胶，而且气溶胶粒子谱范围不能太大，我们最终选择吹气式雾化法和水力式雾化法作为雾化活疫苗的制备方法。另外，由于雾化过程中所产生的切削力、高压カ等均会对微生物的活性产生影响，然而，控制气溶胶微粒大小和疫苗活力本身又是ー种矛盾。气溶胶生成过程中的切削力、高压カ越大，雾化粒子越小，但疫苗株的活力也越低。因此，在制备猪支原体肺炎雾化活疫苗时，必须加入一定的保护剂，以减少雾化过程所产生的各种作用力对疫苗的损伤。除了切削力、高压カ等作用力外，影响气溶胶微生物活力的因素还有环境因素，如在低湿、高温环境下，雾化疫苗中水份快速蒸发，盐代谢失调和急剧的干燥作用、氧化作用使雾化疫苗活力大大降低。因此，为保持雾化疫苗的微生物学活性，本发明在制备雾化疫苗时，综合考虑了雾化疫苗的发生方法、疫苗溶液的组成以及环境因素等。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种猪支原体肺炎雾化活疫苗及其制备与检验方法，本发明将猪支原体肺炎活疫苗制成雾化剂型，则不仅能提高疫苗接种的方便性，而且大大节省了劳动カ和劳动时间，达到更好推广免疫该疫苗的目的。其技术方案为—种猪支原体肺炎雾化活疫苗，包含有以下组分疫苗菌株、疫苗稀释液，所述疫苗菌株为猪肺炎支原体弱毒株(168株)的冻干菌种或新鮮培养的菌液；所述疫苗稀释液为pH值6. 8-7. 5，且终浓度为含5_10%甘油的去离子水溶液，或含0. 1_1%。丙ニ醇嵌段聚醚(F68)的去离子水溶液，或含0. I %聚こ烯基吡咯烷酮(PVP)的去离子水溶液，或者为上述保护剂的任意組合。进ー步优选，所述保护剂组合为终浓度为含5%甘油、0. 1%聚こ烯基吡咯烷酮(PVP)的去离子水溶液。一种猪支原体肺炎雾化活疫苗的制备方法，包括以下步骤 I)用疫苗稀释液溶解冻干的疫苗菌株，或稀释新鲜培养的菌液，配制成猪支原体肺炎活疫苗溶液，并使该疫苗溶液的PH值为6. 8-7. 5，其中所含甘油的终浓度为5-10%，或含丙ニ醇嵌段聚醚(F68)的终浓度为0. 1-1%。，或含聚こ烯基吡咯烷酮(PVP)的终浓度为0. I %，疫苗菌种或菌液与疫苗稀释液的配制比例为I : I I : 100;2)将步骤I)所得的猪支原体肺炎活疫苗溶液通过吹气式雾化法或水力式雾化法制成雾化活疫苗。所述猪支原体肺炎雾化活疫苗粒径在1-10 U m之间，且保持一定的活性，雾化活疫苗的滴度相比活疫苗溶液的滴度应控制为降低I个滴度以内。步骤2)中所述的吹气式雾化法所用喷雾设备应为医用下呼吸道沉积型喷雾器，或喷雾粒度直径可控制在1-10 U m之间的电动喷雾器。步骤2)中所述的水力式雾化法所用的喷雾设备应为喷雾粒度直径可控制在1-10 u m之间的高压喷雾降温系统。一种猪支原体肺炎雾化活疫苗的检验方法，包括雾化疫苗气溶胶粒径检测和雾化疫苗活力检测所述的雾化疫苗气溶胶粒径检测方法为通过软垫法采集疫苗气溶胶后经显微镜对视野中每个颗粒进行粒径測量与分布统计，或者通过气溶胶粒径分析仪对疫苗气溶胶的粒径和粒度分布作检测，所述的雾化疫苗活力检测方法为通过雾化疫苗定量收集装置收集疫苗气溶胶，然后通过CCU法检测雾化疫苗的滴度。与现有技术相比，本发明的有益效果为本发明将猪支原体肺炎活疫苗制成雾化剂型，则不仅能提高疫苗接种的方便性，而且大大节省了劳动カ和劳动时间，达到更好推广免疫该疫苗的目的；本发明的制备方法中将猪支原体肺炎雾化活疫苗的粒径控制在I IOym内，适应猪鼻甲骨与气管解剖结构的特点；本发明在制备猪支原体肺炎雾化活疫苗时，加入一定的保护剂，以減少雾化过程所产生的各种作用力对疫苗的损伤。
图I为气溶胶粒径分析仪检测猪支原体肺炎雾化活疫苗粒径；
图2为雾化疫苗定量收集装置结构示意图；图3为软垫法测气溶胶粒径模式图；图4为软垫法检测猪支原体肺炎雾化活疫苗粒径。
具体实施例方式下面结合附图与具体实施例对本发明的技术方案作进ー步详细地说明。实施例I
取猪肺炎支原体弱毒株(168株)冻干菌种I瓶(2ml装/瓶)，用2ml含0. I %聚こ烯基吡咯烷酮(PVP)的去离子水溶液(pH值6. 8)溶解成猪支原体肺炎活疫苗溶液，将该疫苗溶液加入到医用下呼吸道沉积型喷雾器(德国百瑞)中，将喷雾器连接空气压缩泵，调节压カ为0. 2MPa后进行喷雾，制备成猪支原体肺炎雾化活疫苗。将喷雾器喷嘴通入ー密闭的气雾柜，另外将TSI3321型气溶胶粒径分析仪的进样ロ通过管道与气雾柜相连。雾化疫苗发生5分钟后，打开TSI3321型气溶胶粒径分析仪的电源，测得气溶胶疫苗总粒子空气学动力中位直径为4.8i!m，如图I所示。參照图2，将连接气源的喷雾器喷嘴通入一密闭的无菌雾化箱，在无菌雾化箱的另ー侧顺序连接螺旋形玻璃气液转换器、液相疫苗收集管、可调式负压抽气系统。通过可调式负压抽气系统产生的负压，将无菌雾化箱中的雾化疫苗抽入气液转换器，并在其中凝聚液化，液态疫苗随着负压流入液相疫苗收集管，通过CXU法检测雾化疫苗的滴度为lX107_°(XU/ml，较喷雾前下降0. 5个滴度(表I)。表I. CXU法检测含0. I % PVP的猪支原体肺炎雾化活疫苗滴度
、擔钼_ _各稀释享变色天数Si
_ IO-1] IO-2 Fio-3 ijo-4 Ijo-5T io.6 [10-71 jo-8110-9] 10-10 _ (ccu/mi)
4d 6d8d9dlidlid14d16d—一
喷雾前 4d 6d8d9dlid12d14d———
4d 6d7d9dlidlid14d15d—— X
4d 6d8d9dlidlid14d—一一
4d 6d8d9dlidlid13d—一一
5d 7d 8d IOd 12d 13d 15d — — — , in7n
喷雾后----------IxlO70
4d 6d 8d 9d lid lid 14d ———
_ 4d 6d 8d IOd lid 13d 14d —— —实施例2取猪肺炎支原体弱毒株(168株)冻干菌种10瓶(2ml装/瓶)，用2000ml含0. 5%0丙ニ醇嵌段聚醚(F68)的去离子水溶液(pH值7. 2)溶解成猪支原体肺炎活疫苗溶液，将该疫苗溶液加入到电动喷雾器(1035BP，美国哈逊)中进行喷雾，流量设为300g/min，制备成猪支原体肺炎雾化活疫苗。将喷雾器喷嘴通入ー密闭的气雾柜，另外将TSI3321型气溶胶粒径分析仪的进样ロ通过管道与气雾柜相连。雾化疫苗发生5秒钟后，打开TSI3321型气溶胶粒径分析仪的电源，检测气溶胶疫苗总粒子空气学动力直径。再将自制的雾化疫苗定量收集装置连接气雾柜收集疫苗气溶胶，然后通过CCU法检测雾化疫苗的滴度为lxl04 75CCU/ml，较喷雾前下降0. 75滴度(表2)。表2. CXU法检测含0. 5%o F68的猪支原体肺炎雾化活疫苗滴度
权利要求
1.一种猪支原体肺炎雾化活疫苗，其特征在于，包含有以下组分疫苗菌株、疫苗稀释液，所述疫苗菌株为猪肺炎支原体弱毒株(168株)的冻干菌种或新鲜培养的菌液；所述疫苗稀释液为PH值6. 8-7. 5，且终浓度为含5-10%甘油的去离子水溶液，或含0. 1_1%。丙二醇嵌段聚醚(F68)的去离子水溶液，或含0. I %聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的去离子水溶液，或者为上述保护剂的任意组合。
2.根据权利要求I所述的猪支原体肺炎雾化活疫苗，其特征在于，所述保护剂组合为终浓度为含5%甘油、0. I %聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的去离子水溶液。
3.—种权利要求I所述的猪支原体肺炎雾化活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)用疫苗稀释液溶解冻干的疫苗菌株，或稀释新鲜培养的菌液，配制成猪支原体肺炎活疫苗溶液，并使该疫苗溶液的PH值为6. 8-7. 5，其中所含甘油的终浓度为5-10%，或含丙二醇嵌段聚醚(F68)的终浓度为0. 1-1%。，或含聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的终浓度为0.I %，疫苗菌种或菌液与疫苗稀释液的配制比例为I : I I : 100; 2)将步骤I)所得的猪支原体肺炎活疫苗溶液通过吹气式雾化法或水力式雾化法制成雾化活疫苗。
4.根据权利要求3所述的猪支原体肺炎雾化活疫苗的制备方法，其特征在于，所述猪支原体肺炎雾化活疫苗粒径在1-10 U m之间，且保持一定的活性，雾化活疫苗的滴度相比活疫苗溶液的滴度应控制为降低I个滴度以内。
5.根据权利要求3所述的猪支原体肺炎雾化活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述的吹气式雾化法所用喷雾设备应为医用下呼吸道沉积型喷雾器，或喷雾粒度直径可控制在I-IOiim之间的电动喷雾器。
6.根据权利要求3所述的猪支原体肺炎雾化活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述的水力式雾化法所用的喷雾设备应为喷雾粒度直径可控制在1-10 之间的高压喷雾降温系统。
7.—种权利要求I所述猪支原体肺炎雾化活疫苗的检验方法，其特征在于，包括雾化疫苗气溶胶粒径检测和雾化疫苗活力检测所述的雾化疫苗气溶胶粒径检测方法为通过软垫法采集疫苗气溶胶后经显微镜对视野中每个颗粒进行粒径测量与分布统计，或者通过气溶胶粒径分析仪对疫苗气溶胶的粒径和粒度分布作检测，所述的雾化疫苗活力检测方法为通过雾化疫苗定量收集装置收集疫苗气溶胶，然后通过CCU法检测雾化疫苗的滴度。
全文摘要
本发明公开了一种猪支原体肺炎雾化活疫苗，包含有以下组分疫苗菌株、疫苗稀释液，所述疫苗菌株为猪肺炎支原体弱毒株(168株)的冻干菌种或新鲜培养的菌液；所述疫苗稀释液为pH值6.8-7.5，且终浓度为含5-10％甘油的去离子水溶液，或含0.1-1‰丙二醇嵌段聚醚(F68)的去离子水溶液，或含0.1％聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的去离子水溶液，或者为上述保护剂的任意组合，同时也公开了该疫苗的制备和检验方法，将猪支原体肺炎活疫苗制成雾化剂型，则不仅能提高疫苗接种的方便性，而且大大节省了劳动力和劳动时间，达到更好推广免疫该疫苗的目的。适用于药物制剂技术领域。
文档编号G01N15/02GK102764431SQ201210275639
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者冯志新, 刘茂军, 华利忠, 熊祺琰, 甘源, 邵国青 申请人:江苏省农业科学院