专利名称：一种基因c型鸭甲型肝炎病毒定性和定量检测方法
技术领域：
本发明涉及家禽传染病诊断，具体涉及基因C型鸭甲型肝炎病毒荧光定量RT-PCR方法技术领域。
背景技术：
近年来，由基因C型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-C)引起的鸭病毒性肝炎广泛流行于韩国和中国，该病毒主要侵害3周龄内雏鸭，发病急，病死率高，严重影响养鸭业的发展。DHAV-C引起的鸭病毒性肝炎与基因A型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-A)引起的鸭肝炎在流行病学、临床症状和病理变化等非常相似，只有借助实验室诊断才能鉴别，病毒分离鉴定是传染病病原学诊断的经典方法，但该方法至少需要I 2周才能确诊，费时费力，不能满临床实践中对传染病及早诊断、迅速采取有效措施进行防治的的需求。RT-PCR作为一种常规的分子生物学技术以其快速、灵敏、特异、操作简单等优点广泛用于人类和多种动物病毒病的诊断([l]Pritchard L I, Morrissy C, Van Phuc K, et al. Development of a polymerase chain reaction to detect Vietnamese isolates of duck virus enteritis. [J].Vet Microbiol, 1999,68 (1-2) 149-156. [2]Keramas G, Bang D D, Lund M, et al. Use ofculture,PCR analysis,and DNA microarrays for detection of Campylobacter jejuniand Campylobacter coli from chicken feces. [J]. J Clin Microbiol,2004,42 (9)3985-3991. [3]Lund M, Nordentoft S, Pedersen K，et al. Detection ofCampylobacter spp. in chicken fecal samples by real-time PCR. [J]. JClin Microbiol,2004,42(11) :5125-5132. [4]Identifcation of duck plague virus bypolymerase chain reaction. [J], 1999,43(1) :106_115·)。目前已有 RT-PCR 用于 DHAV-C鸭肝炎的诊断韩国学者 Kim 等(Kim MC, Kwon YK, Joh SJ, et al. Differential diagnosisbetween type-specifc duck hepatitis virus type I (DHV-I) and recent KoreanDHV-l-like isolates using a multiplex polymerase chain reaction. [J]. AvianPathology, 2008, 37 (2) : 171-177.)分别针对 DHAV-A 基因组的 DRL-62 基因和 DHAV-C 基因组的AP-04203基因设计了两对引物(API 5’ -GTTCCAAATGATGATTATTATG-3’ ；AP2 5，-GGATCTGATTAGTACCAGATAAG-3，； CPI : CCC AY(C 或 T)GTCTAAGTCTTAATGGAT-3，；CP2 :5’ -CTAAAGGTGTCTGTATCCAAGC-3’ )，建立了鉴别诊断 DHAV-A 和 DHAV-C 的双重 RT-PCR方法，具体操作步骤如下采集疑似鸭肝炎病毒感染鸭的肝脏，用Triol试剂提取总肝脏总RNA，用反转录试剂将肝脏总RNA反转录成cDNA作为模板，分别扩增DHAV-ADRL-62基因的897 1125位点229bp的特异片段和DHAV-CAP-04203基因的204 514位点311bp的特异片段，该方法对DHAV-C的最低检出量为IOOpg/反应。研究结果表明，该双重RT-PCR方法可用于DHAV-A和DHAV-C感染临床样本的鉴别诊断。宋永峰等(Levine P P J F. A hitherto-undescribed virus disease of ducks in NorthAmerica [J]. Cornell Vet, 1950 (40) :71-76.)根据 GenBank 中已发表的 DHAV-C 全基因序列(DQ256134、DQ25613)，在非同源区域设计一对引物 Pl :5’ -CTGAGAAGCGGGATATTAGT-3’ ；P2 :5’ -AATCAACCTAGACGGGGAAT-3’)，从其临床分离鉴定的DHAV-C样本中提取总RNA，以反转录得到的cDNA为模板，PCR扩增DHAV-C638bp的基因片段。该学者建立的RT-PCR方法能特异地检出DHAV-C，此方法对DHAV-C的最低检出量为21pg/反应。何冉婭等(Haider SA,Calnek Bff. In vitro isolation,propagation,and characterization of duck hepatitisvirus type III. [J]. Avian Dis，1979，23 (3) :715-729.)根据GenBank 中已发表的DHAV-C全基因组序列(DQ256134、DQ25613)，应用Primer Primier 5. O设计一对特异性引物(Pl 5’ -TGTGCCTGAGAAGCGGGATA-3’;P2 :5’ -CCGAAAGTGGAGATTAGGTG-3’)，从广东省采集到的鸭病毒性肝炎病毒感染鸭的肝脏病料中采用Trizol试剂进行总RNA的提取，并将提取到的RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板扩增DHAV_C705bp的基因片段。该学者建立的RT-PCR方法能特异地检出DHAV-C，并且此方法对DHAV-C的最低检出量为2X103pg/反应。另夕卜，本发明申请的发明人(黄秋雪，汤承，聂培婷等.鸭甲型肝炎 病毒基因A型和C型双重RT-PCR检测方法的建立[J],中国预防兽医学报，2012，34(2) =120-123.)根据GenBank中公布的DHAV-A和DHAV-C全基因组序列，应用Primer Premier5. O软件，针对DHAV-A的3C、3D 和 DHAV-C 的 2C 区域分别设计了 2 对引物(DHAV-A Pl :5’ -GCAATGGCACTATGGGAGC-3’，DHAV-AP2 :5’ -GAGGAGGCTGAAACA-3’ ；DHAV-C Pl :5’ -TCCAACAGGGTCAAAGC-3’，DHAV-C P2 5’ -AACTACTACAAGTCTGCCACG-3’)，扩增 DHAV-A (259bp)和 DHAV-C (194bp)的特异性片段，从四川省采集到的鸭病毒性肝炎病毒感染鸭的肝脏病料中提取总RNA，并以反转录得到的cDNA为模板，建立检测DHAV-A和DHAV-C的双重RT-PCR方法。该方法可用于临床样本的检测，最低检测限达到3.4X10_3pg/反应。RT-PCR用于病毒病的诊断虽然具有灵敏度高、快速、特异的特点，但是存在无法对检测样品进行准确定量、检测通量不高，且存在电泳等PCR后处理过程，易造成污染而出现假阳性等缺陷，限制了该方法的应用。荧光定量PCR(Real-Time RT-PCR, RRT-PCR)方法通过在反应体系中引入荧光信号，实现了荧光信号和PCR双放大，不仅大大提高了检测的灵敏度，而且不需要电泳等PCR后处理过程，在反应管中一次操作即可完成对数十至数百个样本的定性和定量，易于标准化，有效克服了 PCR方法的不足。在传染病诊断中广泛应用(Mackay I MjArden K E, Nitsche A. Real-time PCRin virology. [J]. Nucleic Acids Res,2002，30(6) : 1292-1305 和 Heid C A, Stevens J,Livak K J,et al. Real time quantitative PCR. [J]. Genome Res,1996,6(10) :986-994.)目前国内外尚未见检测DHAV-C的荧光定量PCR方法报道。
发明内容
鉴于现有技术的以上不足，本发明的目的是设计一种基因C型鸭甲型肝炎病毒荧光定量PT-PCR方法，使之能克服现有技术的缺点，使之能够有更高的灵敏度以降低漏诊率，并能实现对病毒的定量检测。本发明的目的是通过如下的手段实现的。一种DHAV-C定性和定量检测方法，采用一对特异性引物，包括上游引物DHAV-CFP (SEQ ID No I)、下游引物 DHAV-C RP (SEQ ID No2);以 cDNA 为模板，进行荧光定量 RT-PCR，扩增DHAV-C 194bp的特异片段，所述检测的最佳反应体系为20 μ L，包括SYBR Green Imaster mix 10 μ L ;上下游引物各0. 4 μ L ;cDNA模板2 μ L,补充去离子水至20 μ L ;采用的反应条件为95°C预变性3min ;95°C变性15s ;60°C退火31s，进行30个以内循环，得到Ct值，即可用于DHAV-C感染的定性；由预先建立的的荧光定量RT-PCR反应的标准方程获得所检测病毒的荷载量。采用本发明的方法，建立的荧光定量RT-PCR对DHAV-C的核酸最低检测限可达到
3.4X KT4Pg/反应，灵敏度更高，比Kim、宋永峰、何冉婭三位学者建立的RT-PCR对DHAV-C的检测的灵敏度分别高了 2. 9 X IO5倍、6. 2 X IO4倍、5. 9 X IO6倍，比本发明人先前建立检测DHAV-A和DHAV-C的双重RT-PCR方法的灵敏度也提高了一个数量级，这保证了本发明方法可直接用于临床样本检测，DHAV-C感染进行定性和定量，与现有方法相比，检出率高，可大大降低漏诊率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。I、主要试剂普通PCR试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、pMD 19-T Vector、Amp、IPTG、X-Gal均购自宝生物工程(大连)公司；蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉均购自Oxoid公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天根生物有限公司；Trizol RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司；反转录试剂盒购自上海博瑞克公司；其它试剂均为国产分析纯。主要仪器隔水式恒温培养箱齐欣公司，中国上海高速离心机centrifuge5804, Eppendorf 公司，德国超纯水仪Milli-Q :Mi I Iipore公司，法国核酸蛋白检测仪DU800, Beckman公司，美国凝胶成像系统Doc2000，Bio-Rad公司，美国恒温水浴器国华电器，中国江苏核酸电泳仪PowerpacuniversalTM, Bio-Rad 公司，美国；PCR 仪my cyclerTM, Bio-Rad 公司，美国梯度PCR仪=Bio-Rad公司，美国荧光定量PCR仪7300型，ABI公司，美国移液器Eppendorf公司，德国2、引物设计和制取根据20株GenBank登录的DHAV-C 2C基因序列，米用Primer Premier 5. O软件，采用NCBI网站BLAST工具对设计的引物进行检索，初步验证其特异性。引物序列见下表I。引物由上海生工生物工程公司合成。表I引物信息引物名称引物序列扩增位点预期扩增片段火小
PrimersSequence (5r -3J )Amplified lociSize of fragment / bp
上游引物(DHAV-CFP)TCCAACAGGGTCAAAGC.1639 4832194
下游引物(DHAV-C RP)AACTACTACAAGTCTGCCACG
3、荧光定量PCR方法标准曲线的建立将已知浓度的标准阳性质粒经过10倍梯度稀释，采用优化好的反应条件和反应体系进行荧光定量PCR反应。以病毒拷贝数的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，建立标准曲线。从标准曲线可见，本发明建立的实时荧光定量RT-PCR在1.68X 104 1.68X 109拷贝/ μ L内有良好的线性关系，其相关系数为O. 998，标准方程为Υ=-3. 348Χ+26. 310，扩增效率为97. 9%0实施例I、取16份病死鸭肝脏样本按I : 3加入灭菌的生理盐水后匀浆，反复冻融3次，IOOOOrpm离心15min取上清液，加2000单位/mL双抗后经尿囊腔接种10日龄SPF鸭胚，各接种3枚，O. 2mL/枚；空白对照组3枚，注射灭菌生理盐水，O. 2mL/枚。37°C孵育，收获死亡鸭胚胚体和尿囊液。根据Invitrogen公司的Trizol说明书提取总RNA, RNA按照反转录试剂盒(日本TAKARA公司)说明书反转录合成cDNA。反应总体系为10 μ L 5 X PrimescriptTMBuffer 2. O μ L, PrimescriptTM RT Enzyme Mix I 0. 5 μ L, Random 6 mers I. 0 μ L, RNA
2.0 μ L，Rnase Free H2O 4. 5 μ L。混匀后放入PCR仪中进行反转录反应，反应条件为37°C15min，85°C 5s，4°C 5min。以反转录得到的cDNA为模板，通过普通PCR反应鉴定这16份病死鸭肝脏样本为DHAV-C阳性。以反转录得到的cDNA为模板，使用Applied Biosystems公司荧光定量PCR仪7300型进行荧光定量PCR检测。反应体系为20 μ L :SYBR Green Imaster mix 10 μ L ;取上述已制备的上下游引物各0. 4 μ L ;DNA模板2 μ L,补充去离子水至20 μ L0反应条件为:95°C预变性3min ;95°C变性15s ;60°C退火31s，共进行30个循环。实验结果显示，建立的荧光定量PCR方法对已鉴定(病毒分离、普通PCR鉴定)为DHAV-C阳性的16份肝脏临床样本的检出率为100% (16/16)。实施例2采用建立的检测DHAV-C的荧光定量PCR方法，对收集的38份临床样本进行检测。结果显示，有22份临床样本为DHAV-C阳性。其中I 5号临床样本检测的Ct值分别是
3.43,4. 07,9. 00,4. 37,9. 97，代入标准方程 Υ=_3· 348Χ+26. 310，求得 X 的值，再算出 IOx,即可得出对DHAV-C的定量结果，依次为6. 8 X IO6拷贝/反应、4. 4X IO6拷贝/反应、I. 5 X IO5拷贝/反应、3. 6 X IO6拷贝/反应和7. 6 X IO4拷贝/反应。实施例3将42只3日龄SPF雏鸭，饲养于SPF家禽隔离器内，颈部皮下注射DHAV-C，O. 2mL/只，于感染后24h、48h及72h各取3只，颈动脉放血处死，取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、胰、肠、脑等组织器官，按照Trizol RNA试剂盒提说明书步骤提组织样本总RNA，并按照反转录试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA。以cDNA为模板，用本发明方法与本发明人先前建立检测DHAV-A和DHAV-C的双重RT-PCR方法同时进行检测，结果见表2
表2 :荧光定量RT-PCR和RT-PCR对DHAV-C的检出情况(N = 3)
感染时 ZTTTT *~Sr~inSi~
枪 則万法fc Ik
间(h)脏脏脏 脏脏 囊腺 腺…
~M 本发明方法 3 3 3 3 3 3 3 I 3
Γ 现有方法00000O0000
48 本发明方法3 3 3 3 333 3 3 3 现有方法00000I0002 72 本发明方法3333333 3 3 3 _现有方法0 2 10 0O0 0 0 0由表2可看到，本发明方法对DHAV-C阳性样本的检出率为100% (90/90)，现有技术的最好条件只能达到检出率为6. 7% ￠/90)。本发明方法具有更为良好的检测灵敏度。
权利要求
1.一种基因C型鸭甲型肝炎病毒定性和定量检测方法，采用一对特异性引物，包括上游引物DHAV-C FP、下游引物DHAV-C RP ；以cDNA为模板，扩增194bp的目的片段，进行荧光定量PCR检测，所述检测的最佳反应体系为20 μ L，包括SYBR Green I master mix10 μ L ;上下游引物各0. 4μ L ;DNA模板2 μ L，补充去离子水至20 μ L ;反应条件为95 °C预变性3min ;95°C变性15s ;60°C退火31s，进行30个循环，得到Ct值，即可实现对被检测样本的定性检测；由预先测定的荧光定量标准曲线方程可获得所检测基因C型鸭甲型肝炎病毒拷贝数，实现对被检样本进行定量。
2.根据权利要求I所述一种基因C型鸭甲型肝炎病毒定性和定量检测方法，其特征在于所述上游引物DHAV-C FP序列为TCCAACAGGGTCAAAGC，所述下游引物DHAV-C RP序列为AACTACTACAAGTCTGCCACG，扩增位于 DHAV-C 2C 基因 4639 4832 位点的片段。
3.根据权利要求I所述之一种基因C型鸭甲型肝炎病毒定性和定量检测方法，其特征在于，所述荧光定量标准曲线方程为Y=-3. 348Χ+26. 310，X为所测病毒拷贝数，Y为Ct值。
全文摘要
本发明公开了一种基因C型鸭甲型肝炎病毒定性和定量检测方法，采用一对特异性引物，包括上游引物DHAV-C FP、下游引物DHAV-C RP；以cDNA为模板，以优化的反应体系和条件进行PCR，扩增位于DHAV-C2C基因4639～4832位点的194bpDHAV-C特异片段，在所述检测的最佳反应体系和反应条件测得Ct值，即可实现对DHAV-C的定性；再由预先建立的荧光定量RT-PCR标准曲线获得所求病毒浓度。本发明可用于DHAV-C感染的快速诊断，并能对被检样本病毒荷载量进行准确定量，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、高通量和易于标准化的优点。
文档编号G01N21/64GK102827951SQ20121030244
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者汤承, 岳华, 黄秋雪 申请人:西南民族大学