专利名称：一种mtt法检测木霉菌活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种木霉菌活性的检测方法，具体的是通过MTT比色法，检测木霉菌的厚垣孢子存活和生长的一种方法。
背景技术：
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)，甲瓒沉积在细胞中，而死细胞无此功能。用有机溶剂溶解细胞中的甲瓒，用分光光度计在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、 细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。而如今大规模应用的MTT法检测活细胞的方法多是动物细胞、细菌等活性检测，应用于真菌厚垣孢子活性检测的很少，而木霉菌属于真菌。目前，木霉菌厚垣孢子的活性检测一般采用传统的涂平板法，但是检测时间比较长，并且检测过程要防止杂菌污染，工作量大。
发明内容
本发明目的在于提供一种MTT法检测木霉菌活性的方法，以解决现有技术中的木霉菌厚垣孢子的活性检测一般采用传统的涂平板法，检测时间比较长，并且检测过程要防止杂菌污染，工作量大的技术性问题。本发明目的通过以下技术方案实现
一种MTT法检测木霉菌活性的方法，包括以下步骤
(1)、制备木霉菌发酵液，所述木霉菌发酵液中厚垣孢子浓度为IO7-IO8CFU/mL ；
(2)、取上述木霉菌发酵液200-400uL，再加入MTT水溶液400-600 uL，于40°C水浴3 h，之后加入500 uL lmol/L浓盐酸终止反应；取上清与异丙醇或者异丁醇混合，静止15min, 12000 r/min离心3 min,取上清用分光光度计在570 nm处读取OD值,此时,木霉菌的萌发率为100% ；
(3 )、将步骤(I)的木霉菌发酵液配制成原浓度的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的溶液；按照步骤(2)的过程测量各种浓度的溶液的OD值，根据步骤(2)与步骤(3)的测量值制作木霉菌萌发率与OD值的标准曲线；
(4)、将待测的木霉菌制剂溶解形成溶液，使溶液中木霉菌的厚垣孢子浓度为IO7-IO8CFU/mL，按照步骤(2)的过程测量溶液的OD值，将OD值与步骤(3)的标准曲线对照，即可得知待测的木霉菌制剂中木霉菌的萌发率。优选地，所述步骤(I)中的制备木霉菌发酵液步骤进一步包括将木霉菌菌株接种在PDA培养基上，培养3-4 d后，用打孔器从菌落边缘打取菌片3 5个，接种到H)液体培养基中，于27-29°C、130-150 r / min摇床条件下培养5_6 d，得到木霉菌发酵液。
优选地，所述MTT水溶液的浓度为Img /mL。优选地，所述步骤(4)中，溶解待测的木霉菌制剂的溶剂采用纯净水或无菌种活力的木霉菌发酵液。与现有技术相比，本发明有以下优点
1、本发明克服了传统的木霉菌厚垣孢子的活性检测一般采用传统的涂平板法，耗时长、易受杂菌污染、工作量大等不足，为木霉菌生防制剂的厚垣孢子活性快速检测提供了可能，提高了检测效率，降低了人们的工作量；
2、通过本发明的检测方法可以实现木霉菌生防制剂快速检测的目的； 3、本发明的检测方法还可用于木霉菌生防制剂货架期长短的检测，为确定货架期长短提供了可靠的检测方法。
图I为木霉菌萌发率与OD值的标准曲线示意图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例I
制备木霉菌发酵液将木霉菌菌株接种在PDA培养基上，培养3-4 d后，用打孔器从菌落边缘打取菌片3 5个，接种到H)液体培养基中，于27-29°C、130-150 r / min摇床条件下培养5-6 d，得到木霉菌发酵液，木霉菌发酵液中厚垣孢子浓度为IO7-IO8 CFU/mL。取上述木霉菌发酵液200-400 uL，再加入MTT水溶液400-600 uL，于40°C水浴3 h，之后加入500 uL lmol/L浓盐酸终止反应；取上清与异丙醇或者异丁醇混合，静止15min, 12000 r/min离心3 min,取上清用分光光度计在570 nm处读取OD值,此时,木霉菌的萌发率为100%。取上述IOOmL发酵液，于121°C,灭菌15min，得到无菌种活力的发酵液，使用该无菌种活力的发酵液将上述木霉菌发酵液配制成原浓度的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的溶液；按照上述过程测量各种浓度的溶液的OD值，根据测量值制作木霉菌萌发率与OD值的标准曲线，如图I所示。将待测的木霉囷制剂溶解于无囷种活力的发酵液中形成溶液，使溶液中木霉囷的厚垣孢子浓度为IO7-IO8 CFU/mL，测量溶液的OD值，将OD值与上述的标准曲线对照，即可得知待测的木霉菌制剂中木霉菌的萌发率。本发明克服了传统的CFU检测方法(涂平板法)中耗时长、易受杂菌污染、工作量大等不足，为木霉菌生防制剂的厚垣孢子活性快速检测提供了可能，提高了检测效率，降低了人们的工作量。通过本发明的检测方法可以实现木霉菌生防制剂快速检测的目的。本发明的检测方法还可用于木霉菌生防制剂货架期长短的检测，为确定货架期长短提供了可靠的检测方法。以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应 落在本申请的保护范围内 。
权利要求
1.一种MTT法检测木霉菌活性的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)、制备木霉菌发酵液，所述木霉菌发酵液中厚垣孢子浓度为IO7-IO8CFU/mL ； (2)、取上述木霉菌发酵液200-400uL，再加入MTT水溶液400-600 uL，于40°C水浴3 h，之后加入500 uL lmol/L浓盐酸终止反应；取上清与异丙醇或者异丁醇混合，静止15min, 12000 r/min离心3 min,取上清用分光光度计在570 nm处读取OD值,此时,木霉菌的萌发率为100% ； (3 )、将步骤(I)的木霉菌发酵液配制成原浓度的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的溶液；按照步骤 (2)的过程测量各种浓度的溶液的OD值，根据步骤(2)与步骤(3)的测量值制作木霉菌萌发率与OD值的标准曲线； (4)、将待测的木霉菌制剂溶解形成溶液，使溶液中木霉菌的厚垣孢子浓度为IO7-IO8CFU/mL，按照步骤(2)的过程测量溶液的OD值，将OD值与步骤(3)的标准曲线对照，即可得知待测的木霉菌制剂中木霉菌的萌发率。
2.如权利要求I所述的一种MTT法检测木霉菌活性的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的制备木霉菌发酵液步骤进一步包括将木霉菌菌株接种在PDA培养基上，培养3-4 d后，用打孔器从菌落边缘打取菌片3 5个，接种到H)液体培养基中，于27-29°C、130-150r / min摇床条件下培养5-6 d,得到木霉菌发酵液。
3.如权利要求I所述的一种MTT法检测木霉菌活性的方法，其特征在于，所述MTT水溶液的浓度为Img /mL。
4.如权利要求I所述的一种MTT法检测木霉菌活性的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，溶解待测的木霉菌制剂的溶剂采用纯净水或无菌种活力的木霉菌发酵液。
全文摘要
本发明提供一种MTT法检测木霉菌活性的方法，包括以下步骤(1)制备木霉菌发酵液，所述木霉菌发酵液中厚垣孢子浓度为107-108CFU/mL；(2)测出木霉菌发酵液在570nm处读取OD值，此时，木霉菌的萌发率为100%；(3)配制不同浓度的木霉菌发酵液并测出OD值，根据测量值制作木霉菌萌发率与OD值的标准曲线；(4)测出待测的木霉菌制剂的OD值，将OD值与标准曲线对照，即可得知待测的木霉菌制剂中木霉菌的萌发率。与现有技术相比，本发明克服了传统的木霉菌厚垣孢子的活性检测一般采用传统的涂平板法，耗时长、易受杂菌污染、工作量大等不足，为木霉菌生防制剂的厚垣孢子活性快速检测提供了可能，提高了检测效率，降低了人们的工作量。
文档编号G01N21/31GK102830075SQ20121031450
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者陈捷, 林振亚, 余嘉, 余传金, 范莉莉, 李雅乾, 吴琼, 孙瑞艳 申请人:上海交通大学