专利名称：叶黄素二琥珀酸酯的液质联用检测方法
技术领域：
本发明涉及一种叶黄素二琥珀酸酯的液质联用测定方法，可用于监测叶黄素和琥珀酸合成反应进程及检测反应产物。
背景技术：
叶黄素(lutein)是一种含羟基的类胡萝卜素，具有抗氧化作用，能预防老年性黄斑退化，延缓早期动脉硬化进程。Phyllis E. Bowen等在健康被试者的饮食中分别加入相同剂量的叶黄素酯和叶黄素，以血浆中叶黄素的浓度X时间(AUC)为衡量生物利用度的指标，结果表明叶黄素酯的AUC比叶黄素大61.6%。琥珀酸是一种内源性神经活性调节物质，具有抗惊厥、抗癫痫、镇静、降温、镇痛等作用。琥珀酸是三羧酸循环的中间代谢物，位于三羧酸循环及脑内特有的谷氨酸-Y -氨基丁酸-琥珀酸代谢旁路的枢纽地位，不仅参与能量代谢，也影响兴奋性谷氨酸和抑制性Y-氨基丁酸神经递质平衡。将叶黄素与琥珀酸酐酯化合成叶黄素二琥珀酸酯可以提高叶黄素的生物利用率，同时满足人们对于琥珀酸的需求。液质联用(HPLC-MS)技术是以高效液相色谱色谱为分离手段，以质谱为鉴定工具的一种分离分析技术，具有液相色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度、极强的定性专属特异性。尚未见HPLC-MS用于叶黄素二琥珀酸酯的定性定量分析的报道。因此，建立高效的叶黄素二琥珀酸酯定性及定量分析方法用于监测叶黄素二琥珀酸酯的合成反应及其进·一步应用具有重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、准确的叶黄素二琥珀酸酯的液质联用测定方法，该项技术不仅可以对合成的叶黄素二琥珀酸酯进行准确的定性分析，还可以进行定量分析。本发明包括下列步骤I、叶黄素二琥珀酸酯的HPLC (分析型)检测取20 μ L合成的叶黄素琥珀酸酯样液进行HPLC检测，HPLC条件为色谱柱YMCCarotenoid C30 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m),流动相O. 05%乙酸甲醇溶液与O. 05%乙酸乙臆溶液的体积比为50 50，时间30min，流速I. OmL/min，DAD检测器，柱温25°C，进样量20 μ L，检测波长450nm。2、叶黄素二琥珀酸酯的质谱检测采用大气压化学电离源，正离子扫描模式，色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10μ L/min，扫描范围m/Z50_1200，气化温度350°C，毛细管电压4500V，干燥气体流速4L/min,雾化器压力2Opsi。3、建立叶黄素二琥珀酸酯标准曲线准确称取5mg叶黄素二琥珀酸酯标准品，用乙腈溶解并定容至10mL，混匀，制成浓度为500μ g/mL的标准液。再分别取O. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5mL标准液置于5mL容量瓶中，用乙腈定容并混匀，制成浓度为10、20、30、40、50μ g/mL的系列标准液，按照上述的C30-HPLC色谱条件测定，以进样量为横坐标，相应的吸收峰面积为纵坐标，进行线性回归分析。有益效果I、本发明采用C3tl-HPLC将合成的叶黄素琥珀酸酯与叶黄素分离，在流动相中加入少量的乙酸，一方面可以改善色谱峰型，另一方面保持叶黄素琥珀酸酯的质子化，保证质谱的响应信号。反应0h，采用C3tl-HPLC测定反应样液，在21. 916min得到一个色谱峰，如图IA所示;当反应6h，测得的色谱图如图IB所示，分别在17. 289min、19. 166min、21. 320min得到三个峰，峰3的保留时间(21. 320min)与图IA中叶黄素的保留时间(21.916) 一致，所以峰3为叶黄素。将图IB与图IC(反应12h后样液的色谱图)比较，结合光谱和极性分析，初步判断峰I为叶黄素二琥珀酸酯，峰2为叶黄素单琥珀酸酯。2、本发明对反应了 6h的样品进行了正离子模式的LC-APCI-MS分析，以此确定图IB中各个峰的归属。LC-APCI-MS检测结果如图2至图4所示，对响应较强的三个峰进行了·质谱分析，它们均具有叶黄素和叶黄素酯的特征吸收，分析结果见表1，由此确定峰I为叶黄素二琥珀酸酯，峰2为叶黄素单琥珀酸酯，峰3为叶黄素。表I叶黄素及其琥珀酸酯的LC-APCI-MS分析结果
峰数_特征离+片段_
706.6, 651.1 [M+H-118],559.1 [M+H-118-92],
1
533.1 [M+H-118+H-118-H],409.3, 348.9，282.1667.1[M-H], 651.1[M+H-18]’
2
551.2[M+H-118], 533.2[Μ+Η-18+Η-118]
3 567.2[Μ-Η1, 551.2[Μ+Η-18], 533.2[Μ+Η-18+Η-118], 459.1 [Μ+Η-18-92], 391.13、本发明检测方法具有简便经济、准确性、灵敏度高，重现性好等特点。通过叶黄素二琥珀酸酯拟合标准曲线，得到回归方程为Y = 8. 596X-122(R2 = O. 9996)，表明叶黄素二琥珀酸酯含量在200 IOOOng范围内峰面积和进样量呈良好的线形关系。在信噪比为3的条件下，使用二极管阵列检测器的绝对检出量为120ng，最低检出限为6μ g/mL。供试样品溶液按照上述色谱条件重复进样6次，叶黄素二琥珀酸酯峰面积RSD为4. 7%，小于5%，说明本方法具有较好的精密度。稳定性试验结果叶黄素二琥珀酸酯峰面积RSD值为2. 5%,小于5%,表明本方法具有较好的稳定性。样液的加标回收率分别为100%、99. 1%>99. 0%，在95% 100%之间，且RSD分别为I. 2%Λ. 3%,2. 1%，都小于5%，表明本法具有良好的回收率。4、本发明能够快速、准确地对合成的叶黄素二琥珀酸酯进行定性、定量分析，可较好地用于监测叶黄素和琥珀酸合成反应进程及检测反应产物。
四
图I反应0h(A)、6h⑶、12h(C)后，反应样液色谱2叶黄素二琥珀酸酯质谱图
图3叶黄素单琥珀酸酯质谱4叶黄素质谱5叶黄素二琥珀酸酯标准曲线
五具体实施例方式下面的实施例可以更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例I、实验仪器与试剂I)实验仪器 Agilent 1290 Infinity 册^>64601^联用仪、六8116扯 1200 HPLC色谱仪(美国Agilent公司)、YMC-C3O柱(日本YMC公司)AKTA Purifier with Frac-9OO (瑞典 Amersham 有限公司)85-2A型双数显恒温磁力搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)DlO氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器有限公司)GF254硅胶板(青岛海洋化工厂)2)实验试剂叶黄素标准品(> 96· 9%,美国Chromadex公司)色谱纯甲醇、乙腈、二氯甲烷(美国天地公司)分析纯二氯甲烷、乙腈、正己烷、丙酮、N, N-二异丙基乙胺(国药集团化学试剂有限公司)分析纯琥珀酸酐(成都科龙化学试剂有限公司)2、实验设计在本实施例中，采用合成的叶黄素二琥珀酸酯采用Agilent 1200 HPLC(分析型)对叶黄素二琥珀酸酯进行定性定量分析；采用Agilent 1290 Infinity HPLC-6460MS联用仪对叶黄素二琥珀酸酯定性分析；采用AKTAPurifier with Frac-900纯化合成的叶黄素二琥拍酸酯；建立叶黄素二琥珀酸酯的标准曲线，并进行检测方法的重复性、稳定性以及回收率试验。3、实验方法I)叶黄素二琥珀酸酯的合成准确称取Ig叶黄素和O. 88g琥珀酸酐，置于IOOmL三口烧瓶中，加入16mL色谱纯二氯甲烷，然后加入3. ImLN, N-二异丙基乙胺，充入氮气，磁力搅拌，常温避光反应6h。反应原液用40mL的二氯甲烷稀释，接着用5%的盐酸水溶液萃取，收集有机相，并用无水硫酸钠除去残存的水分，真空旋干，用乙腈复溶并定容至25mL。2)叶黄素二琥珀酸酯的HPLC分析HPLC 检测条件为色谱柱 YMC Carotenoid C30 (4. 6_X 250mm, 5 μ m),流动相O. 05%乙酸甲醇溶液与O. 05%乙酸乙腈溶液的体积比为50 50，时间30min，流速I. OmL/min, DAD检测器，柱温25°C，进样量20 μ L，检测波长450nm。叶黄素和琥珀酸酐反应0h、6h、12h后的样液经HPLC检测后色谱图见图I。通过与叶黄素标样比较，结合保留时间和光谱分析，初步判断峰I为叶黄素二琥珀酸酯，峰2为叶黄素单琥珀酸酯，峰3为叶黄素。3)叶黄素二琥珀酸酯的质谱检测质谱采用大气压化学电离源，正离子扫描模式，色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10 μ L/min，扫描范围m/z50_1200，气化温度350°C，毛细管电压4500V，干燥气体流速4L/min，雾化器压力为20psi。图2、3、4分别为叶黄素二琥珀酸酯、叶黄素单琥珀酸酯和叶黄素的质谱图。图 2 中 651. 1[M+H-118]，559. I [M+H-118-92], 533. I [M+H-118+Η-118-H]为叶黄素二琥珀酸酯的特征离子；图3中667. 1[M-H]，651. I [Μ+Η-18]，551. 2 [Μ+Η-118]，533. 2[Μ+Η-18+Η-118]为叶黄素单琥珀酸酯的特征离子；图4中567. 2[Μ_Η]，551. 2[M+H-18]，533. 2[M+H-18+H-118]，459. I [Μ+Η-18-92]为叶黄素的特征离子，因此判定这三种物质分别为叶黄素二琥珀酸酯、叶黄素单琥珀酸酯和叶黄素。4)叶黄素二琥珀酸酯的纯化
将步骤I)制得的样液过O. 45 μ m滤膜,用AKTA Purifier高效液相色谱仪(制备型)进行纯化，除了进样量为IOOyL,其他色谱条件与3)相同。5)标准曲线的建立准确称取5mg叶黄素二琥珀酸酯标准品，用乙腈溶解并定容至10mL，混匀，制成浓度为500 μ g/mL的标准液。再分别取O. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5mL标准液置于5mL容量瓶中，用乙腈定容并混匀，制成浓度为10、20、30、40、50 μ g/mL的系列标准液。按照上述的C30-HPLC色谱条件测定，以进样量为横坐标，相应的吸收峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，得标准曲线回归方程为Y = 8. 596X-122 (R2 = O. 9996)(见图5)，表明反式叶黄素含量在200 IOOOng范围内峰面积和进样量呈良好的线形关系。在信噪比为3的条件下，使用二极管阵列检测器的绝对检出量为120ng,最低检出限为6 μ g/mL。6)方法的精密度、重复性、和加样回收率试验精密度试验取步骤I)合成的叶黄素二琥珀酸酯，按样品测定方法进行测定，重复进样6次，得到叶黄素二琥珀酸酯的峰面积，实验结果显示6次测定叶黄素二琥珀酸酯峰面积的RSD为4. 7%，小于5%，说明本方法具有较好的精密度。稳定性试验取步骤I)合成的叶黄素二琥珀酸酯在_18°C冰箱放置8h，每隔2h测定一次试样中叶黄素二琥珀酸酯含量。测得峰面积的RSD为2. 5%，小于5%，表明叶黄素二琥珀酸酯在-18°C下含量相对稳定，本方法具有较好的稳定性。回收率试验精密称取叶黄素二琥珀酸酯标准品适量，用乙腈制成浓度分别为20 μ g/mL,30 μ g/mL,40 μ g/mL的溶液。精密量取3份5mL已知含量的叶黄素二琥珀酸酯样品于IOmL容量瓶中，每份分别加入I. 5mL40 μ g/mL标准品溶液、2. 5mL30 μ g/mL标准品溶液、3. 5mL20y g/mL标准品溶液，加乙腈稀释至刻度，按照样品测定方法进行测定，计算回收率。结果3种浓度的回收率(η = 3)分别为100%、99. I %、99. O %，在95 % 100%之间，且RSD分别为I. 2 %、I. 3 %、2. I %，都小于5 %，表明本法具有良好的回收率，测定结果准确、可靠。
权利要求
1.叶黄素二琥珀酸酯的HPLC-MS检测方法，其特征在于HPLC条件为色谱柱YMCCarotenoid C30 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m),流动相O. 05 %乙酸甲醇溶液与O. 05 %乙酸乙臆溶液的体积比为50 50，时间30min，流速1.0mL/min，DAD检测器，检测波长450nm，柱温25°C，进样量20 μ L ;质谱条件为色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为IOy L/min，正离子质谱(APCI+/MS)，扫描范围m/z50-1200，气化温度350°C，毛细管电压4500V，干燥气体流速4L/min,雾化器压力为20psi。
2.叶黄素二琥珀酸酯的HPLC-MS检测方法，其特征在于在上述HPLC条件下，叶黄素与叶黄素琥珀酸酯得到显著分离，根据色谱、质谱和光谱信息，确定了叶黄素二琥珀酸酯、叶黄素单琥珀酸酯和叶黄素这三种物质。建立了叶黄素二琥珀酸酯标准曲线Y =.8.596X-122(R2 = O. 9996)，可用于叶黄素二琥珀酸酯的定量分析。实验结果表明该方法重现性好、回收率高。
全文摘要
本发明公开了一种准确、简单的叶黄素二琥珀酸酯液质联用检测方法。HPLC条件为采用YMC Carotenoid C30色谱柱，0.05％乙酸甲醇溶液与乙酸甲醇溶液与0.05％乙酸乙腈溶液的体积比为50∶50为流动相，时间30min，流速1.0mL/min，DAD检测器，检测波长450nm，柱温25℃，进样量20μL，该方法可以很好地将叶黄素与叶黄素二琥珀酸酯分离；质谱条件为正离子质谱(APCI+/MS)，色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10μL/min，扫描范围m/z50-1200，气化温度350℃，干燥气体流速4L/min。根据样品的保留时间、质谱和光谱信息进行叶黄素二琥珀酸酯的定性分析，根据峰面积进行定量分析。该方法具有快速有效、重现性好、回收率高等优点。
文档编号G01N30/88GK102901788SQ201210316920
公开日2013年1月30日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者李大婧, 徐爱琴, 刘春泉, 肖亚东, 庞慧丽 申请人:江苏省农业科学院