专利名称：一种检测烟草料液中4-甲基咪唑含量的方法
技术领域：
本发明属于烟草添加剂理化检验技术领域，具体涉及一种检测烟草料液中4-甲基咪唑含量的方法。
背景技术：
随著世界范围内对“吸烟与健康”的广泛关注和我国正式签署FCTC协议，目前，努力提高卷烟的吸食安全性已经为国内外烟草行业的共识，为了提高卷烟的吸食安全性，烟草科研人员进行了大量的理化检验技术基础研究。4-甲基咪唑(4-Methylimidazole)溶于水和乙醇,有腐蚀性,具有强烈的惊闕作用，能使动物产生超兴奋状态，长期摄入能导致动物长肿瘤，可能给人体带来致癌风险。在工业生产中,4-甲基咪唑(简称4-MI)是一种重要的有机中间体，主要用于合成大宗胃药西 咪替丁，也可用作环氧树脂固化剂和金属表面防护剂等。在日常生活中，人们可能由于食用普遍使用的焦糖色素饮料或酱油而摄入一定量的4-甲基咪唑。由于焦糖色素能使可乐饮料、调味品和食品变成棕褐色，而被广泛用于酱油、食醋、黄酒、啤酒以及部分烤制食品和饮料中，目前焦糖色素已经发展成为全球范围内用量最大的色素。直接用糖加工而成的焦糖色素不含有4-甲基咪唑；而当前国内外大部分厂家生产的焦糖色素普遍采用氨类化合物作为催化剂，由糖、氨水或铵盐及亚硝-酸盐在高压高温下生成，称之为氨法焦糖色素，在氨法焦糖色素生产过程中不可避免的会产生一定量的4-甲基咪唑，属于生产过程中的副产物。出于焦糖色素中4-甲基咪唑对人体潜在危害性的考虑，世界卫生组织及许多国家的研究人员曾经多次进行相关的动物毒理学实验研究，提出对于非氨法焦糖色素，可根据正常生产需要配比，在使用量上不受限制；对于氨法焦糖色素，每日允许摄入量(ADI)为200毫克/公斤体重,其中氨法焦糖色素中4-甲基咪唑的含量应小于200毫克/公斤焦糖色素。我国的GB8817-2001等国家标准也对焦糖色素的质量标准做出限定，对于非氨法焦糖色素，4-甲基咪唑不得检出；对于氨法焦糖色素，4-甲基咪唑的含量应低于O. 02%。由于大部分烟草料液或糖料都是棕褐色，同时焦糖色素是一种广泛使用的着色剂，因此，为保障烟草料液或糖料产品的安全性，对烟草料液或糖料中的4-甲基咪唑进行检测分析具有重要意义。目前，国内外测定4-甲基咪唑的方法主要有薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法和分光光度法。采用薄层层析法，其操作步骤多，特别是色谱斑点拖尾，定量不准确，检测限较高；气相色谱法虽然检测限较低，但需要样品量大，且要对样品进行硅藻土等小柱的纯化以及浓缩操作等前处理，操作复杂；目前的液相色谱法主要采用衍生化后液相色谱检测或在215nm波长进行紫外检测，前者的缺点与分光光度法相同，后者由于检测波长短受溶剂和复杂样品基质影响较大；分光光度法利用4-甲基咪唑与亚硝酸钠和对氨基磺酸反应生成黄色的有色物质而进行检测，但由于实际样品基质干扰严重以及样品稳定时间只有大约4小时，测定结果标准偏差较大。因而开发一种更为有效的检测烟草料液或糖料中4-甲基咪唑的方法对提升卷烟产品质量安全具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有检测方法存在的样品前处理繁琐、灵敏度较低、重现性较差等不足，提供一种检测烟草料液或糖料中4-甲基咪唑含量的方法，为烟草行业和烟用添加剂生产企业的产品质量安全提供技术保障，该方法具有检测限低、稳定性好、前处理简单、快速准确等优点。本发明的目的通过下述技术方案予以实现。除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。一种检测烟草料液中4-甲基咪唑含量的方法，该方法包括以下步骤(I)样品准备准确称取O. 6g 3. Og待测样品，精确至O. lmg，加入2_乙基咪唑 内标溶液，用水或O. I 1%的乙酸或甲酸水溶液稀释至5 25mL，控制使2-乙基咪唑在稀释后样品中的浓度为IOppb，摇匀；(2)SPE柱纯化依次用6mL甲醇、12mL水与IOmL O. I 1%的乙酸或甲酸水溶液活化和平衡6mL规格的C18-SPE小柱，活化和平衡SPE柱的柱流速为I 2mL/min ;取2mL步骤(I)所述的稀释后样品用活化好的C18-SPE小柱纯化，上样后依次用6mL0. I 1%的乙酸或甲酸水溶液、6mL水淋洗，再用IOmL 10%的乙腈水溶液洗脱4-甲基咪唑，取2mL洗脱液用O. 22 μ m水相滤膜过滤，滤液待LC-MS/MS检测；(3)制备标准溶液配制4-甲基咪唑浓度分别为lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、IOng/mL、20ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的标准溶液，每个标准溶液中2-乙基咪唑内标的浓度均为 10ng/mL ；(4)建立标准溶液工作曲线以4-甲基咪唑浓度与2-乙基咪唑内标浓度的比值为横坐标，以4-甲基咪唑定量离子对的峰面积与2-乙基咪唑内标定量离子对峰面积的比值为纵坐标，建立4-甲基咪唑的标准溶液工作曲线；对标准溶液检测数据进行线性回归，求得4-甲基咪唑的回归方程，R2应不小于O. 999 ；(5)实际样品检测测定步骤(2)得到的待测滤液中4-甲基咪唑子离子峰面积与2-乙基咪唑内标子离子峰面积，使用标准溶液工作曲线计算待测滤液中的4-甲基咪唑浓度，进而换算出样品中的4-甲基咪唑含量；LC-MS/MS的检测条件为色谱条件WatersAcquity UPLC BEH C18 色谱柱(2. Imm i. d. X 10Omm, I. 7 μ m),流动相为乙腈10mmo 1/L乙酸铵水溶液=12% :88%等度洗脱，色谱柱温度35°C，进样量
2μ L,流速 O. 2mL/min,运行时间 IOmin ；质谱条件采用ESI正离子检测模式，利用针泵直接将含内标浓度标准溶液注入质谱仪，改变质谱参数找出准确的M+1峰及信号较强的碎片离子，以母离子与子离子组成监测离子对，以多反应监测方式对待测组分进行定性定量检测。进一步的，优化后的质谱分析条件为正离子模式，电喷雾，喷雾电压2270V，离子源温度120°C ;雾化气700L/hr ;气帘气50L/hr，碰撞气O. 18mL/min，扫描时间100ms，锥孔电压35V，碰撞电压20V，4-甲基咪唑的检测离子对(Q1/Q3)为83/56，2-乙基咪唑的检测离子对(Q1/Q3)为95/81，定性分析采用标准物质保留时间、待测组分特征离子进行定性分析，定量分析采用多反应监测(MRM)模式分段扫描，以特征离子对进行定量分析。实验结果证明在香精试样中该方法的检测限为O. 2539ng/g,定量限为O. 8455ng/g°与现有技术相比，本发明具有以下突出优点I.本发明使用LC-MS/MS法在反相条件下进行4_甲基咪唑分析检测具有检测限低、稳定性好、前处理简单、快速准确等优点；2.本发明方法的检测结果受主观判断因素影响小，易于推广应用。
具体实施例方式以下结合应用实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。实施例I
①样品准备准确称取I. Og香精试样A，精确至O. lmg，加入2_乙基咪唑内标溶液，用水稀释至10mL，控制使2-乙基咪唑在稀释后样品中的浓度为lOppb，摇匀；②SPE柱纯化依次用6mL甲醇、12mL水与IOmLO. 2%的乙酸水溶液活化和平衡6mL (IOOOmg)规格的C18-SPE小柱，活化和平衡SPE柱的柱流速为lmL/min。将2mL①所述稀释后的烟草料液或糖料用活化好的C18-SPE小柱纯化，上样后依次用6mL O. 2%的乙酸水溶液、6mL水淋洗，再用10mL10%的乙腈水溶液洗脱4-甲基咪唑，取2mL洗脱液用O. 22 μ m有机相滤膜过滤，滤液待LC-MS/MS检测。③制备标准溶液配制4-甲基咪唑浓度分别为lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的标准溶液，每个标准溶液中2-乙基咪唑内标的浓度均为10ng/mL ；④建立标准溶液工作曲线在选定的仪器参数下，以4-甲基咪唑浓度与2-乙基咪唑内标浓度的比值为横坐标，以4-甲基咪唑定量离子对的峰面积与2-乙基咪唑内标定量离子对峰面积的比值为纵坐标，建立4-甲基咪唑的标准溶液工作曲线。对标准溶液检测数据进行线性回归，求得4-甲基咪唑的回归方程，R应不小于O. 999。⑤实际样品检测在选定的仪器参数下测定待测样品溶液中4-甲基咪唑子离子峰面积与2-乙基咪唑内标子离子峰面积，使用标准溶液工作曲线计算待测样品中的4-甲基咪唑浓度，进而换算得到香精试样A中4-甲基咪唑的含量为3. 716ng/g。实施例2①样品准备准确称取2. Og香精试样B，精确至O. lmg，加入2_乙基咪唑内标溶液，用水稀释至10mL，控制使2-乙基咪唑在稀释后样品中的浓度为lOppb，摇匀；②SPE柱纯化依次用6mL甲醇、12mL水与IOmLO. 2%的甲酸水溶液活化和平衡6mL (IOOOmg)规格的C18-SPE小柱，活化和平衡SPE柱的柱流速为lmL/min。将2mL①所述稀释后的烟草料液或糖料用活化好的C18-SPE小柱纯化，上样后依次用6mL 0. 2%的甲酸水溶液、6mL水淋洗，再用10mL10%的乙腈水溶液洗脱4-甲基咪唑，取2mL洗脱液用0. 22 μ m有机相滤膜过滤，滤液待LC-MS/MS检测。③制备标准溶液配制4-甲基咪唑浓度分别为lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的标准溶液，每个标准溶液中2-乙基咪唑内标的浓度均为10ng/mL ；④建立标准溶液工作曲线在选定的仪器参数下，以4-甲基咪唑浓度与2-乙基咪唑内标浓度的比值为横坐标，以4-甲基咪唑定量离子对的峰面积与2-乙基咪唑内标定量离子对峰面积的比值为纵坐标，建立4-甲基咪唑的标准溶液工作曲线。对标准溶液检测数据进行线性回归，求得4-甲基咪唑的回归方程，R应不小于O. 999。⑤实际样品检测在选定的仪器参数下测定香精试样B溶液中4-甲基咪唑子离子峰面积与2-乙基咪唑内标子离子峰面积，使用标准溶液工作曲线计算待测样品中的4-甲基咪唑浓度，进而换算得到香精试样B中的4-甲基咪唑含量为2. 375ng/g。实施例3 ①样品准备准确称取2. Og香精试样C，精确至O. lmg，加入2_乙基咪唑内标溶液，用水稀释至25mL，控制使2-乙基咪唑在稀释后样品中的浓度为8ppb，摇匀；②SPE柱纯化依次用6mL甲醇、12mL水与IOmLO. 2%的乙酸水溶液活化和平衡6mL (IOOOmg)规格的C18-SPE小柱，活化和平衡SPE柱的柱流速为2mL/min。将2mL①所述稀释后的烟草料液或糖料用活化好的C18-SPE小柱纯化，上样后依次用6mL O. 2%的乙酸水溶液、6mL水淋洗，再用10mL10%的乙腈水溶液洗脱4-甲基咪唑，取2mL洗脱液用O. 22 μ m有机相滤膜过滤，滤液待LC-MS/MS检测。③制备标准溶液配制4-甲基咪唑浓度分别为lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的标准溶液，每个标准溶液中2-乙基咪唑内标的浓度均为8ng/mL ；④建立标准溶液工作曲线在选定的仪器参数下，以4-甲基咪唑浓度与2-乙基咪唑内标浓度的比值为横坐标，以4-甲基咪唑定量离子对的峰面积与2-乙基咪唑内标定量离子对峰面积的比值为纵坐标，建立4-甲基咪唑的标准溶液工作曲线。对标准溶液检测数据进行线性回归，求得4-甲基咪唑的回归方程，R应不小于O. 999。⑤实际样品检测在选定的仪器参数下测定待测样品溶液中4-甲基咪唑子离子峰面积与2-乙基咪唑内标子离子峰面积，使用标准溶液工作曲线计算待测样品中的4-甲基咪唑浓度，进而换算得到香精试样C中的4-甲基咪唑含量为O. 2326ng/g，低于该方法的检测限。因此香精试样C中不含有4-甲基咪唑。需要指出，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种检测烟草料液中4-甲基咪唑含量的方法，该方法包括以下步骤 (1)样品准备准确称取O.6g 3. Og待测样品，精确至O. lmg，加入2-乙基咪唑内标溶液，用水或O. I 1%的乙酸或甲酸水溶液稀释至5 25mL，控制使2-乙基咪唑在稀释后样品中的浓度为IOppb，摇匀； (2)SPE柱纯化依次用6mL甲醇、12mL水与IOmLO. I 1%的乙酸或甲酸水溶液活化和平衡6mL规格的C18-SPE小柱，活化和平衡SPE柱的柱流速为I 2mL/min ;取2mL步骤(I)所述的稀释后样品用活化好的C18-SPE小柱纯化，上样后依次用6mL0. I 1%的乙酸或甲酸水溶液、6mL水淋洗，再用IOmL 10%的乙腈水溶液洗脱4-甲基咪唑，取2mL洗脱液用O.22 μ m水相滤膜过滤，滤液待LC-MS/MS检测； (3)制备标准溶液配制4-甲基咪唑浓度分别为lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的标准溶液，每个标准溶液中2-乙基咪唑内标的浓度均为10ng/mL ； (4)建立标准溶液工作曲线以4-甲基咪唑浓度与2-乙基咪唑内标浓度的比值为横坐标，以4-甲基咪唑定量离子对的峰面积与2-乙基咪唑内标定量离子对峰面积的比值为纵坐标，建立4-甲基咪唑的标准溶液工作曲线；对标准溶液检测数据进行线性回归，求得4-甲基咪唑的回归方程，R2应不小于O. 999 ； (5)实际样品检测测定步骤(2)得到的待测滤液中4-甲基咪唑子离子峰面积与2-乙基咪唑内标子离子峰面积，使用标准溶液工作曲线计算待测滤液中的4-甲基咪唑浓度，进而换算出样品中的4-甲基咪唑含量；LC-MS/MS的检测条件为色谱条件Waters Acquity UPLC BEH C18 色谱柱(2. Imm i. d. X 10Omm, I. 7 μ m),流动相为乙腈IOmmoI/L乙酸铵水溶液=12% 88%等度洗脱，色谱柱温度35°C，进样量2 μ L，流速 O. 2mL/min,运行时间 IOmin ； 质谱条件采用ESI正离子检测模式，利用针泵直接将含内标浓度标准溶液注入质谱仪，改变质谱参数找出准确的M+1峰及信号较强的碎片离子，以母离子与子离子组成监测离子对，以多反应监测方式对待测组分进行定性定量检测。
2.根据权利要求I所述的检测烟草料液中4-甲基咪唑含量的方法，其特征在于优化后的质谱分析条件为正离子模式，电喷雾，喷雾电压2270V，离子源温度120°C ;雾化气700L/hr ;气帘气50L/hr，碰撞气O. 18mL/min，扫描时间100ms，锥孔电压35V，碰撞电压20V，4-甲基咪唑的检测离子对(Q1/Q3)为83/56,2-乙基咪唑的检测离子对(Q1/Q3)为95/81，定性分析采用标准物质保留时间、待测组分特征离子进行定性分析，定量分析采用多反应监测(MRM)模式分段扫描，以特征离子对进行定量分析。
全文摘要
本发明公开了一种检测烟草料液中4-甲基咪唑含量的方法。该方法包括将烟草料液或糖料准确称量、添加2-乙基咪唑内标并溶解后，经过C18-SPE小柱纯化，用LC-MS/MS法在反相条件下进行分析检测。检测样品中4-甲基咪唑采用内标校准曲线法进行定量测定，计算出烟草料液或糖料中4-甲基咪唑的含量。本发明提供了一种检测限低、稳定性好、前处理简单、快速准确的烟草料液或糖料中4-甲基咪唑的分析检测方法，适用于烟草行业和烟草添加剂生产企业对烟草料液或糖料中4-甲基咪唑的分析检测，填补了这一技术领域的空白。
文档编号G01N30/06GK102879487SQ20121033724
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者蒋举兴, 王文元, 刘亚, 夏建军, 段焰青, 党立志 申请人:红云红河烟草(集团)有限责任公司