专利名称：一种小金牛草的检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种中药材的分析方法，特别是涉及ー种小金牛草的检测方法，具体地说是以小金牛草中的有效成分芒果苷作为指标成分，对小金牛草进行质量控制的方法。
背景技术：
小金牛草为远志科远志属植物小花远志Polygala arvensis Willd. (P.telephioides Willd.),以全草入药。秋季采集,晒干。味甘、微苦,平。散瘀止血，化痰止咳，解毒消肿。用于咳嗽胸痛，肺結核，咳血，尿血，便血，月经不调，跌打损伤，小儿麻痹后遗症，肝炎，毒蛇咬伤。小金牛草为组成金喉散处方之一，且为处方中的君药，所述的君药是指中医药领 域术语，是指中医药配伍中的君药、臣药、佐药、使药中的君药。小金牛草作为君药，其质量的好坏直接关系到金喉散的质量优劣，而目前小金牛草还没有有效的质量控制方法，小金牛草质量标准收载于上海地方药材标准(1994年版)，该标准中药材鉴别项中只有性状鉴另O，没有薄层色谱鉴别及含量测定项，可见该标准专属性差、准确性差，不能有效地控制小金牛草的质量。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的g在提供ー种小金牛草的检测方法，本发明运用薄层色谱法对小金牛草中有效成分芒果苷进行定性測定，运用高效液相色谱法进行定量測定，或同时运用这两种方法。通过上述检测方法能够很好地控制小金牛草的质量，可用于小金牛草药材真伪及品质优劣的评价，保证其质量的稳定、均一、可控。同时该检测方法还具有操作方便、准确度好、专属性强的特点。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
ー种小金牛草的检测方法，其特征在于，以芒果苷作为指标成分，用薄层色谱法对芒果苷进行定性測定，按以下步骤进行
1)供试品溶液的制备
a、取小金牛草粉末适量，加甲醇或こ醇作为提取溶剂，提取溶剂的加入量与小金牛草粉末取样量的体积质量比，以ml/g计为50:1,经超声处理15分钟 90分钟或加热回流提取20分钟 180分钟，得到提取溶液；
b、取步骤a得到的提取溶液，经滤过、滤液蒸干、残渣用IOml甲醇或こ醇使溶解，作为供试品溶液；或取步骤a得到的提取溶液，经静置后，取上清液即可作为供试品溶液；
2)对照药材溶液的制备取对照药材粉末，具体操作同步骤a制成对照药材溶液；
3)对照品溶液的制备取芒果苷对照品，加甲醇制成每Iml含O.Img芒果苷的溶液，作为对照品溶液；
4)鉴别吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，喷以显色剂，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同顔色的斑点；其中，所述展开剂是体积比为5 4:3:1:1的こ酸こ酷-丁酮-甲酸-水或体积比为8 10:1:1的こ酸こ酷-甲酸-水；显色剂是浓度为5%三氯化铁こ醇溶液。优选的在步骤I)中，当所述提取溶剂使浓度为40%_100%的甲醇或浓度为40% 100%的こ醇溶液时，取步骤a得到的提取溶液，经滤过、滤液蒸干、残渣用IOml甲醇或こ醇使溶解，作为供试品溶液。优选的在步骤I)中，当所述提取溶剂是浓度为95%_100%的甲醇或浓度为95% 100%的こ醇溶液时，取步骤a得到的提取溶液，经静置后，取上清液即可作为供试品溶液。ー种小金牛草的检测方法，其特征在于，运用高效液相色谱法对小金牛草中芒果苷进行定量測定，按以下步骤进行
1)供试品溶液的制备取小金牛草药材粉末适量，精密称定，置IOOml具塞锥形瓶中，精密加入浓度为50 70%甲醇或浓度50 70%こ醇的作为提取溶剂，提取溶剂的加入量与小金牛草粉末取样量的体积质量比，以ml/g计200: 1，密塞，称定重量，超声处理25 90分钟或回流提取0. 5 3小时，放冷，再称定重量，用相应的提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过,取续滤液作为供试品溶液；
2)对照品溶液的制备取芒果苷对照品适量，精密称定，加浓度为60%的こ醇制备成浓度为20. 584 1029. 2Pg/ml的对照品溶液，即得；
3)色谱条件与系统适用性试验以体积比为10 20:90 80的こ腈-酸的水溶液或体积比为10 40:90 60的甲醇-酸的水溶液或体积比为0 10 :10 30:90 60的こ腈-甲醇-酸的水溶液为液流动相；高效液相色谱法的检测波长为240 365nm、柱温为25 35°C、色谱柱为C18柱，理论塔板数按芒果苷峰计算应不低于8000 ；
4)測定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液5W，注入高效液相色谱仪，測定，即得。优选的在步骤I)中，所述提取溶剂是浓度为50 70%的甲醇或浓度为50 70%的こ醇。优选的在步骤3)中，所述酸的水溶液中的酸选自含磷酸、醋酸、甲酸，所述酸的水溶液中的酸与水的体积比为0. I 0. 5:100。ー种小金牛草的检测方法，其特征在于，以芒果苷作为指标成分，运用薄层色谱法对芒果苷进行定性測定，同时，运用高效液相色谱法对小金牛草中芒果苷进行定量測定；它们的具体操作步骤如前文所述。本发明的有益效果在干
小金牛草作为君药，其质量的好坏直接关系到金喉散的质量优劣，由于目前小金牛草没有有效的质量控制方法，于是对其进行质量标准研究。在研究过程中用薄层鉴别色谱技术和高效液相色谱技术对小金牛草的化学成分进行分析，发现了芒果苷成分，此芒果苷成分用购自中国食品药品检定研究院(批号111607-200402)芒果苷对照品进行比对，其色谱特征一致。如用多种不同极性的展开剂进行薄层鉴别，小金牛草供试品在与芒果苷对照品相应的位置上显相同顔色的特征斑点；用高效液相色谱仪(ニ极管阵列检测器DAD)进行测定，小金牛草供试品与芒果苷对照品有相同的吸收光谱图；再用多种体积比的流动相进行測定，小金牛草供试品在与对照品相应的位置上有相同的吸收峰，说明小金牛草中含有芒果苷成分。小金牛草中有芒果苷成分是发明人首次发现。芒果苷具有抑制中枢神经系统、抗炎、抑菌、抗单纯疱疹病毒，利胆和免疫作用，对模拟高原急性低氧肝损伤有保护作用，药理实验表明，本品用于治疗慢性支气管炎有较好疗效，可见芒果苷为小金牛草中有效成分，以芒果苷作为主要评价指标来控制小金牛草的质量具有现实意义。与现有技术相比，本发明具有以下优点本发明以芒果苷作为指标成分，运用薄层色谱法对芒果苷进行定性測定，或运用高效液相色谱法对小金牛草中芒果苷进行定量測定，也可以同时运用这两种方法，能够很好地控制小金牛草的质量，可用于小金牛草药材真伪及品质优劣的评价，保证其质量的稳定、均一，可控。本发明所述的检测方法还具有操作方便、准确度好、专属性强等优点。
图I为本发明的薄层鉴别色谱图，其中，I为小金牛草供试品，2为小金牛草对照药材，3为芒果苷对照品。图2为含量测定对照品高效液相色谱图。图3为含量測定供试品高效液相色谱图。
具体实施例方式本发明提供的检测方法中所用试剂均由市场购得，其中用于薄层色谱鉴别的试剂为分析纯，用于高效液相进行含量測定的甲醇和こ醇为色谱纯，小金牛草为广州白云山敬修堂药业股份有限公司购得，对照品芒果苷购自中国食品药品检定研究院(批号111607-200402)o以下为本发明的薄层色谱鉴别方法具体实施方式
，所述的实施例是为了进ー步描述本发明，而不是限制本发明。一、薄层色谱鉴别
实施例I :
供试品溶液的制备取小金牛草粉末0. 5g，加40%甲醇25ml，超声处理15分钟，滤过、滤液蒸干、残渣用IOml的甲醇使溶解，即得。对照药材溶液的制备取对照药材，按供试品溶液的制备方法制备对照药材溶液。对照品溶液的制备取芒果苷对照品，加甲醇制成每Iml含0. Img的对照品溶液。鉴别吸取供试品溶液、对照药材溶液2W和对照品溶液IOW，分别点于同一硅胶G薄层板上，以こ酸こ酷-丁酮-甲酸-水(5:3:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以浓度为5%的三氯化铁こ醇溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同顔色的斑点，參照图I。薄层色谱鉴别耐用性考察分别考察了在低温条件下(4°C)、室温条件下(25°C)、低湿条件下(湿度为30%)、高湿条件下(湿度为75%)主斑点的分离效果。试验结果表明主斑点分离效果好，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，均显相同顔色的斑点。说明该鉴别方法稳定性、重复性好。实施例2 :具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备步骤中超声处理30分钟；鉴别步骤中以こ酸こ酯-丁酮-甲酸-水(体积比为4:3:1:1)为展开剂。实施例3 :具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备步骤中超声处理90分钟。实施例4 :具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备步骤中提取溶剂为浓度为50%的甲醇，加热回流20分钟；鉴别步骤中以こ酸こ酯-甲酸-水(体积比为8:1:1)为展开剂。实施例5 :具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备步骤中提取溶剂为浓度为40%的こ醇，加热回流60分钟，残渣用IOmlこ醇使溶解；鉴别步骤中以こ酸こ酷-甲酸-水(体积比为9:1:1)为展开剂。实施例6 :具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备步骤中提取溶剂加浓度为50%的こ醇，加热回流180分钟；鉴别步骤中以こ酸こ酯-甲酸-水(体积比为10:1:1)为展开剂。
实施例7 :具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备步骤中提取溶剂为浓度为95%的甲醇，提取液经静置后即得(提取液不需滤过及蒸干)；鉴别步骤中供试品溶液、对照药材溶液的点样量为10μ1。实施例8 :具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备步骤中提取溶剂为浓度为100%的甲醇，提取液经静置后即得(提取液不需滤过及蒸干);鉴别步骤中供试品溶液、对照药材溶液的点样量为5μ1。实施例9 :具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备步骤中提取溶剂为浓度为95%的こ醇，滤液滤过即得；鉴别步骤中供试品溶液、对照药材溶液的点样量为 ιομ ο实施例10 :具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备步骤中提取溶剂为浓度为100%的こ醇，滤液滤过即得；鉴别步骤中供试品溶液、对照药材溶液的点样量为 ιομ οニ、芒果苷含量测定
实施例11
供试品溶液的制备取小金牛草药材粉末约0. 25g，精密称定，置IOOml具塞锥形瓶中，精密加入浓度为50%的甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理25分钟，放冷，再称定重量，用浓度为50%的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
对照品溶液的制备取芒果苷对照品适量，精密称定，加浓度为60%的こ醇制备成浓度为40(^g/ml的对照品溶液，即得。色谱条件与系统适用性试验以体积比为15:85的こ腈-0. 1%磷酸的水溶液为流动相；高效液相色谱法的检测波长为258nm、柱温为25°C、色谱柱为C18柱，理论塔板数按芒果苷峰计算应不低于8000 ；
測定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液5μ1，注入高效液相色谱仪，測定，即得；小金牛草含芒果苷不得少于I. 0%。实施例12 :具体操作步骤同实施例11，不同的是供试品溶液的制备步骤中用浓度为50%的こ醇为提取溶剂，采用超声处理45分钟；色谱条件与系统适用性试验步骤中以体积比为10:90的こ腈-0. 2%磷酸的水溶液为流动相；高效液相色谱法的检测波长为240nmo实施例13 :具体操作步骤同实施例11，不同的是供试品溶液的制备步骤中用浓度为70%的こ醇为提取溶剂，采用超声处理90分钟；色谱条件与系统适用性试验步骤中以体积比为20:80的こ腈-0. 5%磷酸的水溶液为流动相；高效液相色谱法的检测波长为j65nm。实施例14 :具体操作步骤同实施例11，不同的是供试品溶液的制备步骤中用浓度为50%的甲醇为提取溶剂，采用回流提取0. 5小时；色谱条件与系统适用性试验步骤中以体积比为10:90的甲醇-0. 1%磷酸的水溶液为流动相。实施例15 :具体操作步骤同实施例11，不同的是供试品溶液的制备步骤中用浓度为60%的甲醇为提取溶剂，采用回流提取I小时；色谱条件与系统适用性试验步骤中以体积比为10:90的甲醇-0. 1%磷酸的水溶液为流动相。
实施例16 :具体操作步骤同实施例11，不同的是供试品溶液的制备步骤中用浓度为70%的甲醇为提取溶剂，采用回流提取I小时；色谱条件与系统适用性试验步骤中以体积比为20:80的甲醇-0. 1%醋酸的水溶液为流动相。实施例17 :具体操作步骤同实施例11，不同的是供试品溶液的制备步骤中采用回流提取3小时；色谱条件与系统适用性试验步骤中以体积比为40:60的甲醇-0. 2%醋酸的水溶液为流动相。实施例18 :具体操作步骤同实施例11，不同的是色谱条件与系统适用性试验步骤中以体积比为40:60的甲醇-0. 5%醋酸的水溶液为流动相，柱温为30°C。实施例19 :具体操作步骤同实施例11，不同的是色谱条件与系统适用性试验步骤中以体积比为0:10:90的こ臆-甲醇-0. 1%磷酸的水溶液为流动相，柱温为35°C。实施例20 :具体操作步骤同实施例11，不同的是色谱条件与系统适用性试验步骤中以体积比为5:15:80的こ臆-甲醇-0. 1%甲酸的水溶液为流动相。实施例21 :具体操作步骤同实施例11，不同的是色谱条件与系统适用性试验步骤中以体积比为10:30:60的こ腈-甲醇-0. 2%甲酸的水溶液为流动相。实施例22 :具体操作步骤同实施例11，不同的是色谱条件与系统适用性试验步骤中以体积比为10:30:60的こ臆-甲醇-0. 5%甲酸的水溶液为流动相。含量測定方法学验证
仪器与试药
高效液相色谱仪=Agilent 1260LC ；DAD检测器。超声仪昆山市超声仪器有限公司KQ-600DE 型。对照品芒果苷购自中国食品药品检定研究院(批号111607-200402)，小金牛草(批号GX120601)由广州白云山敬修堂药业股份有限公司购得；こ腈(色谱纯，honeywell)，作为溶剂用的こ醇和甲醇为分析纯试剂，购于广州试剂厂。色谱条件与系统适用性试验以体积比为15:85的こ腈-0. 1%磷酸的水溶液为流动相；高效液相色谱法的检测波长为258nm、柱温为25°C,色谱柱phenomenex synergiFUsion-RP (4Mm，4. 6 X 250mm)，理论塔板数按芒果苷峰计算应不低于8000。供试品溶液的制备取小金牛草药材粉末约0. 25g，精密称定，置IOOml具塞锥形瓶中，精密加入浓度为60%的こ醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用浓度为60%的こ醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；其高效液相色谱图如图3所示。
对照品溶液的制备取芒果苷对照品适量，精密称定，加60%こ醇制备成浓度为400μδ/πι1的对照品溶液，即得。其高效液相色谱图如图2所示。线性关系考察精密称取芒果苷对照品O. 05146g，置50ml容量瓶中，加浓度为60%的こ醇溶解并定容至刻度，分别量取2ml、2ml、2ml、2ml、5ml置100ml、50ml、25ml、IOmlUOml的容量瓶中，加浓度为60%的こ醇定容至刻度，配制成系列含量为20. 584 1029. 2μδ/πι1的芒果苷对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各5μ1，在前文所述的色谱条件下測定，并与峰面积Y为纵坐标，浓度X (η=6)为横坐标进行线性回归，得回归方程为Υ=21. 207Χ-10. 068，r=0. 9999，芒果苷在20. 584 1029. 2μδ/πι1呈良好的线性关系。试验结果见表I.
权利要求
1.ー种小金牛草的检测方法，其特征在干，以芒果苷作为指标成分，用薄层色谱法对芒果苷进行定性測定，按以下步骤进行 1)供试品溶液的制备 a、取小金牛草粉末适量，加甲醇或こ醇作为提取溶剂，提取溶剂的加入量与小金牛草粉末取样量的体积质量比，以ml/g计为50:1,经超声处理15分钟 90分钟或加热回流提取20分钟 180分钟，得到提取溶液； b、取步骤a得到的提取溶液，经滤过、滤液蒸干、残渣用甲醇或こ醇使溶解，作为供试品溶液；或取步骤a得到的提取溶液，经静置后，取上清液即可作为供试品溶液； 2)对照药材溶液的制备取对照药材粉末，具体操作同步骤a制成对照药材溶液； 3)对照品溶液的制备取芒果苷对照品，加甲醇制成每Iml含O.Img芒果苷的溶液，作为对照品溶液； 4)鉴别吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，喷以显色剂，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同顔色的斑点；其中，所述展开剂是体积比为5 4:3:1:1的こ酸こ酷-丁酮-甲酸-水或体积比为8 10:1:1的こ酸こ酯-甲酸-水；显色剂是浓度为5%三氯化铁こ醇溶液。
2.如权利要求I所述的ー种小金牛草的检测方法，其特征在干在步骤I)中，当所述提取溶剂是浓度为40%-100%的甲醇或浓度为40% 100%的こ醇溶液时，取步骤a得到的提取溶液，经滤过、滤液蒸干、残渣用IOml甲醇或こ醇使溶解，作为供试品溶液。
3.如权利要求I所述的ー种小金牛草的检测方法，其特征在干在步骤I)中，当所述提取溶剂是浓度为95%-100%的甲醇或浓度为95% 100%的こ醇溶液时，取步骤a得到的提取溶液，经静置后，取上清液即可作为供试品溶液。
4.如权利要求1、2或3所述的ー种小金牛草的检测方法，其特征在于运用高效液相色谱法对小金牛草中芒果苷进行定量測定，按以下步骤进行 1)供试品溶液的制备取小金牛草药材粉末适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂，提取溶剂的加入量与小金牛草粉末取样量的体积质量比，以ml/g计200:1，密塞，称定重量，超声处理25 90分钟或回流提取O. 5 3小时，放冷，再称定重量，用相应的提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液； 2)对照品溶液的制备取芒果苷对照品适量，精密称定，加浓度为60%的こ醇制备成浓度为20. 584 1029. 2μδ/πι1的对照品溶液，即得； 3)色谱条件与系统适用性试验以体积比为10 20:90 80的こ腈-酸的水溶液或体积比为10 40:90 60的甲醇-酸的水溶液或体积比为O 10 :10 30:90 60的こ腈-甲醇-酸的水溶液为液流动相；高效液相色谱法的检测波长为240 365nm、柱温为25 35°C、色谱柱为C18柱，理论塔板数按芒果苷峰计算应不低于8000 ； 4)測定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，測定，即得。
5.如权利要求4所述的ー种小金牛草的检测方法，其特征在于在步骤I)中，所述提取溶剂是浓度为50 70%的甲醇或浓度为50 70%的こ醇。
6.如权利要求4所述的ー种小金牛草的检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述酸的水溶液中的酸选自含磷酸、醋酸、甲酸，所述酸的水溶液中的酸与水的体积比为O. I O. 5:100。
7.—种小金牛草的检测方法，其特征在于，运用高效液相色谱法对小金牛草中芒果苷进行定量測定，按以下步骤进行 1)供试品溶液的制备取小金牛草药材粉末适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂，提取溶剂的加入量与小金牛草粉末取样量的体积质量比，以ml/g计200:1，密塞，称定重量，超声处理25 90分钟或回流提取O. 5 3小时，放冷，再称定重量，用相应的提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液； 2)对照品溶液的制备取芒果苷对照品适量，精密称定，加浓度为60%こ醇制备成浓度为20. 584 1029. 2μδ/πι1的对照品溶液，即得； 3)色谱条件与系统适用性试验以体积比为10 20:90 80的こ腈-酸的水溶液或体积比为10 40:90 60的甲醇-酸的水溶液或体积比为O 10 :10 30:90 60的こ腈-甲醇-酸的水溶液为液流动相；高效液相色谱法的检测波长为240 365nm、柱温为 25 35°C、色谱柱为C18柱，理论塔板数按芒果苷峰计算应不低于8000 ； 4)測定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，測定，即得。
8.如权利要求7所述的ー种小金牛草的检测方法，其特征在于在步骤I)中，所述提取溶剂是浓度为50 70%的甲醇或浓度为50 70%的こ醇。
9.如权利要求7所述的ー种小金牛草的检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述酸的水溶液中的酸选自含磷酸、醋酸、甲酸，所述酸的水溶液中的酸与水的体积比为O. I O. 5:100。
全文摘要
本发明公开了一种小金牛草的检测方法，运用薄层色谱法对小金牛草中有效成分芒果苷进行定性测定，运用高效液相色谱法对小金牛草中有效成分芒果苷进行定量测定，或同时运用这两种方法。通过上述检测方法能够很好地控制小金牛草的质量，可用于小金牛草药材真伪及品质优劣的评价，保证其质量的稳定、均一、可控。同时该检测方法还具有操作方便、准确度好、专属性强的特点。
文档编号G01N30/36GK102854283SQ20121033765
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月12日 优先权日2012年9月12日
发明者严志标, 彭红英, 陆颂规, 曾利杰, 陈晓坚, 程君璐, 刘敏珊 申请人:广州白云山敬修堂药业股份有限公司