专利名称：一种乳中碱性蛋白的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测乳中碱性蛋白含量的方法，特别涉及强化了牛奶碱性蛋白牛乳的检测方法，属于分析技术领域。
背景技术：
碱性蛋白是指等电点大于7的一类蛋白质。牛奶碱性蛋白(milk basic protein),在我国2009年被批准为新资源食品。牛奶碱性蛋白是以鲜牛乳为原料，经脱脂、过滤、浓缩、去除酪蛋白等酸性蛋白、阳离子层析、冷冻干燥等工艺制成的产品(卫生部公告2009年第 18 号)。美国 FDA 对牛奶喊性蛋白(bovine milk basic protein fraction, BMBPF)的生产工艺描述为将经巴氏灭菌的脱脂牛奶通过阳离子交换树脂，去除酸性牛奶蛋白和乳糖，得到牛奶碱性蛋白，后使用氯化钠将保留在树脂上的牛奶碱性蛋白洗脱下来，洗脱液经过膜浓缩得到牛奶碱性蛋白固体，最后粉碎包装成成品。牛奶碱性蛋白是一个混合物，是乳清蛋白中的一部分，主要成分为乳铁蛋白、乳过氧化物酶等，该类物质的等电点大于7。目前检测蛋白质的方法很多，例如微量凯氏定氮法、Folin-酚试剂法、考马斯亮蓝法、双缩脲法、液相色谱以及毛细管电泳等方法。由于牛奶中含有大量的蛋白质，以上方法均无法测定牛乳碱性蛋白。检索国内以及国际资料，也未发现相关检测方法和检测标准。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳及乳制品中牛奶碱性蛋白的检测方法。由于牛奶碱性蛋白本身含量非常低，无法准确检测出，此外牛奶检测碱性蛋白不需要经常测定，无实际意义。因此本方法主要用于牛奶中添加了牛奶碱性蛋白的产品。本发明的牛奶碱性蛋白的检测方法，包括以下步骤I)乳中酪蛋白及脂肪的沉淀分离；2)牛奶碱性蛋白的吸附；3)牛奶碱性蛋白的分离收集；4)将步骤3)中获得的牛奶碱性蛋白定量测定。上述步骤I中酪蛋白和脂肪的沉淀分离的方法包括直接离心分离、酸沉淀结合离心分离、乙腈沉淀并结合离心分离。本发明优选的分离方法为酸沉淀并结合离心的方法，优选的酸为三氯乙酸和盐酸。优化的酸的PH的调节方为先用lmol/L酸调制牛奶pH为4. 6，离心转速为10000r/20min。并用0. 5mol/L NaOH调节牛奶的pH到6. 5，并在转速为10000r/15mino优选的离心管的容量为100mL。牛奶处理量根据检测方法而改变，凯氏定氮优选的牛奶处理量为100g。上述步骤2选用的吸附柱为阳离子吸附柱，柱材料选用阳离子交换树脂，其中优选的阳离子交换材料为CM sephrose FF (GE)、CM sephadex C50 (GE),更优选的材料为CMsephrose FF(GE)。吸附柱优选的直径为16mm，吸附选用的缓冲液为0. 01mol/L磷酸缓冲液，pH6. 5。上述步骤3选用的将碱性蛋白从吸附柱中解脱的方式采用含盐缓冲液，优选盐为NaCl，盐溶液的浓度为O. 5^1. Omol/L，优选的盐浓度为I. Omol/L。收集蛋白的监测采用能够检测蛋白的在线装置，优选为核酸蛋白检测器，收集开始时间为当检测到有蛋白物质流出立即开始进行收集，收集终止时间为当蛋白检测仪不能检测有蛋白物质流出为止，即监测值的波动小于检出值。上述步骤4所选用的定量测定方法为微量凯氏定氮法、Folin-酚试剂法、考马斯亮蓝法、双缩脲法、液相色谱以及毛细管电泳等方法。其中优选的定氮方式为微量凯氏定氮和液相色谱法。本发明包括以下各项I. 一种乳中牛奶碱性蛋白的检测方法，所述方法包括以下步骤
I)乳中酪蛋白及脂肪的沉淀分离；2)牛奶碱性蛋白的吸附；3)牛奶碱性蛋白的分离收集；4)将步骤3)中获得的牛奶碱性蛋白定量测定。2.权利要求I的方法，其中所述牛奶碱性蛋白是乳铁蛋白。3.权利要求I或2的方法，其中所述酪蛋白和脂肪的沉淀分离包括直接离心分离、酸沉淀结合离心分离、乙腈沉淀并结合离心分离，优选的是酸沉淀结合离心的方法。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述酸沉淀并结合离心的方法包括称取乳，将pH调节为3_7,优选的是4-6,优选的是4. 5-5. 5,优选的是4. 6,静置并尚心以去除酪蛋白，获得第一上清液，将第一上清液调节PH为5-8，优选地6-7，优选地6. 5，接着进行离心得到第二上清液。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述吸附通过吸附柱进行，所述吸附柱为人工填充柱或购买的预装柱，所述吸附柱的柱材料选用阳离子交换树脂，其中优选的阳离子交换树脂为 CM sephrose FF> CM sephadex C50,更优选的是 CM sephrose FF。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述吸附选用的缓冲液的pH为6. 2-6. 8，优选地6. 5，浓度为0. 01-0. 03mol/L，优选地0. 01mol/L，其中所述缓冲液优选的是磷酸缓冲液。7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述分离收集采用含盐缓冲液洗脱来进行，其中收集蛋白的监测采用能够检测蛋白的在线装置，优选为核酸蛋白检测器进行，收集开始时间为当检测到有蛋白物质流出，收集终止时间为当蛋白检测仪不能检测有蛋白物质流出，即监测值的波动小于检出值。8.权利要求7的方法，其中所述含盐缓冲液的盐浓度为0. 5-1. 0mol/L,优选地lmol/L。9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述定量测定通过微量凯氏定氮法、Folin-酚试剂法、考马斯亮蓝法、双缩脲法、液相色谱法或毛细管电泳，优选微量凯氏定氮或液相色谱法进行。10.权利要求9的方法，其中所述液相色谱法以乳铁蛋白为标准品，通过将液相获得图谱所有的峰面积与乳铁蛋白标准峰比较进行定量。
此外，本发明包括以下各项I. 一种添加牛奶碱性蛋白的牛奶中碱性蛋白的检测方法，所述方法包括以下步骤I)乳中酪蛋白及脂肪的沉淀分离2)牛奶碱性蛋白的吸附3)牛奶碱性蛋白的分离收集4)将步骤3)中获得牛奶碱性蛋白的定量测定2.项I的方法，其中酪蛋白和脂肪的沉淀分离的方法包括直接离心分离、酸沉淀结合离心分离、乙腈沉淀并结合离心分离。本发明优选的分离方法为酸沉淀并结合离心的 方法，优选的酸为三氯乙酸和盐酸。3.项I的方法，其中所述吸附柱可以为人工填和购买预装柱，柱材料选用阳离子交换树脂，其中优选的阳离子交换材料为CM sephrose FF> CM sephadex C50,更优选的材料为 CM sephrose FF。4.项3的方法，其中人工填充柱的柱直径为16mm，吸附选用的缓冲液为ρΗ6· 2-6. 8，优选为ρΗ6· 5磷酸缓冲液，其为浓度O. 01 O. 03mol/L，优选为O. 01mol/L。5.项I的方法，其中牛奶碱性蛋白的分离收集采用含盐缓冲液，盐溶液的浓度为O. 5-1. Omol/L,优选盐为NaCL，优选的盐浓度为lmol/L。6.项I的方法，其中所述蛋白定量方法包括微量凯氏定氮法、Folin-酚试剂法、考马斯亮蓝法、双缩脲法、液相色谱以及毛细管电泳等方法。其中优选的定氮方式为微量凯氏定氮和液相色谱法。
具体实施例方式本发明提供了牛奶碱性蛋白的检测方法。其中检测物中含牛奶碱性蛋白为8-30mg/100go牛奶碱性蛋白为新西兰tatua公司提供。如无特殊说明，本说明书中的科技术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。所述牛奶，可以是全脂、半脱脂或脱脂牛奶，还可以是用奶粉、奶油、乳清粉或牛奶的其它组分配制而成的还原奶。例如，所述牛奶优选为原奶。本发明中，对牛奶的来源、生产条件等没有限制。本发明所述的乳是指任何形式的乳及乳制品，如牛乳、羊乳、马乳或等同的乳粉，乳清蛋白粉，最佳选择是牛乳，其中该乳中添加有牛奶碱性蛋白。如无特殊说明，本说明书中的重量份是相对于100重量份最终得到的液体乳制品产品而言的，本说明书中的百分比(%)均为重量百分比。在说明书和权利要求书中使用的涉及组分量、工艺条件等的所有数值在所有情形中均应理解被“约”修饰。涉及相同组分或性质的所有范围均包括端点，该端点可独立地组合。由于这些范围是连续的，因此它们包括在最小值与最大值之间的每一数值。还应理解的是，本申请引用的任何数值范围预期包括该范围内的所有子范围。实施例本实施例所指添加牛奶碱性蛋白的牛奶是在UHT后，加入了 10mg/100g牛奶碱性蛋白的牛奶。实施例I :微量凯氏定氮进行牛奶碱性蛋白测定I)添加牛奶碱性蛋白的牛奶中酪蛋白及脂肪的沉淀分离精确称取添加牛奶碱性蛋白的牛奶100. 00g，用lmol/L HCl调节pH为4. 6，静置30min，离心(10000r/20min)去除酪蛋白，获得上清液，上清液用O. 5mol/L NaOH调节pH为6. 5,离心(10000r/15min),上清液备用，离心管选用100mL。2)牛奶碱性蛋白的吸附取阳离子交换树脂20ml 25mL CM sephrose FF,装入16x 400mm的柱,用减压法除去树脂中存留的气泡，使得层析柱材料分布均匀。然后用四倍柱体积0. Olmol/L磷酸缓冲液(pH 6. 5)平衡，使核酸蛋白检测的基线趋于稳定(其中使用的核酸蛋白检测器的型号H D - 2000，上海精科实业有限公司；波长到280nm，灵敏度小于0. 01A，噪音彡0. 00025Au)。取15 20mL上清液，加样于阳离子交换柱上，用0. Olmol/L磷酸缓冲液(pH 6. 5)洗脱至基线趋于稳定。3)牛奶碱性蛋白的分离收集用0. 01mol/L磷酸缓冲液，pH 6. 5 (含IM NaCl)洗脱，收集开始时间为当检测到有蛋白物质(即核酸蛋白检测仪值不断增加)流出立即开始进行收集，收集终止时间为当蛋白检测仪不能检测有蛋白物质流出为止，即监测值的波动小于检出值4)牛奶碱性蛋白的定量测定将100. OOg添加牛奶碱性蛋白的牛奶的所有收集物合并进行蛋白含量测定。蛋白测定方法采用微量凯氏定氮法。消化时加入硫酸钾6g，硫酸铜0. 2g，将所有收集溶液全部加入消化管后，加入硫酸8ml ;样品消化好后定容至IOOml容量瓶内，蒸馏时，取20ml样液，加入40%Na0H 10ml，2%硼酸20ml ;用0. 01mol/l盐酸进行滴定。蒸馏和滴定可以采用Foss1035 (Foss)(检出限为 0.01%)。测定含量牛奶碱性蛋白含量为8. 6mg/100g。实施例2 :液相色谱进行乳铁蛋白测定I)添加牛奶碱性蛋白的牛奶中酪蛋白及脂肪的沉淀分离精确称取添加牛奶碱性蛋白的牛奶25. 00g，用lmol/L三氯乙酸调节pH为4. 6，静置30min，离心(10000r ;20min)去除酪蛋白，获得上清液，上清液用0. 5mol/L NaOH调节pH为6. 5,离心(10000r ; 15min),上清液备用。2)乳铁蛋白的吸附取阳离子交换树脂20ml 25mL CM sephrose FF,装入16x400mm的柱,用减压法除去树脂中存留的气泡，使得层析柱材料分布均匀。然后用四倍柱体积0. 01mol/L磷酸缓冲液(pH 6. 5)平衡，使核酸蛋白检测的基线趋于稳定。取15 20mL上清液，加样于阳离子交换柱上，用0. Olmol/L磷酸缓冲液(pH 6. 5)洗脱至基线趋于稳定。3)乳铁蛋白的分离收集用0. 01mol/L磷酸缓冲液pH 6. 5 (含IM NaCl)洗脱，收集开始时间为当检测到有蛋白物质(即核酸蛋白检测仪值不断增加)流出立即开始进行收集，收集终止时间为当蛋白检测仪不能检测有蛋白物质流出为止，即监测值的波动小于检出值。
4)乳铁蛋白的定量测定乳铁蛋白的含量采用液相色谱的方法测定。高效液相色谱仪shimadzu公司 SPD-20A ；shimadzu 公司 LC-20A ；shimadzu 公司 IOAsup ;日本资生堂 proteonavi C4 柱(250mmX 4. 6mmX 5 μ m);乳铁蛋白标样(sigmaL9507)高效液相色谱条件流动相A :0. 1%三氟乙酸(TFA)-水溶液流动相B 0. 1%三氟乙酸(TFA)- 乙腈水溶液(95 5)检测波长280nm流速0.5mT ,/mi η柱温35°C进样量20μ L梯度洗脱(见表I)表I梯度洗脱条件
权利要求
1.一种乳中牛奶碱性蛋白的检测方法，所述方法包括以下步骤 1)乳中酪蛋白及脂肪的沉淀分离； 2)牛奶碱性蛋白的吸附； 3)牛奶碱性蛋白的分离收集； 4)将步骤3)中获得的牛奶碱性蛋白定量测定。
2.权利要求I的方法，其中所述牛奶碱性蛋白是乳铁蛋白。
3.权利要求I或2的方法，其中所述酪蛋白和脂肪的沉淀分离包括直接离心分离、酸沉淀结合离心分离、乙腈沉淀并结合离心分离，优选的是酸沉淀结合离心的方法。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述酸沉淀并结合离心的方法包括称取乳，将pH调节为3-7，优选的是4-6，优选的是4. 5-5. 5，优选的是4. 6，静置并离心以去除酪蛋白，获得第一上清液，将第一上清液调节PH为5-8，优选地6-7，优选地6. 5，接着进行离心得到第二上清液。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述吸附通过吸附柱进行，所述吸附柱为人工填充柱或购买的预装柱，所述吸附柱的柱材料选用阳离子交换树脂，其中优选的阳离子交换树脂为 CM sephrose FF> CM sephadex C50,更优选的是 CM sephrose FF。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述吸附选用的缓冲液的pH为6.2-6. 8，优选地6. 5，浓度为O. 01-0. 03mol/L，优选地O. Olmol/L，其中所述缓冲液优选的是磷酸缓冲液。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述分离收集采用含盐缓冲液洗脱来进行，其中收集蛋白的监测采用能够检测蛋白的在线装置，优选为核酸蛋白检测器进行，收集开始时间为当检测到有蛋白物质流出，收集终止时间为当蛋白检测仪不能检测有蛋白物质流出，即监测值的波动小于检出值。
8.权利要求7的方法，其中所述含盐缓冲液的盐浓度为O.5-1. Omol/L，优选地lmol/L。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述定量测定通过微量凯氏定氮法、Folin-酚试剂法、考马斯亮蓝法、双缩脲法、液相色谱法或毛细管电泳，优选微量凯氏定氮或液相色谱法进行。
10.权利要求9的方法，其中所述液相色谱法以乳铁蛋白为标准品，通过将液相获得图谱所有的峰面积与乳铁蛋白标准峰比较进行定量。
全文摘要
本发明涉及一种乳中碱性蛋白的检测方法。本发明提供了一种乳中碱性蛋白物质的测定方法，特别是牛奶碱性蛋白的测定。所述方法包括1)通过调酸离心的方式除去酪蛋白和脂肪；2)通过阳离子树脂将碱性蛋白进行吸附，3)收集洗脱液，4)利用微量定氮的方式进行蛋白质测定。本发明还提供了利用层析设备代替手动所进行牛奶碱性蛋白的收集的方法。
文档编号G01N30/02GK102866152SQ20121034414
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者陈伟, 李志伟, 钱文涛, 季国志, 高增丽, 李洪亮, 于景华, 高连胜 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司