专利名称：孕马血清促性腺激素双抗体夹心elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种ELISA检测试剂盒，具体地说是一种检测孕马血清促性腺激素的双抗体夹心ELISA试剂盒。
背景技术：
孕马血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotrophin PMSG)又称马绒毛膜促性腺激素(equine chorionic gonadotropin, eCG)。PMSG 是从怀孕 40-120 天母马血液中提纯的一种糖蛋白激素，是一种经济实用的促性腺激素，在生产上常用以代替较昂贵的促卵泡素(FSH)而广泛应用于动物的诱发发情、超数排卵或增加排卵率(如提高双羔率)；对卵巢发育不全或雄性生精能力衰退等也都可收到一定疗效。由于孕马血清中PMSG的含量受多种因素的影响，不同妊娠期、不同品种、同一品种不同年龄及胎次等都对其影响较大。因此在用血清提纯PMSG之前，能对血清中PMSG效价进行检测，对于生产提纯具有重 要的指导意义。综合生殖激素的检测方法有多种多样，主要有放射性免疫分析法、免疫胶体金检测法、酶联免疫分析法(ELISA)、反向间接血凝法、色谱技术、化学发光技术及生物传感器技术等。目前，我国关于PMSG的检测有3种方法。其一是大鼠卵巢增重法，该法是依据《中华人民共和国兽药规范》(1993)血促性素(孕马血清促性腺激素PMSG)生物检定法，采用PMSG能促进大鼠卵巢增长的原理，将不同浓度的标准品注入相同来源的大鼠体内，根据卵巢增重情况绘制标准曲线，再将同体积待检样品注入同系相同生理状况的大鼠体内，测定其卵巢增重从而确定激素含量。由于该法灵敏度低、实验周期长、饲养实验动物变数大、影响因素较多，不易于生产与科研中推广应用。其二是反向间接血凝法，该法的原理是将纯化的PMSG抗体吸附到双醛化得羊红血球表面，遇到相应抗原，血球即被动凝集，按完全凝集孔样本的稀释倍数即可得到抗原的血凝效价。此法虽达到快速检测目的，但不同批次醛化红血球差异大，且抗体纯度要求高，质量要求均一，导致测定结果的差异大，也不适于生产应用。其三是放射性免疫检测法，使放射性标记抗原和未标记抗原(待测物)与不足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。此法快速准确，样品需要量少，但由于此种方法具有高度放射性，对操作人员健康有害，同时检测所需的仪器较昂贵，也不利于推广应用。另外免疫胶体金检测法只能实现定性和半定量检测，目前阶段不宜推广使用。色谱技术、化学发光技术及生物传感器技术同样也可以用于激素检测，但由于其检测条件的限制性，在试验室中作为科研检测方法可以应用，但不适合于野外检测，对实际生产的指导意义不大。ELISA凭借其高度的灵敏度、良好的特异性、检测速度及低检测成本等优势已被广泛应用于生物、化学、医学、环境科学等学科的分析检测中。近年来，随着生物医学的研究进展，免疫学以其独特的优势有力的推动了医学和生物学中各个领域的发展。目前美国DRG公司生产的孕马血清促性腺激素快速检测试剂盒，能够在短短几个小时内完成多个样品的检测，准确省时。但由于进口价格昂贵，一个96孔检测板需要花费180(Γ2000元，同时由于DRG公司生产的试剂盒检测范围为0-80IU，国内有些马种的最高含量达到140IU，超出了其检测范围，因此急需建立一种快速、准确、省时、简便易操作的检测PMSG含量的方法并研制试剂盒，解决进口昂贵、检测范围窄的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种孕马血清促性腺激素单克隆抗体。本发明的目的之二在于提供一种用于检测孕马血清促性腺激素的双抗体夹心ELISA试剂盒，以克服上述不足。本发明提供一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体杂交瘤细胞株D-3，其保藏编号为 CGMCC No. 6450。本发明提供一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体杂交瘤细胞株A-4，其保藏 编号为 CGMCC No. 6449。杂交瘤细胞株D-3和A-4已于2012年9月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为杂交瘤细胞，保藏号分别为CGMCC No. 6450和CGMCCNo. 6449。本发明提供的一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体，是由杂交瘤细胞株D-3或A-4分泌获得，所述杂交瘤细胞株D-3的保藏编号为CGMCC No. 6450，所述杂交瘤细胞株A-4的保藏编号为CGMCCNo. 6449。本发明提供一种用于检测PMSG的试剂、药剂或试剂盒，其包括上述的PMSG单克隆抗体。本发明提供一种检测PMSG的方法，包括使用上述的PMSG单克隆抗体。本发明还提供了上述PMSG单克隆抗体在制备检测PMSG试剂盒中的应用。本发明提供了一种检测孕马血清促性腺激素PMSG的双抗体夹心ELISA试剂盒，其包括(I)包被PMSG单克隆抗体的酶标板；(2)酶标记的PMSG单克隆抗体；其中，包被在酶标板的PMSG单克隆抗体与酶标记PMSG单克隆抗体分别针对PMSG蛋白不同的抗原决定簇。进一步地，本发明试剂盒中包被在酶标板的PMSG单克隆抗体与酶标记PMSG单克隆抗体分别为杂交瘤细胞株D-3或A-4分泌获得。优选地，所述包被在酶标板的PMSG单克隆抗体为杂交瘤细胞株D-3分泌获得，酶标记PMSG单克隆抗体为杂交瘤细胞株A-4分泌获得。所述杂交瘤细胞株D-3的保藏编号为CGMCC No. 6450，所述杂交瘤细胞株A-4的保藏编号为CGMCC No. 6449。本发明提供的PMSG试剂盒，还包括以下试剂中的一种或多种洗涤液、酶标抗体稀释液、底物显色液、终止液、PMSG标准品。本发明的试剂盒中，酶标记PMSG单克隆抗体的标记酶为辣根过氧化物酶，具体标记方法包括如下步骤取5mg的HRP溶于ImL三蒸水,加入新鲜配制的O. lmol/L NaIO4O. 2mL，室温下避光搅拌20min，混匀后装入透析袋中，以O. 001mol/L pH 4. 4醋酸钠缓冲液4°C透析过夜，加20 μ L0. 2mol/L ρΗ9· 5碳酸盐缓冲溶液，使pH升高到9. 0-9. 5，加入含有IOmg纯化PMSG单克隆抗体IgG lmL，混匀后装入预先活化的透析袋中，以O. 05mol/L pH9. 6碳酸盐缓冲液4°C透析过夜，使辣根过氧化物酶与抗体充分结合，取出透析袋中的液体，加入4mg/mL的硼氢化钠100 μ L，置4°C还原6_8小时，加入等体积的饱和硫酸铵，4°C放置过夜，3000rpm,离心IOmin,将所得的沉淀溶于Iml O. 01mol/L的PBS中，装入透析袋中以
O.01mol/L的PBS透析过夜充分除去硫酸铵，透析24_36h，离心除去沉淀，即得纯化酶标记抗体。本发明试剂盒中，PMSG单克隆抗体的包被方法是将12. 44 μ g/mL的单克隆抗体按ΙΟΟμ L/孔加入到酶标板中，37°C孵育2h，用含0. 05%吐温-20和0. 05%叠氮化钠，ph7. 4的0. 02M磷酸盐缓冲液PBST溶液洗涤。本发明检测孕马血清促性腺激素试剂盒可以弥补国内生物检定方法的不足。仅需要几个小时就能测得结果，相对于生物检定法需要5天左右时间具有明显时间优势；相对于操作过程来说，本试验仅需要简单加样，而且一块96孔微量板可以检测80-90个样品，远 比生物法操作简单易行；本试验方案耗费材料少，用量都在微量水平，每个样品检测成本为1(Γ15元，更适合于生产应用。运用本发明检测试剂盒检测PMSG最低检测限为30mIU/ml，检测范围在3(T200mIU。本发明为生产中PMSG的快速检测提供了可靠的手段。本发明试剂盒便于操作、使用成本低、稳定性和重复性好，适合大规模推广应用。
图I为5只BALB/c系小鼠免疫PMSG后的抗血清吸光度图。图2为不同酶标板条的标准曲线，其中横坐标上的1-6分别代表标准品的浓度O、30、90、271、810、2430mIU,纵坐标为吸光度值。图3为酶标抗体不同工作浓度的标准曲线图。图4标准曲线图。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I孕马血清促性腺激素单克隆抗体的制备及鉴定I 材料I. I实验动物BALB/c小鼠购自北京维通利华试验动物公司；小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0购自中科院动物所。I. 2主要仪器和试剂酶标仪MK3购自热电公司；酶标板购自Nunc公司；细胞培养板购自Coster公司。弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA)由北京勤邦生物技术有限公司提供；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥公司；PMSG纯品、HAT和HT选择培养基等购自Sigma公司；胎牛血清购自Hyclone公司；其他常规化学试剂购自北京化学试剂公司，除特殊说明外均为分析纯。
2 方法2. I动物免疫取PMSG提纯品作为免疫原，分别用PBS (O. 01mol/L, pH7. 2)稀释至lmg/mL左右备用。免疫小鼠时，取免疫原与等量的弗氏佐剂，制成乳化剂，按照下表的免疫程序免疫6-8周龄BALB/c小鼠5只(分别编号为I#、2#、3#、4#、5# )，每只小鼠100 μ L，免疫间隔为2周。三免后第7天，小鼠尾部采血，室温静置Ih，4°C过夜，IOOOOrpm离心lOmin，收集血清，4°C保存。表IBALB/c小鼠的免疫方案
权利要求
1.一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体杂交瘤细胞株D-3，其保藏编号为CGMCCNo.6450。
2.—种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体杂交瘤细胞株A-4，其保藏编号为CGMCCNo.6449。
3.一种孕马血清促性腺激素PMSG单克隆抗体，其由杂交瘤细胞株D-3或A-4分泌获得，所述杂交瘤细胞株D-3的保藏编号为CGMCCNo. 6450，所述杂交瘤细胞株A-4的保藏编号为 CGMCC No. 6449。
4.一种用于检测PMSG的试剂、药剂或试剂盒，其包括权利要求3所述的单克隆抗体。
5.—种检测PMSG的方法，其特征在于，使用权利要求3所述的单克隆抗体。
6.检测孕马血清促性腺激素ELISA试剂盒，其包括 (1)包被PMSG单克隆抗体的酶标板； (2)酶标记的PMSG单克隆抗体； 其中，包被在酶标板的PMSG单克隆抗体与酶标记PMSG单克隆抗体分别针对PMSG蛋白不同的抗原决定簇。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述包被在酶标板的PMSG单克隆抗体与酶标记PMSG单克隆抗体分别为杂交瘤细胞株D-3或A-4分泌获得。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述包被在酶标板的PMSG单克隆抗体为杂交瘤细胞株D-3分泌获得，酶标记PMSG单克隆抗体为杂交瘤细胞株A-4分泌获得。
9.如权利要求6-8任一所述的试剂盒，其还包括以下试剂中的一种或多种洗涤液、酶标抗体稀释液、底物显色液、终止液、PMSG标准品。
10.如权利要求6-8任一所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记PMSG单克隆抗体的标记酶为辣根过氧化物酶，具体标记方法包括如下步骤取5mg的HRP溶于ImL三蒸水，加入新鲜配制的O. lmol/L NaIO4O. 2mL,室温下避光搅拌20min,混勻后装入透析袋中，以O.001mol/L ρΗ4· 4醋酸钠缓冲液4°C透析过夜，加20 μ L O. 2mol/L ρΗ9· 5碳酸盐缓冲溶液，使PH升高到9. 0-9. 5，加入含有IOmg纯化PMSG单克隆抗体IgGlmL，混匀后装入预先活化的透析袋中，以0.05mol/L pH 9. 6碳酸盐缓冲液4°C透析过夜，使辣根过氧化物酶与抗体充分结合，取出透析袋中的液体，加入4mg/mL的硼氢化钠100μ L，置4°C还原6_8小时，加入等体积的饱和硫酸铵，4°C放置过夜,3000rpm,离心IOmin,将所得的沉淀溶于Iml0.01mol/L的PBS中，装入透析袋中以0. 01mol/L的PBS透析过夜充分除去硫酸铵，透析24-36h，离心除去沉淀，即得纯化酶标记抗体。
全文摘要
本发明提供了一种孕马血清促性腺激素(PMSG)单克隆抗体杂交瘤细胞株D-3和A-4，其保藏编号为CGMCC No.6450和CGMCCNo.6449。本发明还提供PMSG双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其包括包被PMSG单克隆抗体的酶标板、酶标记的PMSG单克隆抗体，捕获抗体和检测抗体分别针对PMSG蛋白不同的抗原决定簇。本发明检测试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测定性快、定量准、重现性好等特点，并能对成品制剂进行标准校对，与现有商品化PMSG检测试剂盒相比，费用低、检测灵敏度高，且检测PMSG最低检测限为30mIU/ml，检测范围在30~200mIU，适合推广应用。
文档编号G01N33/577GK102876634SQ20121035103
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者韩国才, 苏晓倩, 邓亮 申请人:中国农业大学