专利名称：猪圆环病毒2型elisa抗原检测试剂盒及其制备方法和其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒及其制备方法和其应用。
背景技术：
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原。除了引发 PMWS外，PCV2还与仔猪先天性震颤、猪皮炎肾炎综合征、猪呼吸道综合征(PDNS)、母猪繁殖障碍等疾病相关。自1996年在加拿大首次发现PMWS以来，PCV2感染引起的相关疾病已经在全世界广泛存在。截止目前，我国养猪业受到PCV2感染的危害日益突出。因此，研制PCV2 抗原检测试剂盒的临床需求日益迫切。
目前，国内外采用的PCV2检测方法主要包括病毒分离培养、间接免疫荧光、免疫酶单层实验(MPA)、原位杂交(ISH)、聚合酶链式反应(PCR)等。尽管这些方法可以检测 PCV2，但存在使用不便，操作繁琐，耗时长，不易普及等缺陷。
CN102183650A公开了一种猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒采用双单抗结合技术检测PCV2抗体。
CN1584597A公开了一种猪圆环病毒2型抗原或抗体ELISA检测试剂盒，其中，所述的抗原检测试剂盒使用双单抗夹心法，包被的抗体为原核表达的蛋白制备所得，并仅能依靠检测孔的深浅来判断强阳性、阳性、弱阳性和阴性等定性检测结果。该文献公开的试剂盒至今还没有市场化，分析原因可能是试剂盒的特异性或敏感性不能满足市场检测的需要。 为此，急需研究一种能够高效、定量检测PCV2的方法。
CN201110440750. 7公开了一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用，该申请公开的内容全文作为本申请的参考。发明内容
本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述检测试剂盒含有包被抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、HRP标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述抗原标准品为纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒 (VLPs)的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)，所述酶底物A溶液为3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液，所述的酶底物B溶液为含有双氧水的乙酸钠缓冲溶液。
本发明的优选技术方案中，所述的包被抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板孔包被的抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗体为由纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)作为抗原免疫实验兔后纯化血清所得，所 述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的包被量为O.1 μ g-5 μ g/孔，包被稀释液为O. 05mol/L的碳酸盐缓冲液，其中，所述碳酸盐缓冲液的pH9. 6。
本发明的优选技术方案中，所述碳酸盐缓冲液的组成为，每升碳酸盐缓冲溶液中含有1. 59g Na2CO3 和 2. 93g NaHCO3。
本发明的优选技术方案中，所述封闭液选自质量浓度为1-10%的BSA、质量浓度为 1-10%的脱脂牛奶的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述样品稀释液由质量浓度为O. 1-10%牛血清白蛋白 (BSA)和含有O. 01-0. 05%NaN3的磷酸盐缓冲液(PBS)组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为 O. 01mol/L, ρΗ7· 2-7. 4。
本发明的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液为含有O. 5v/v%吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为O. lmol/L, pH7. 2-7. 4。
本发明的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为10mg/ml的3，3’ _5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)溶液；所述的酶底物B溶液为含有O. 012% (质量浓度)双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为10mg/ml，pH5. O。
本发明的优选技术方案中，所述终止液为lmol/L H2SO4溶液。
本发明的优选技术方案中，所述样品稀释液的配制为配制PH7.2-7.4、浓度为O. 01mol/L的磷酸盐缓冲液，再加入BSA和NaN3,使其浓度分别为O. 1_10%BSA和 0. 01-0. 05%NaN3,即得。
本发明的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液的配制为在0. lmol/L PBS溶液中加入吐温-20 (Tween-20)，使得吐温-20的浓度为0. 5v/v%。
本发明的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为10mg/ml的3，3’ _5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)溶液，其配制为称取IOOmg TMB，将其加入到IOml 二甲基亚砜(DMSO)中，完全溶解后，即得。
本发明的优选技术方案中，所述的酶底物B溶液为0. 012%双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为10mg/ml，pH5. 0，其配制为称取IOg乙酸钠，溶于IL纯化水，用乙酸调PH5. O,再加入400 μ I浓度为30%Η202，即得。
本发明的优选技术方案中，所述显色液用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得。
本发明的优选技术方案中，所述的试剂盒中还含有抗原标准品和阴性对照液，其中抗原标准品的配制为用样品稀释液稀释重组PCV2-Cap蛋白，将其配制至lug/ml而得；所述的阴性对照液用样品稀释液100倍稀释不含PCV2抗原的猪阴性血清配制而成。
本发明的优选技术方案中，所述重组PCV2_Cap蛋白的制备方法包括如下步骤
(I)获得本发明所述的重组杆状病毒转移载体pFastBac Dual_20RF2 ；
(2)同源重组，产生重组杆状病毒DNA ；
(3)包装，产生表达PCV2衣壳蛋白的重组杆状病毒；
(4)获得本发明制备的重组杆状病毒；
(5)培养宿主细胞，接种步骤(4)的重组杆状病毒；
(6)灭活病毒；
(7)分离纯化重组PCV2Cap蛋白。
在本发明的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒转移载体是分别在PFastBacDual转移载体的PlO启动子和Ppolh启动子(多角体蛋白启动子)之后各插入一个拷贝的PCV2Cap蛋白编码基因0RF2。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的PCV2Cap蛋白编码基因0RF2是完整的、 未经修饰的PCV2b 0RF2。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的PCV2Cap蛋白编码基因0RF2的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
在本发明的一个优选技术方案中，所述PCV2Cap蛋白编码基因0RF2分别通过 BamHI/Hind III 和 Kpn I/Xho I 双酶切插入 pFastBac Dual 转移载体中。
在本发明的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒转移载体为 pFastBacDual_20RF2。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的同源重组是将步骤(I)所述的重组杆状病毒转移载体转化进含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌感受态细胞DHlOBac中，产生重组杆状病毒DNA。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的包装是将步骤(2)产生的重组杆状病毒 DNA感染sf9细胞，包装出重组杆状病毒。
在本发明的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒为rBac_20RF2。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的步骤(5)包括利用生物反应器无血清培养基悬浮培养sf9细胞作为宿主细胞，按感染复数(MOI)为O. 001-10的量接种步骤(4)所述的重组杆状病毒后，继续培养，使PCV2Cap蛋白在sf9细胞中高效表达。
在本发明的一个优选技术方案中，所述生物反应器的培养参数设定为pH 6. 0-6. 5，温度25-30°C，溶氧30_80%，搅拌速度50_250rpm，优选所述生物反应器的培养参数设定为PH 6. 2，温度27°C，溶氧50%，搅拌速度100_180rpm。
在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤(5)包括将细胞经过5L-50L培养体积逐级放大培养后，于50L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒；或者，将细胞经过 5L-50L-500L培养体积逐级放大培养后，于500L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒。
在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤(5)的培养方法选自批式培养方法、分批补料培养方法、半连续灌注培养方法或连续灌注培养方法的任一种或其组合，优选为分批补料培养方法。
在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤(6)包括向细胞培养液中加入灭活剂二乙烯亚胺(BEI)灭活所述的重组杆状病毒，并可选的，在灭活结束后使用硫代硫酸钠中和过量的BEI。
在本 发明的一个优选技术方案中，所述步骤(7)包括收集步骤(6)灭活后的细胞培养物，通过离心或中空纤维过滤除去细胞碎片，得到含有PCV2Cap蛋白的细胞培养上清， 再通过超速离心和CsCl密度梯度离心，获得纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种利用猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤
I)将待检试样用样品稀释液1:100稀释，将其加入均匀包被抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μ 1，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀释的抗原标准品各100 μ 1，阴性对照组加入100 μ I阴性对照液，空白对照组加入100 μ I样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔；
2)加样完成后，将酶标板置37°C孵育I小时后，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加水稀释10倍制得；
3)每孔加入100 μ IHRP标记的抗PCV2_Cap蛋白的单克隆抗体的二抗，37°C孵育I 小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加水稀释10倍制得；
4)每孔加入100 μ I显色液，避光显色5-10分钟后，每孔再加入50 μ I终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；
5)将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值0D45(lnm；
6)结果计算与判定
其中，定性结果的判定Cut off (CO值)=阴性对照光吸收值OD45tlnmX 2.1倍，样品值=样品光吸收值0D45tol/C0值，其中，样品值>1为阳性；样品值彡I为阴性；或者，
定量结果的判定以2为底OD值的对数为X轴，以2为底标准品的稀释倍数为Y 轴，利用“EXCEL”软件获得线性曲线及方程式，将以2为底样品OD值的对数带入曲线方程式计算出样品的浓度。
本发明的另一目的在于提供本发明的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒用于检测猪群PCV2抗原或PCV2疫苗产品的应用。
本发明的优选技术方案中，所述的PCV2抗原选自猪群PCV2感染、PCV2疫苗抗原的任一种。
本发明的抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗体的制备方法，包括下述步骤
1)将前述纯化的PCV2_Cap蛋白常规免疫实验兔，当兔血清ELISA效价达到1:1000 以上时,采集兔血清；
2)将步骤I)制得的兔血清经硫酸铵沉淀，纯化，制得纯化的抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗体；
3)在步骤2)制得的抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗体中加入0. 1-10%牛血清白蛋白、0. 1-10%酪蛋白和50%的中性甘油，测定工作浓度后，-20°c保存备用。
本发明的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗PCV2_Cap蛋白的单克隆抗体的二抗可以商购，或按照本领域的常规方法制备，如参照文献(曹雪涛，精编免疫学实验指南[M]. 北京科学出版社，2009;酶标记抗体一 HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法，[EB/0L]http://www. seekbio. com/biotech/Immunity/2007/2007831543528. html2007-8-3.)公开的方法制备。作为示例，本发明的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗 PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗的制备方法，包括下述步骤
1)将前述纯化的PCV2_Cap蛋白常规免疫Balb/c小鼠，当小鼠血清ELISA效价达到1:10000以上时，取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)以5X107 =IXlO7的比例进行融合；用 HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞；用ELISA方法和间接免疫荧光(IFA)方法进行阳性杂交瘤细胞的筛选；将筛选到的阳性杂交瘤细胞经三次有限稀释得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株及抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体；
2)将步骤1)制得的抗PCV2_Cap蛋白的单克隆抗体经硫酸铵沉淀，纯化，制得纯化的抗PCV2_Cap蛋白的单克隆抗体；
3)用改良的过碘酸钠氧化法对步骤2)制得的纯化的抗PCV2_Cap蛋白的单克隆 抗体进行HRP标记，制得辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二 抗；
4)在辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗PCV2_Cap蛋白的单克隆抗体的二抗中加入 O. 1-10%牛血清白蛋白、O. 1-10%酪蛋白和50%的中性甘油，测定工作浓度后，-20°C保存 备用。
本发明的浓缩洗涤液为10倍洗涤液，检测时需加水稀释10倍，制得洗涤液。
本发明的显色液用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得，其中，酶底物A溶 液为10mg/ml的3，3’ -5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)溶液；酶底物B溶液为O. 012% (质量浓 度)双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为10mg/ml，pH5. O。
本发明所述的抗原标准品的配制为用样品稀释液稀释重组PCV2_Cap蛋白至Iug/ ml制成。
本发明所述的阴性对照液用样品稀释液100倍稀释不含PCV2抗原的猪阴性血清 配制而成。
本发明所述的空白对照液为样品稀释液。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/ 体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本 发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量 百分比。
与现有技术相比，本发明的试剂盒具有下述有益技术效果
1、经试验验证，本发明采用了中国流行的PCV2b亚型的编码Cap蛋白的基因序列， 针对性地用于检测和预防中国流行的猪圆环病毒病；
2、本发明所述重组杆状病毒含有双启动子(多角体蛋白启动子和PlO启动子)，可 表达双拷贝的Cap蛋白编码基因，显著提高了蛋白的表达效率；并且，插入的外源基因所表 达的Cap蛋白不含多余序列，能有效形成病毒样颗粒(VLPs)，保持了病毒抗原的空间构象 结构，提高了表达蛋白的免疫原性，且生产的抗原含量高；
3、本发明的猪圆环病毒2型(PCV2 )ELISA抗原检测试剂盒采用由形成病毒样颗粒 (VLPs)的PCV2-Cap蛋白研制的多克隆抗体制备反应板，抗PCV2_Cap蛋白的单抗进行HRP 酶标记后制备二抗，进而组成用双抗夹心法酶联免疫吸附实验检测猪圆环病毒2型抗原的 试剂盒。本发明的试剂盒除具有ELISA试剂盒的优点外，还克服了抗原空间构象问题所致 的特异性低和二抗问题所致的灵敏度低等缺陷，显著提高了检测的特异性和灵敏度。
4、本发明的试剂盒里还配备了抗原标准品，可以检测到样品中PCV2_Cap蛋白的 准确含量，特别适合用于PCV2基因亚单位疫苗的定量检测，最高检测到抗原标准品的浓度 为 4ng/ml。
5、本发明试剂盒可以定性何定量检测PCV2，其检测特异性达100%，灵敏度高达 4ng/ml，可用于猪群PCV2抗原检测和PCV2疫苗产品的定量检测。
图1本发明的重组杆状病毒转移载体构建流程图。
图2本发明的重组杆状病毒构建流程图。
图3单拷贝、双拷贝重组bacmid PCR鉴定图。其中，图3A是双拷贝重组bacmid 鉴定结果图，I是阴性对照，2和3是marker，4是PUC M13F/R引物。图3B是单拷贝重组 bacmid鉴定结果图，I是阴性对照，2和3是marker，4是PUC M13F/R引物。
图4本发明表达的Cap蛋白形成病毒样颗粒(VLPs)电镜图片。
图5本发明试剂盒的制备工艺流程图。
图6实施例3制得的PCV2_Cap蛋白SDS-PAGE分析图，其中，M是Marker，I是纯 化的PCV2-Cap蛋白。
图7实施例8中由标准品绘制的标准曲线图。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方 案，并非限定本发明的实质。
实施例1 重组杆状病毒的构建
使用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒，根据GENBANK公布的基因序列(NCBI登 陆号EU340257.1)设计以下引物
PlTCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG
P2 GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC
P3 TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG
P4 GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC
以PCV2b株病毒0RF2序列为模板(该模板根据已公布的PCV2b 0RF2序列登陆号 EU340257.1合成获得)，PI, P2扩增PCV20RF2基因，并将该基因克隆入pMD_19T载体中，获 得重组载体PMD-19T-0RF2-1，以PCV2b株病毒0RF2序列为模板，P3，P4扩增PCV20RF2基 因，并将该基因克隆入PMD-19T载体中，获得重组载体pMD-19T-0RF2-2。
通过BamH I和Hind III双酶切pMD_19T-0RF2_l，将0RF2基因克隆入转移 载体pFastBac Dual中，构建载体pFastBac Dual_0RF2 ；通过Kpn I和Xho I双酶切 PMD-19T-0RF2-2,将0RF2基因克隆入转移载体pFastBac Dual_0RF2中，构建包含双拷 贝0RF2基因的重组转移载体pFastBac Dual_20RF2，将该重组转移载体转化大肠杆菌 DHlOBac，获得插入双拷贝0RF2基因的重组质粒bacmid-20RF2 (PUC M13 F/R引物鉴定 bacmid结果见图3A)，将该重组质粒bacmid_20RF2转染入昆虫细胞Sf9中，获得重组杆状 病毒rBac-20RF2 (0RF2序列如SEQ ID NO 1所述)，扩增重组杆状病毒rBac_20RF2作为 种毒备用。将重组转移载体pFastBac Dual_0RF2转化大肠杆菌DHlOBac，获得插入单拷贝 0RF2基因的重组质粒bacmid-0RF2，将该重组质粒bacmid_0RF2转染入昆虫细胞Sf9中，获 得重组杆状病毒rBac-0RF2(0RF2序列如SEQ ID NO :1所述)，扩增重组杆状病毒rBac_0RF2 备用(PUC M13F/R引物鉴定bacmid结果见图3B)。
实施例2 昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养及Cap蛋白的表达定量
在IOOOml摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3_4天，待浓度长到3_5X 106cells/ml， 活力大于95%时，将细胞接种到5L的生物反应器中，接种浓度为3-8X105cells/ml。当细胞浓度达到3-5X106cells/ml时，将细胞接种到50L生物反应器中，待细胞长至浓度为 3-5X106cells/ml，接种至Ij 500L生物反应器中，待细胞浓度达到2-8X 106cells/ml时，接种重组病毒rBac-20RF2或rBac_0RF2，感染复数(Μ0Ι)为O. 001-10，反应器培养条件为pH 6. 0-6. 5、温度25-27°C、溶氧30_80%、搅拌速度100_180rpm。考虑到细胞培养的最适条件， 优选的PH 6. 2、细胞培养阶段温度设定27°C、溶氧50%、搅拌速度100_180rpm。在感染之后继续培养5-9天后，加入终浓度为5mmol/L的BEI，37°C作用24h后，加lmol/L Na2S2O3至终浓度5mmol/L终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置2-8°C保存疫苗原液。
制备的疫苗抗原中所含的Cap蛋白通过ELISA定量检测。用包被缓冲液稀释纯化的捕获抗体兔抗PCV2-Cap蛋白多抗至合适浓度，每孔100μ 1，4°C过夜，PBST洗涤三次， 1%BSA封闭I小时。加入不同浓度的抗原标准品(通过CsCl密度梯度离心纯化的形成病毒样颗粒VLPs的Cap蛋白)和梯度稀释待检样品，37°C孵育I小时，PBST洗三次。每孔加入检测抗体-抗PCV2Cap蛋白的单克隆抗体，37°C孵育I小时，PBST洗三次。每孔加入二抗-HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C孵育I小时，PBST洗三次。TMB显色10分钟，2MH2S04终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中Cap蛋白的量。
使用三种不同MOI (O. 01、0. 1、1)接种两种不同的病毒，分别于接种后7-11天取样定量分析培养上清中的目的蛋白含量，结果见表I。
表I不同感染复数接种两种病毒蛋白表达量(μ g/ml)分析
权利要求
1.一种猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述检测试剂盒含有包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、HRP标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述抗原标准品为纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)，所述酶底物A溶液为3，3’ -5，5’ -四甲基联苯胺溶液；所述的酶底物B溶液为含有双氧水的乙酸钠缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体为由纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)作为抗原免疫实验兔后纯化血清所得，所述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的包被量为O.1 μ g-5 μ g/孔，包被稀释液为O. 05mol/L的碳酸盐缓冲液，其中，所述碳酸盐缓冲液的PH为9. 6。
3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述碳酸盐缓冲液的组成为，每升碳酸盐缓冲溶液中含有1. 59g Na2CO3和2. 93g NaHC03。
4.根据权利要求1-3任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述封闭液选自质量浓度为1-10%的牛血清白蛋白(BSA)或质量浓度为1-10%的脱脂牛奶的任一或其组合。
5.根据权利要求1-4任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述样品稀释液由质量浓度为O. 1-10%牛血清白蛋白和含有O. 01-0. 05%叠氮化钠(NaN3)的磷酸盐缓冲液组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为O. 01mol/L, pH7. 2-7. 4。
6.根据权利要求1-5任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述浓缩洗涤液为含有O. 5% (v/v)吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为O.lmol/L, ρΗ7· 2-7. 4。
7.根据权利要求1-6任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述的酶底物A溶液选自浓度为10mg/ml的3，3’ -5，5’ -四甲基联苯胺溶液；所述的酶底物B溶液含有质量浓度为O. 012%双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为IOmg/ml, pH 为 5. O。
8.根据权利要求1-7任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述终止液为lmol/L的H2SO4溶液。
9.根据权利要求1-8任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，其中，抗原标准品的配制为用样品稀释液稀释重组PCV2-Cap蛋白至lug/ml制成。
10.根据权利要求1-9任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述的试剂盒中还含有阴性对照液，所述的阴性对照液为用样品稀释液100倍稀释不含PCV2抗原的猪阴性血清配制而成。
11.根据权利要求1-10任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述重组PCV2-Cap蛋白的制备方法包括如下步骤 Cl)获得重组杆状病毒转移载体PFastBac Dual_20RF2，其中，所述载体是分别在PFastBac Dual转移载体的PlO启动子和Ppolh启动子(多角体蛋白启动子)之后各插入一个拷贝的PCV2 Cap蛋白编码基因0RF2，优选所述的PCV2 Cap蛋白编码基因0RF2是完整的、未经修饰的PCV2b 0RF2,更优选所述PCV 2Cap蛋白编码基因0RF2分别通过BamHI/Hind III和Kpn I/Xhο I双酶切插入pFastBac Dual转移载体中; (2)同源重组，产生重组杆状病毒DNA； (3)包装，产生表达PCV2衣壳蛋白的重组杆状病毒； (4)获得重组杆状病毒rBac-20RF2； (5)培养宿主细胞，接种步骤(4)的重组杆状病毒，使其表达Cap蛋白，并自我组装形成病毒样颗粒(VLPs)； (6)灭活病毒； (7)分离纯化重组PCV2Cap蛋白。
12.根据权利要求11所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，其中，所述的PCV2Cap蛋白编码基因0RF2的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
13.—种利用权利要求1-12任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤 1)将待检试样用样品稀释液1:100稀释，将其加入均匀包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μ 1，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀释的抗原标准品各100 μ I，阴性对照组加入100 μ I阴性对照液，空白对照组加入100 μ I样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔； 2)加样完成后，将酶标板置37°C孵育I小时后，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加水稀释10倍制得； 3)每孔加入100μIHRP标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗，37°C孵育I小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加水稀释10倍制得； 4)每孔加入100μ I显色液，避光显色5-10分钟后，每孔再加入50 μ I终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得； 5)将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值OD45tol； 6)结果计算与判定 其中，定性结果的判定Cut off (CO值)=阴性对照光吸收值OD45tlnmX2.1倍，样品值=样品光吸收值OD45tlmZCO值，其中，样品值>1为阳性；样品值彡I为阴性；或者， 定量结果的判定以2为底OD值的对数为X轴，以2为底标准品的稀释倍数为Y轴，利用“EXCEL”软件获得线性曲线及方程式，将以2为底样品OD值的对数带入曲线方程式计算出样品的浓度。
14.权利要求1-12任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒用于检测PCV2抗原或PCV2疫苗产品的应用，优选所述的PCV2抗原选自猪群PCV2感染、PCV2疫苗抗原的任一种。
全文摘要
本发明涉及一种猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒及其制备方法和其应用。其中，所述检测试剂盒含有包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、HRP标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述抗原标准品为纯化的重组猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)。本发明试剂盒的特异性达100%，灵敏度高达4ng/ml，可用于猪群PCV2抗原检测和PCV2疫苗产品的定量检测。
文档编号G01N33/577GK103033622SQ20121035655
公开日2013年4月10日 申请日期2012年9月21日 优先权日2011年12月26日
发明者廖园园, 漆世华, 朱薇, 李建, 秦伟, 王威, 熊媛媛, 张萍, 秦红刚, 李伟, 谢红玲, 温文生, 王桢桢, 靖志强, 吴玉石, 韩兴, 刘洁 申请人:武汉中博生物股份有限公司