专利名称：测定水中As (III)的适配体-纳米金共振瑞利散射光谱法的制作方法
技术领域：
本发明涉及分析化学，具体是测定水中As (III)的适配体-纳米金共振瑞利散射光谱法。
背景技术：
砷是重要的环境污染物之一，以原矿或氧化物的形式逸散到周围环境中，对大气、 水体、农作物等造成污染。砷可从呼吸道、消化道及皮肤进入人体，进入体内的砷排出缓慢， 可长期蓄积，对人类健康造成了很大的威胁。在环境和生物样品中，砷主要以As(III)和 As(V)的形式存在，且三价砷的毒性大于五价砷，世界卫生组织推荐10 ng/mL作为饮用水的最新标准。因此，建立一种高灵敏度、高选择性检测砷离子的方法，对于环境保护和人类健康都具有很重要的意义。目前，砷的分析方法主要有比色法，电化学法，荧光法，化学发光法，原子吸收光谱法，电感耦合等离子体质谱法等。但这些方法有的需要昂贵且复杂的仪器设备，有的方法复杂，有的灵敏度欠佳，有的选择性欠佳，使得这些方法的使用受到了一定的限制。
核酸适配体是一段由十几个或几十个核苷酸组成的单链寡聚核苷酸。由于核酸适配体具有精确识别、易体外合成与修饰、稳定性好等特性，能够特异性结合靶物质，已用于分析和临床检验。共振瑞利散射光谱法是一种简便、快速、灵敏的光谱分析新技术，在核酸、 蛋白质、小分子分析等领域获得了较好的应用。它与适配体反应结合，已建立了一些高灵敏高选择性的共振瑞利散射光谱法。纳米金具有稳定性好、生物相容性好及共振瑞利散射效应，在适配体分析和共振瑞利散射光谱分析已有应用。据我们所知，有关适配体修饰纳米金共振瑞利散射光谱法检测砷离子未见报道。发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的不足，而提供一种简单快速测定水中As (III) 的适配体-纳米金共振瑞利散射光谱法。
实现本发明目的的技术方案是 应用适配体-纳米金共振瑞利散射光谱法测定As (III)的方法，包括如下步骤(1)制备纳米金适配体探针(AussDNA):取序列为5’ -TTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGG TACTTCTTCATCG -3’的单链DNA (ssDNA)，用二次蒸馏水溶解至浓度为390 nmol/L0移取57.9μ g/mL纳米金6. O mL于锥形瓶中，在搅拌条件下缓慢加入1. 8mL 390 nmol/L ssDNA 溶液，加完后继续搅拌15min，密封4°C保存。以ssDNA计算，该AussDNA浓度为90 nmol/ L ；(2)制备As(III)标准溶液体系取5支刻度试管，依次移取50 300μ L 90 nmol/ L AussDNA，100 250yL 50 mmol/L pH 8.2的4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠缓冲溶液(HEPES， 含150 mmol/L NaCl)，再分别加入I 60 μ L的5760 ng/mL As (III)标准溶液，混勻，置于超声波仪上超声15 min，再加入20 80 μ L 2. O mo I/L NaCl溶液，用二次蒸馏水定容至1. 5 mL,混勻；
(3)制备空白对照溶液用步骤(2)的方法不加As(III)标准液制备空白对照溶液；
(4)分别取按步骤(2)、(3)制备的As(III)标准溶液及空白对照溶液适量，置于比色皿中，于荧光分光光度计上，同步扫描各溶液获得共振瑞利散射光谱。278nm波长处测定As(III)标准溶液的共振瑞利散射峰强度/，并测定其空白对照溶液的共振瑞利散射峰强度值(Z0)，计算 Λ/ 二1-10 ;
(5)以Λ/对As(III)的浓度关系做工作曲线；
(6)被测物样品测定取含有As(III)的被测物水样；然后移取一定量替换As (III)标准溶液，按步骤(2) (4)操作。算出被测物的Λ/样=/样-J0 ；
⑴根据样品测得的八/#，查步骤(5)的工作曲线，计算出被测物水样中As(III)的浓 度。实现本发明的原理是ssDNA和纳米金可通过电荷引力、范德华力、及分子间作用力相互结合形成较稳定的Ay_ssDNA探针,保护金纳米粒子不被较高浓度的盐聚集。在pH8.2 HEPES缓冲溶液中，当溶液中存在As(III)时，As(III)与AussDNA探针中的ssDNA形成稳定的As-ssDNA复合物,释放出的纳米金在NaCl作用下聚集形成粒径较大的聚集体,导致共振瑞利散射峰强度增强。随着As (III)浓度增大，AussDNA探针释放出来的纳米金越多，纳米金聚集体越多，共振瑞利散射峰强度增强。据此可建立检测As (III)的适配体纳米金共振瑞利散射光谱法。本发明的优点是与已有的方法相比，本测定方法的仪器简单，操作简便，快速，灵敏度高、选择性好。
图1为本发明实施例测定As (III)的部分共振瑞利散射光谱图。图中a: 12 nmol/L AussDNA - 200 μ L pH 8.2 HEPES - 0. 05 mol/L NaCl ；b: a+76.8 ng/mL As (III)；
c: a+230. 4 ng/mL As (III)
具体实施例方式实施例
测定水中As (III)的适配体-纳米金共振瑞利散射光谱法，包括如下步骤
(1)制备纳米金适配体探针(AussDNA):取序列为5’ -TTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCG -3’的单链DNA (ssDNA)，用二次蒸馏水溶解至浓度为390 nmol/L0移取57.9 μ g/mL纳米金6. O mL于锥形瓶中，在搅拌条件下缓慢加入1. 8mL 390 nmol/L ssDNA溶液，加完后继续搅拌15min，密封4°C保存。以ssDNA计算，该AussDNA浓度为90 nmol/L ；
(2)制备As(III)标准溶液体系取5支刻度试管，依次移取200μ L 90 nmol/LAussDNA, 200 μ L 50 mmol/L pH 8.2的4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠缓冲溶液(HEPES，含150mmol/L NaCl)，再分别加入1、10、20、30、60 μ L的5760 ng/mL As(III)标准溶液，混匀，置于超声波仪上超声15 min，再加入40 μ L 2. O mol/L NaCl溶液，用二次蒸馏水定容至1. 5mL,混勻；(3)制备空白对照溶液用步骤(2)的方法不加As(III)标准溶液制备空白对照溶液；(4)分别取按步骤(2)、(3)制备的As(III)标准溶液及空白对照溶液适量，置于比色皿中，于日立F-7000型荧光分光光度计上，设参数PMT电压为450v，激发狭缝与发射狭缝均为5nm，激发波长等于发射波长的条件下同步扫描各溶液获得共振瑞利散射光谱。278nm 波长处测定As(III)标准溶液的共振瑞利散射峰强度I，并测定其空白对照溶液的共振瑞利散射峰强度值(Z0)，计算Λ J =1-10 ；(5)以Λ/对As(III)的浓度(单位为ng/mL)关系做工作曲线，其线性回归方程为Λ/ =8.1C + 21 ；(6)被测物样品测定取来源不同的含有As(III)的被测物废水样3个；然后各移取 1.0 mL替换As(III)标准溶液，平行测定3份，按步骤(2) (4)操作。算出被测物的Λ/ 样=/样_/0，各水样的Λ/样平均值分别为75、96、102 ；⑴根据样品测得的八/#，查步骤(5)的工作曲线，计算出被测物水样中As(III)的浓度。
本发明实施例测定水样3个，As(III)含量分别为6. 7 ng/mL、9. 3 ng/mLUO. O ng/Π Τ, η
本发明实施例测定As(III)的线性范围为3.8 230.4 ng/mL，检出限(3 α )为1. 9 ng/mL
本发明检测方法的验证取已知As(III)的水样，加入相近浓度的As(III)标准溶液，操作步骤如下(1)制备纳米金适配体探针(AussDNA):取序列为5’ -TTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGG TACTTCTTCATCG -3’的单链DNA (ssDNA)，用二次蒸馏水溶解至浓度为390 nmol/L。移取57.9μ g/mL纳米金6. O mL于锥形瓶中,在搅拌条件下缓慢加入1. 8mL 390 nmol/L ssDNA 溶液，加完后继续搅拌15min，密封4°C保存。以ssDNA计算，该AussDNA浓度为90 nmol/ L ；(2)制备As(III)标准溶液体系取5支刻度试管，依次移取200μ L 90 nmol/L AussDNA, 200 μ L 50 mmol/L pH 8.2的4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠缓冲溶液(HEPES，含150 mmol/L NaCl)，再分别加入1、10、20、30、60 μ L的5760 ng/mL As(III)标准溶液，混匀，置于超声波仪上超声15 min，再加入40 μ L 2. O mo I/L NaCl溶液，用二次蒸馏水定容至1. 5 mL,混勻；(3)制备空白对照溶液用步骤(2)的方法不加As(III)标准溶液制备空白对照溶液;(4)分别取按步骤(2)、(3)制备的As(III)标准溶液及空白对照溶液适量，置于比色皿中，于日立F-7000型荧光分光光度计上，设参数PMT电压为450v，激发狭缝与发射狭缝均为5nm，激发波 长等于发射波长的条件下同步扫描各溶液获得共振瑞利散射光谱。278nm 波长处测定As(III)标准溶液的共振瑞利散射峰强度I，并测定其空白对照溶液的共振瑞利散射峰强度值(Z0)，计算Λ J =1-10 ；(5)以Λ/对As(III)的浓度(单位为ng/mL)关系做工作曲线，其线性回归方程为 Δ/=8. 1^+21 ；(6)回收率测定于刻度试管中，准确移取已知As(III)浓度为6.7 ng/mL,9. 3 ng/mL、10. O ng/mL的水样各0. 5 mL,平行测定三份,再分别加入100 ng/mL As(III)标准溶液50μ ,混匀，按步骤(2)、(4)操作，测定Λ J平均值分别为66. 0,72. 9,74. 5，计算所测得 As (III)的浓度为 5. 56 ng/mL,6. 41 ng/mL、6. 60 ng/mL，回收率分别为 99. 8%、99. 7%、99. 0%，相对标准偏差分别为2. 9%、 3. 2%、2. 6%，符合分析误差的要求，说明该方法准确可靠。
权利要求
1.一种测定水中As (III)的适配体-纳米金共振瑞利散射光谱法，其特征是包括如下步骤 (1)制备纳米金适配体探针(AussDNA):取序列为5’-TTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCG -3’的单链DNA (ssDNA)，用二次蒸馏水溶解至浓度为390 nmol/L ;移取57. 9μ g/mL纳米金6. O mL于锥形瓶中,在搅拌条件下缓慢加入1. 8mL 390 nmol/L ssDNA溶液，加完后继续搅拌15min，密封4°C保存；以ssDNA计算，该AussDNA浓度为90 nmol/L ； (2)制备As(III)标准溶液取5支刻度试管，依次移取200μ L 90 nmol/L AussDNA，.200 μ L 50 mmol/L pH 8.2的4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠缓冲溶液(HEPES，含150 mmol/L恥(1)，再分别加入1、10、20、30、60 yL的5760 ng/mL As(III)标准溶液，混匀，置于超声波仪上超声15 min，再加入40 μ L 2. O mo I/L NaCl溶液，用二次蒸馏水定容至1. 5 mL，混匀； (3)制备空白对照溶液用步骤(2)的方法不加As(III)标准溶液制备空白对照溶液； (4)分别取按步骤(2)、(3)制备的As(III)标准溶液及空白对照溶液适量，置于比色皿中，于荧光分光光度计上，设定仪器参数在激发波长等于发射波长的条件下同步扫描各溶液获得共振瑞利散射光谱；278nm波长处测定As (III)标准溶液的共振瑞利散射峰强度I，并测定其空白对照溶液的共振瑞利散射峰强度值(Jtl)，计算Λ J =1-10 ； (5)以Λ/对As(III)的浓度关系做工作曲线； (6)被测物样品测定取含有As(III)的被测物水样；然后移取一定量替换As (III)标准溶液，按步骤(2) (4)操作，算出被测物的Λ/样=Im-10 ； ⑴根据样品测得的八/#，查步骤(5)的工作曲线，计算出被测物水样中As(III)的浓度。
全文摘要
本发明公开了一种测定水中As(III)的适配体-纳米金共振瑞利散射光谱法，主要是利用ssDNA和纳米金相互结合形成较稳定的AussDNA探针，保护金纳米粒子不被较高浓度的盐聚集。在pH8.2HEPES缓冲溶液中，当溶液中存在As(III)时，As(III)与AussDNA探针中的ssDNA形成稳定的As-ssDNA复合物，释放出的纳米金在NaCl作用下聚集形成粒径较大的聚集体，导致共振瑞利散射峰强度增强。随着As(III)浓度增大，AussDNA探针释放出来的纳米金越多，纳米金聚集体越大，共振瑞利散射峰强度增强。据此可建立测定As(III)的适配体纳米金共振瑞利散射光谱法。本测定方法的仪器简单，操作简便，快速，灵敏度高、选择性好。
文档编号G01N21/64GK102998288SQ20121036430
公开日2013年3月27日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者蒋治良, 梁爱惠, 唐美玲 申请人:广西师范大学