专利名称：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及脂质运载蛋白含量检测试剂盒，尤其涉及一种人体内中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)含量的检测试剂盒及其制备方法，本发明进一步涉及该检测试剂盒在检测人体内NGAL含量的使用方法，属于人体内NGAL含量的检测领域。
背景技术：
近年研究发现，脂质运载蛋白家族中的一个新成员一中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocal in, NGAL),与急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)及各种原因引起的慢性肾脏病(chronic kidneydisease, CKD)密切相关，是预测AKI的一个新型标记物，同时也是监测CKD进展和肾功能损害的生物学指标。NGAL是脂质运载蛋白家族的成员之一，于1993年由Kjeldsen等在人类中性粒细胞中发现和分离出来，它的大鼠、小鼠种间同源基因分别为α 2微球相关蛋白和24ρ3蛋白。在生物体内NGAL有分子量为25kDa、自身聚合46kDa同源二聚体或与MMP-9聚合形成135kDa异源二聚体三种存在方式。NGAL具有由8条β折叠相互作用而形成的β自折叠桶结构，其底部内侧的疏水核可以结合并转运亲脂性配体，这一结构特点决定了 NGAL的生物活性。在β -折叠桶封闭端的β 4- β 5间有游离的巯基(Cys87)，这为NGAL结合MMP-9前体奠定了结构基础。目前认为NGAL蛋白能运输介导炎症反应的一些亲脂性分子，如血小板活化因子(PAF)、白三烯B4(LTB4)和脂多糖(LPS)等；调节MMP-9活性，并可能参与清除炎症介质，调节免疫反应，抑制细胞凋亡以及肿瘤的发生发展、浸润转移等过程。NGAL还通过与含铁的铁载体结合，形成NGAL-铁载体-铁复合物，参与肾脏的发生、发展及修复过程。在正常的生理状态下，除了中性粒`细胞以外，NGAL在人类很多组织如支气管、胃、小肠、胰腺、肾脏等的上皮细胞中有低水平表达。而在病理状态下，这些组织的上皮细胞则有大量NGAL表达，特别是在损伤的近端肾小管上皮细胞中。在寻找AKI早期诊断标记物的研究中，人们发现NGAL是一个很好的预测及诊断指标。有学者在急性缺血再灌注和顺钼诱导的AKI小鼠模型中，发现在损伤发生数小时之内即可检测到NGAL的表达明显增高。美国Cincinnati儿童中心的研究发现,在接受心脏分流术的71例儿童患者中，其中20例术后发生急性肾功能衰竭的患儿术后2h尿NGAL水平即明显升高，而其血肌酐的升高则发生在术后l-3d，提示尿NGAL是缺血性肾损伤的一个早期、敏感指标。后来不少类似的研究均得到同样的结论，即AKI时血、尿NGAL水平均升高，尿NGAL水平升高更为显著。并且NGAL升高较早期肾脏损伤的其他指标如肾脏损伤分子(kidney injury molecularl, KIM-1) > Cyr61 (cystein richprotein61)、β 2-微球蛋白等出现得要早。同时，NGAL水平与肾脏损伤程度呈正相关，血和尿NGAL可作为诊断AKI早期、敏感、特异性的早期生物学标记物，并在一定程度上可以反映AKI严重程度及判断预后。目前NGAL的检测方法有酶联免疫法、放射免疫法、Western-blotting、化学发光法以及胶乳免疫比浊法。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大；放射免疫法存在着环境污染问题lestern-blotting操作复杂，测定精密度低；而化学发光法灵敏度虽高，但测定线性范围较小且检测成本较高，需要特定化学发光检测仪，这些原因导致其应用范围较小；胶乳免疫比浊法也是测定人血浆或尿液中NGAL浓度的常用方法，它与上述其他几种方法相比较，存在操作简单、灵敏度高、线性范围宽、无污染、应用范围广等显著的特点。因此，胶乳免疫比浊法有着极大的研究价值，但是目前市场上的胶乳免疫比浊法检测试剂盒存在着检测不到NGAL/MMP-9复合物、抗干扰能力差、特异性低、试剂稳定性不好或检测线性范围窄等问题，有待改进。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒;本发明的目的之二是提供一种制备所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，由彼此独立的试剂I和试剂II组成；所述试剂I的组分包括生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂、阻断剂、螯合剂和水；所述试剂II的组分包括包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂和水；其中，所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体既能和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗原结合又能和MMP-9/NGAL复合物相结合。优选的，本发明中所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体通过亲和层析方法筛选得到；优选的，所述的筛选方法包括 (I) MMP-9亲和层析柱的制备将MMP-9蛋白与压积CNBr_Sepharose4B混合,依次经过交联、清洗、封闭残留的活化基团、再次清洗、装柱、平衡，得到MMP-9亲和层析柱；(2)MMP-9/NGAL复合物亲和层析柱的制备将蛋白NGAL溶液过MMP-9亲和层析柱；然后用磷酸缓冲液洗脱多余的NGAL蛋白；(3)亲和层析将NGAL抗体溶液通过所制备的亲和层析柱，去除非特异性吸附后进行解吸，分段收集解吸液，充分透析掉解吸液中的TB，真空冷冻干燥，即得。其中，步骤(I)中CNBr_Sepharose4B与5_7mg蛋白MMP-9按照每毫升压积CNBr-Sepharose4B与5_7mg蛋白MMP-9的比例进行混合；步骤(I)中所述的封闭方式加等质量的O. lmol/L乙醇胺-HC14°C摇动I小时。优选的，步骤(2)中将蛋白NGAL配制成2mg/mL的溶液，用NGAL蛋白溶液以ImL/min的流速过MMP-9亲和层析柱；然后用O. lmol/L pH8. O磷酸缓冲液以lmL/min的流速洗脱多余的NGAL蛋白；优选的，步骤(3)中将NGAL抗体浓度调整至600ug/mL，以6mL/小时流速通过所制备的亲和层析柱、再依次用lmol/L NaCl-TB,O. 5% NP_40_TB、TB和双蒸水清洗以去除非特异性吸附；然后用3mol/L KSCN6mL/小时进行解吸；紫外检测分段收集解吸液。本发明所述包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备方法包括
(I)制备羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液称取粒径为105_145nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入磷酸盐缓冲液分散，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺和硫代NHS，室温下搅拌反应；离心弃上清，再用磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳，得到羧化改性聚苯乙烯胶乳；⑵NGAL抗体溶液的制备将筛选得到的既能和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗原结合又能和MMP-9/NGAL复合物相结合的NGAL单克隆抗体或多克隆抗体用去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；(3)包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备步骤⑵所制备的抗体溶液用磷酸缓冲液稀释后加入羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液，在室温下搅拌反应，终止反应后，离心弃上清，洗涤沉淀，即得。本发明中所述的的胶乳颗粒为粒径为105_145nm的中等粒径的胶乳颗粒，采用该粒径范围内的胶乳颗粒既可以解决小粒径胶乳检测灵敏度不够的问题，还可以解决大粒径胶乳检测线性范围小的问题，同时还可以避免大粒径胶乳在长时间存放过程中下沉导致的产品稳定性不好的问题。而且采用一种粒径的胶乳颗粒制备检测试剂盒减少了试剂盒生产过程中的工序，即节省了成本又避免了过多工序对产品品质的影响。为了达到更好的检测效果，每I升试剂I中各组分的用量为生物缓冲剂5-100g，表面活性剂O. 5-20mL，促凝剂2-50g，防腐剂O. 02_lmL，稳定剂l_60g，阻断剂1-lOmL，螯合剂O. 05-5g，余量为水；每I升试剂II中各组分的用量为包被NGAL抗体的胶乳颗粒O.1-1Og,生物缓冲剂l-100g，螯合剂O.1-1Og,表面活性剂O. 05-3mL,防腐剂O. 02-lmL,助悬剂5_50mL，封闭剂5_50g，稳定剂50-150g，余量为水。进一步优选的，每I升试剂I中各组分的用量为生物缓冲剂7_20g，表面活性剂Ι-lOmL，促凝剂10-30g,防腐剂O. 1-0. 5mL，稳定剂5_15g，阻断剂3_6mL，螯合剂O. Ι-lg，余量为水；每I升试剂II中各组分的用量为包被NGAL抗体的胶乳颗粒O. 5_5g，生物缓冲剂5-30g，螯合剂O. 5-4g，表面活性剂O. 5-2mL,防腐剂O. 1-0. 5mL，助悬剂10_40mL，封闭剂7_15g，稳定剂80-120g，余量为水。最优选的，每I升试剂I中各组分的用量为生物缓冲剂12g，表面活性剂4mL，促凝剂15g，防腐剂O. 25mL，稳定剂10g，阻断剂5mL，螯合剂O. 4g，余量为水；每I升试剂II中各组分的用量为包被NGAL抗体的胶乳颗粒1.1g,生物缓冲剂llg，螯合剂2g，表面活性剂1. 5mL，防腐剂O. 25mL，助悬剂20mL，封闭剂10g，稳定剂IOOg,余量为水。试剂I或试剂II中所述的生物缓冲剂是能够用于维持一定PH值的各种生物缓冲齐U，例如可以是三羟甲基氨基甲烷(TriS)、三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸(HEPES)、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、哌嗪-1，4- 二羟基丙磺酸(POPSO)、3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)等各种常用生物缓冲液，为了达到更好的检测效果，试剂I中所述的生物缓冲剂优选为三羟甲基氨基甲烷(Tris)，试剂II中所述的生物缓冲剂优选为3-(N-吗啉)丙磺酸。试剂I或试剂II中所述的表面活性剂主要起到促进试剂体系中各组分以及检测样本中各物质的均匀分散及提高检测的精密度，达到减少样本浊度对测定结果的影响的目的；因此，现有的具有增溶性质的表面活性剂都可作为试剂I或试剂II中所述的表面活性齐U，例如，吐温20、吐温40、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇等。本发明的试剂I和试剂II中的表面活性剂优选为曲拉通X-100。试剂I或试剂II中所述的防腐剂主要是为了防止细菌滋生导致的产品变质，所以任何一种能起到防止细菌滋生作用的防腐剂均能适用于本发明；本发明试剂I和试剂II中的防腐剂优选为Procl in-300，该产品毒性小，使用剂量小，杀菌谱广。试剂I或试剂II中所述的稳定剂，主要作用是保护抗体的活性及防止胶乳颗粒的凝集、下沉，同时还可以增加试剂盒中各组分的稳定性，延长产品的货架期及开瓶后使用时间。常用的稳定剂为糖类、醇类、蛋白类以及一些氨基酸等，本发明中的试剂I和试剂II中的稳定剂优选为蔗糖。试剂I中的促凝剂可以促进抗原抗体反应，有利于胶乳颗粒交联物的形成和增大，提高检测灵敏度和线性范围。本发明检测试剂盒中的促凝剂优选为PEG-6000或PEG-8000。试剂I中的阻断剂可以有效避免非特异性反应对检测结果的干扰。检测试剂盒中常见的干扰因素有以下两类异嗜性抗体干扰、类风湿因子干扰。本发明优选的阻断剂为类风湿因子阻断剂。部分类风湿关节炎、各种胶原结缔组织病、肝病以及多种慢性疾病病人体内会出现的一类自身抗体，可与自身IgG分子的Fe段抗原决定簇起反应，该类抗体被称为类风湿因子。试剂I及试剂II中的螯合剂能够络合检测样本中的金属离子，以减少金属离子造成的干扰；因此，能够络合金属离子的 各种螯合剂均能够适用，例如乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸及其盐等，本发明试剂II优选乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)为螯合剂。试剂II中的助悬剂可以帮助胶乳颗粒维持一个很好的分散状态，防止胶乳颗粒下沉影响检测试剂盒的品质及开瓶稳定性，常用的助悬剂有乙二醇、丙三醇、乳糖和麦芽糖等，本发明试剂II优选乙二醇作为助悬剂。试剂II中的封闭剂的作用是为了与胶乳颗粒中游离的-COOH位点结合，避免游离的羧基位点对检测结果造成不良影响，本发明试剂II中优选BSA蛋白作为封闭剂。本发明检测试剂盒中所用到的每种组分均能通过商业途径从生物试剂公司或医药公司购买得到。本发明的另外一个目的是提供一种制备所述检测NGAL试剂盒的方法，包括(I)制备试剂1:将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；(2)制备试剂I1:将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；(3)将试剂I和试剂II单独分装，密封，即得。本发明的又一目的是提供所述NGAL检测试剂盒检测样品中NGAL含量的检测方法，该方法为两点终点法，包括以下步骤向2. 5μ L待检测样本(校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品)中加入120 μ L的试剂I充分混匀，于37°C恒温5分钟，再向混合体系中加入30 μ L试剂II，混匀，37°C恒温I分钟后，空白管调零，波长570nm，测定各管吸光度Al，4分钟后测定各管吸光度A2。计算ΛΑ = Α2-Α1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值△ A，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。本发明检测试剂盒在现有的NGAL胶乳检测试剂盒的基础上对现有技术和配方进行了改进，克服了现有胶乳检测试剂盒抗干扰性差，消除了 NGAL/MMP-9复合物对检测结果的影响；此外，本发明检测试剂盒采用中等粒径的胶乳颗粒为载体制备得到包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体的胶乳颗粒，不仅提高了检测灵敏度，也有效解决了检测线性范围窄以及产品稳定性不够的问题。本发明检测试剂盒可以克服干扰因子的影响，可以检测到NGAL与MMP-9的复合物，避免NGAL检测结果偏低导致医生的误判；同时本发明检测试剂盒还具有开瓶稳定性好、检测线性范围广、生产成本较低等有点。
图1是本发明检测试剂盒的标准工作曲线。
图2是本发明检测试剂盒的37°C热稳定性试验结果。，
图3是对比NGAL胶乳免疫比浊 法检测试剂盒37°C热稳定性试验结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。预备实施例1NGAL抗体的筛选1、MMP-9亲和层析柱的制备将蛋白MMP-9 (购自R&D公司)与与压积CNBr_Sepharose4B(Pharmacia产品)按5_7mg/mL比例混合，4°C摇动20小时，使其交联。然后用O. lmol/L pH8. O碳酸盐缓冲液清洗3次，再加等量O. lmol/L乙醇胺-HCl 4°C摇动I小时，以封闭残留的活化集团。最后用O. 01mol/L Tris-HCl (TB)清洗、装柱、平衡，柱子的容积选用10mL。2、MMP-9/NGAL复合物亲和层析柱的制备将蛋白NGAL(购自R&D公司)配制成2mg/mL的溶液，用NGAL蛋白溶液以lmL/min的流速过MMP-9亲和层析柱，蛋白溶液的用量为60mL ;然后用0. lmol/L pH8. O磷酸缓冲液以lmL/min的流速洗脱多余的NGAL蛋白，洗脱液的用量为100mL。3、亲和层析NGAL抗体(购自武汉华美生物工程有限公司)，将NGAL抗体浓度调整至600ug/mL，以6mL/小时流速通过步骤2制备的亲和层析柱、依次用lmol/L NaCl-TB,0. 5%NP-40-TB、TB和双蒸水清洗，以去除非特异性吸附。然后用3mol/L KSCN6mL/小时进行解吸。紫外检测分段收集解吸液。用透析袋充分透析掉TB，后真空冷冻干燥溶液，既得经筛选的NGAL抗体。预备实施例2包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备过程如下①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备称取1. Og粒径为105nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入IOOmLO. 12M磷酸盐缓冲液(ρΗ7· 5)分散，加入40mgl-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应0. 5小时，离心弃上清，再用IOOmLO. 12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；
②NGAL抗体溶液的制备将250 μ g预备实施例1所筛选得到的NGAL抗体用O. 5mL去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；③包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备取100 μ L②步所制得的NGAL抗体溶液，用5mL0. 12M磷酸盐缓冲液稀释后，加入5mL步骤①制得胶乳溶液，在室温下搅拌反应2小时，加入O. 2mL0.1M甘氨酸缓冲液和2mL10%BSA溶液，搅拌30分钟，终止反应，离心弃上清，用O. 12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，得到包被NGAL抗体的胶乳颗粒。预备实施例3包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备过程如下①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备称取1. Og粒径为130nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入IOOmLO. 12M磷酸盐缓冲液(ρΗ7· 5)分散，加入40mgl-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应O. 5小时，离心弃上清，再用IOOmLO. 12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；②NGAL抗体溶液的制备将250 μ g预备实施例1所筛选得到的NGAL抗体用O. 5mL去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；③包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备取100 μ L②步所制得的NGAL抗体溶液，用5mL0. 12M磷酸盐缓冲液稀释后，加入5mL步骤①制得胶乳溶液，在室温下搅拌反应2小时，加入O. 2mL0.1M甘氨酸缓冲液和2mL10%BSA溶液，搅拌30分钟，终止反应，离心弃上清，用O. 12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，得到包被NGAL抗体的胶乳颗粒。预备实施例4包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备过程如下
①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备称取1. Og粒径为145nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入IOOmLO. 12M磷酸盐缓冲液(ρΗ7· 5)分散，加入40mgl_乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应O. 5小时，离心弃上清，再用IOOmLO. 12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；②NGAL抗体溶液的制备将250 μ g预备实施例1所筛选得到的NGAL抗体用O. 5mL去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；③包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备取100 μ L②步所制得的NGAL抗体溶液，用5mL0. 12M磷酸盐缓冲液稀释后，加入5mL步骤①制得胶乳溶液，在室温下搅拌反应2小时，加入O. 2mL0.1M甘氨酸缓冲液和2mL10%BSA溶液，搅拌30分钟，终止反应，离心弃上清，用O. 12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，得到包被NGAL抗体的胶乳颗粒。实施例1 NGAL胶乳检测试剂盒的制备1、试剂I的制备按所述用量取各组分三羟甲基氬基甲烷(Tris)ISg
曲拉通 X-1OO0.5mL
PEG-600015g
Prociln-3000.25mL
蔗糖10S
阻断齐y4mL
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)OAg将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。2、试剂II的制备按所述用量取各组分
包被NGAL抗体的胶乳颗粒(预备实施倒2制备)I Jg
3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS )10,5g
乙二胺四乙酸二钠《EDTA-2Na)2g
曲拉通X-100〗.5mL
Proclin-3000 25mL
乙二醇20纖L
牛血清白蛋白(BSA )IOg
蔗糖I OOg将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。实施例2 NGAL胶乳检测试剂盒的制备1、试剂I的制备按所述用量取各组分三羟甲基氨基甲烷(Tris)IOg
曲拉通X-100ImL
PEG-6000!2g
Proclin-300OJmL
藤糖30g
阻断齐[I3mL
乙二駿 _乙酸二钠(EDTA-2Na)0,8g将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。2、试剂II的制备按所述用量取各组分
包被NGAL抗体的胶乳颗粒《预备实施例3所制备)2g
3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS )I Sg
乙二胺_乙酸二钠(EDTA-2Na)3g
_拉通 X-1002mL
Proclin-3000.3 in L
jt...........3 0 ιτι L
牛Il清白蛋白(BSA )ISg
蔗糖SOg将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。实施例3 NGAL胶乳检测试剂盒的制备1、试剂I的制备按所述用量取各组分三羟甲基氨基甲烷(Tris)3§g
曲拉通 x-1001.SmL
IM30g Proclin-3000.3mL
庶糖20g
阻断翻5mL
乙二胺圆乙薩二铺(EDTA-2Na)2g将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。2、试剂II的制备 按所述用量取各组分
包被NGAL抗体的胶乳颗粒(预ft卖靈倒4所制罃} 2.2g 3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS )20g
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)Sg
曲拉通X-100I JmL
Proclin-3000,5mL
Cj'~β1-ymL·
牛血清白蛋白(BSA )30g
藤糖120g将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。实施例4 NGAL胶乳检测试剂盒的制备1、试剂I的制备按所述用量取各组分三羟甲基氨基甲烷(Tris)20g
曲拉通X-1002mL
PEG-600040g
Proclin-3000 9mL
簾糖40g
阻断齐I)7m L
乙二駿 _乙酸二钠(EDTA-2Na)0,5g将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。2、试剂II的制备按所述用量取各组分
ft被NGAL抗体的胶乳颗粒(麗备实施倒3所制餐)4g
3-(N-吗啉)丙磺_ ( MOPS )40g
乙二驗圏乙酸二 _(EDTA-2Na)6g
_fiil X-100LfimL
Prodin-3000.7mL
乙二醇40mL
牛Jl清白蛋白(BSA )40g
蔗糖IlOg将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。实施例5 NGAL胶乳检测试剂盒的制备1、试剂I的制备按所述用量取各组分三羟甲基氨基甲烷(Tris)40g
_ 拉邇 x-100IJmL
P EG-600035 g
Procli 11 3 000.7mL
蒙糖35g
阻断剂9mL
乙二胺四乙酸二钠{EDTA-2Na)0.6g将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。2、试剂II的制备按所述用量取各组分
包被 N (i Λ I」 抗颗粒(预备实施例4所■备)3g
3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS )30g
乙二胺圏乙酸二補(EDTA-2Na)3g
`曲拉通x-1002mL
Proclin-300OAmL
**7 ***** Sm^ / \ t V I⑴1.
牛It澝白蛋白(BSA )15g
蔗糖IOOg将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。实施例6 NGAL胶乳检测试剂盒的制备1、试剂I的制备:按所述用量取各组分三羟甲基氛基甲烷(Tris)ISg
_拉通 x-100OJmL
PEG-600018g
Proclin-3000.15mL
詹 β26g
阻断剂SmL 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)Ig将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。2、试剂II的制备按所述用量取各组分
包被NGAL抗体的胶乳颗粒《预备实施例2所制备、2g
3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS )14g
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)4g
曲拉通X-100IJmL
Proclin-3000.4mL
乙二 _20mL
牛血清白蛋白(BSA )20g
*糖90g将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。对比实施例1 NGAL胶乳检测试剂盒的制备一、包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备称取1. Og粒径为IOOnm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入IOOmLO. 12M磷酸盐缓冲液(ρΗ7· 5)分散，加入40mgl-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应O. 5小时，离心弃上清，再用IOOmLO. 12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；②NGAL抗体溶液的制备将250 μ g NGAL抗体用O. 5mL去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；③包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备取100 μ L②步所制得的NGAL抗体溶液，用5mL0. 12M磷酸盐缓冲液稀释后，加入5mL步骤①制得胶乳溶液，在室温下搅拌反应2小时，加入O. 2mL0.1M甘氨酸缓冲液和2mL10%BSA溶液，搅拌30分钟，终止反应，离心弃上清，用O. 12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，得到包被NGAL抗体的胶乳颗粒。二、试剂盒的制备1、试剂I的制备按所述用量取各组分
三 ,基鏟基甲焼(Tris)ISg
_據邇 Χ·_O.SmL
PEG-6000I Sg
Proclin-300OJSmL
蔗糖IOg
阻断剂4mL
乙二胺四乙 酸二 _(EDTA-2Na)0,4g将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。2、试剂II的制备按所述用量取各组分
ft植NGAL抗体_歷乳颗粒I Jg
3-(Ν- 啉)H礒睡(MOPS )10—5g
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)2g
_拉通 X-丨001.5mL
Procl in-3000.25mL
乙二酵20mL
牛血澝白蛋白(BSA )IOg
簾糖I OOg将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。对比实施例2 NGAL胶乳检测试剂盒的制备一、包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备称取1. Og粒径为50nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入IOOmLO. 12M磷酸盐缓冲液(ρΗ7· 5)分散，加入40mgl_乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应O. 5小时，离心弃上清，再用IOOmLO. 12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；
②NGAL抗体溶液的制备将250 μ g NGAL抗体用O. 5mL去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液；③包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备取100 μ L②步所制得的NGAL抗体溶液，用5mL0. 12M磷酸盐缓冲液稀释后，加入5mL步骤①制得胶乳溶液，在室温下搅拌反应2小时，加入O. 2mL0.1M甘氨酸缓冲液和2mL10%BSA溶液，搅拌30分钟，终止反应，离心弃上清，用O. 12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，得到包被NGAL抗体的胶乳颗粒。二、试剂盒的制备1、试剂I的制备按所述用量取各组分
权利要求
1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，由彼此独立的试剂I和试剂II组成；所述试剂I的组分包括生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂、阻断齐U、螯合剂和水；所述试剂II的组分包括包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂和水；其特征在于所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体既能和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗原结合又能和MMP-9/NGAL复合物相结合。
2.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体通过亲和层析方法筛选得到；优选的，其筛选方法包括 (1)制备MMP-9亲和层析柱将MMP-9蛋白与压积CNBr-S印harose4B混合，依次经过交联、清洗、封闭、再次清洗、装柱、平衡，得到MMP-9亲和层析柱； (2)制备MMP-9/NGAL复合物亲和层析柱将蛋白NGAL溶液过MMP-9亲和层析柱；再洗脱多余的NGAL蛋白； (3)亲和层析将NGAL抗体溶液通过步骤(I)所制备的亲和层析柱，去除非特异性吸附后进行解吸，分段收集解吸液，透析，冷冻干燥，即得。
3.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备方法包括 (1)制备羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液取粒径为105-145nm的聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，用缓冲液分散，加入1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺和硫代NHS，室温下搅拌反应；离心弃上清，再用缓冲液稀释分散沉淀胶乳，得到羧化改性聚苯乙烯胶乳； (2)NGAL抗体溶液的制备将筛选得到的既能和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗原结合又能和MMP-9/NGAL复合物相结合的NGAL单克隆抗体或多克隆抗体用去离子水溶解，得到NGAL抗体溶液； (3)包被NGAL抗体的胶乳颗粒的制备将步骤(2)所制备的抗体溶液用缓冲液稀释后，加入羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液，在室温下搅拌反应，终止反应后，离心弃上清，洗涤沉淀，即得。
4.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的表面活性剂为曲拉通X-1OO ;所述的防腐剂为Proclin-300 ;所述的稳定剂为蔗糖；所述的促凝剂为PEG-6000或PEG-8000 ;所述的阻断剂为类风湿因子阻断剂；所述的螯合剂为乙二胺四乙酸二钠；所述的助悬剂为乙二醇；所述的封闭剂为牛血清白蛋白。
5.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于试剂I中所述的生物缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷，试剂II中所述的生物缓冲剂为3-(N-吗啉)丙磺酸。
6.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于每I升试剂I中各组分的用量为生物缓冲剂5-100g，表面活性剂O. 5-20mL，促凝剂2_50g，防腐剂O. 02_lmL，稳定剂l_60g，阻断剂Ι-lOmL，螯合剂O. 05-5g，余量为水； 每I升试剂II中各组分的用量为包被NGAL抗体的胶乳颗粒O. Ι-lOg，生物缓冲剂1-1OOg,螯合剂O. Ι-lOg,表面活性剂O. 05-3mL,防腐剂O. 02-lmL，助悬剂5_50mL，封闭剂5_50g，稳定剂50-150g，余量为水。
7.按照权利要求6所述的试剂盒，其特征在于每I升试剂I中各组分的用量为生物缓冲剂7-20g，表面活性剂Ι-lOmL，促凝剂10_30g，防腐剂O. 1-0. 5mL,稳定剂5_15g，阻断剂3-6mL，螯合剂0. 1-lg，余量为水； 每1升试剂II中各组分的用量为包被NGAL抗体的胶乳颗粒0. 5-5g，生物缓冲剂5-30g,螯合剂0. 5-4g，表面活性剂0. 5-2mL,防腐剂0. 1-0. 5mL，助悬剂10_40mL，封闭剂7_15g，稳定剂 80-120g。
8.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:每1升试剂I中各组分的用量为生物缓冲剂12g，表面活性剂4mL，促凝剂15g，防腐剂0. 25mL,稳定剂10g，阻断剂5mL，螯合剂0.4g，余量为水； 每1升试剂II中各组分的用量为包被NGAL抗体的胶乳颗粒1. 7g，生物缓冲剂llg，螯合剂2g，表面活性剂1. 5mL,防腐剂0. 25mL，助悬剂20mL，封闭剂10g，稳定剂100g。
9.按照权利要求1-8任何一项的检测试剂盒，其特征在于试剂I的pH值的范围为7.0-8. 0，试剂II的pH值的范围为6. 5-7. 5。
10.一种制备权利要求1-8任何一项所述检测试剂盒的方法，包括(1)制备试剂I:将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；(2)制备试剂II:将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；(3)将试剂I和试剂II单独分装，密封，即得。
全文摘要
本发明公开了中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒及其制备方法；所述检测试剂盒由彼此独立的试剂I和试剂Ⅱ组成；试剂I的组分包括生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂、阻断剂、螯合剂和水；试剂Ⅱ的组分包括包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂和水；本发明试剂盒的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体既能和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗原结合又能和MMP-9/NGAL复合物相结合，有效避免了NGAL/MMP-9复合物对检测结果的影响，具有特异性强，灵敏度高，线性范围广，稳定性好等优点。
文档编号G01N33/68GK103048464SQ20121039494
公开日2013年4月17日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者华权高, 沈鹤霄, 黄爱, 许可, 马峰, 闫彩霞, 常向博, 舒芹 申请人:武汉生之源生物科技有限公司