专利名称：白酒中多种生物胺的定性与定量方法
技术领域：
白酒中多种生物胺的定性与定量方法，具体说是一种针对白酒中生物胺(指甲胺、乙胺、吡咯烷、腐胺、尸胺)的定性与定量方法，具体涉及应用气相色谱-串联质谱联用技术(GC-MS/MS)定性与紫外检测-反相高效液相色谱技术(RP-HPLC)定量方法。本发明属于白酒分析检测技术领域。
背景技术：
到目前为止，中国几大香型白酒中的生物胺(biogenic amines,简称BAs)研究还属空白，还没建立针对中国多种香型白酒中生物胺的定性与定量方法。其中存在的生物胺种类及其含量未知。
生物胺有毒，当人和动物摄入过量含有生物胺的食品，会引起中毒，世界上已经报道了多起由于摄入过量生物胺而中毒的事件，仲胺如腐胺、尸胺和吡咯烷也可以和亚硝酸盐反应生成致癌的亚硝胺。当人体摄入过量的生物胺(尤其是同时摄入多种生物胺)时，会引起诸如头痛、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应，严重的还会危及性命。人体摄入组胺达到IOOmg以上时，即易发生中毒。国际上已经对葡萄酒中的组胺制定了明确的限量标准，在瑞士规定含量不得高于10mg/L，而德国、比利时、法国限量标准更低，分别为2mg/L、5 6mg/L、8mg/L。已经有许多方法用于检测食品中的生物胺，包括薄层色谱法(TLC)，气相色谱法(GC)，毛细管电泳法，高效液相色谱法(HPLC)等。目前为止，关于发酵酒(葡萄酒，啤酒，黄酒)中生物胺的研究都比较多，在发酵酒中检测到的生物胺种类之和达到几十种之多。蒸馏酒中生物胺的检测目前还尚属空白，白酒作为世界六大蒸馏酒之一，要对其中的生物胺进行研究，首要任务是先对白酒中的生物胺种类进行定性，进而定量。对白酒中生物胺进行定性时，首先是要先对白酒中生物胺进行浓缩，浓缩一般采用的方法可以选择旋蒸或者氮吹，而本实验定性采用的样品量大，选择酒样375mL浓盐酸酸化(pH I. 5)后，利用旋转蒸发仪(40°C、抽真空)旋蒸到50mL。定性定量过程中均采用了液-液萃取，即一种有机溶剂或几种有机混合溶剂萃取出样品中的生物胺，达到净化的目的，灵敏度比较高。液-液萃取的基本步骤包括=NaCl饱和，然后调至碱性，最后用有机溶剂(正丁醇-氯仿，正丁醇)萃取。PH会影响到萃取效率，研究发现pH为11. 5时生物胺的萃取率最高。
发明内容
本发明的目的是建立白酒中多种BAs的定性与定量方法。包括生物胺的分离，气相衍生、液相柱前衍生条件进行优化和筛选，得到一套完整的白酒中生物胺定性、定量的方法。本方法具有分离浓缩效果好，衍生化效果高的优点。本发明的技术方案一种白酒中多种生物胺BAs的定性与定量方法，应用气相色谱-串联质谱联用技术GC-MS/MS定性与紫外检测-反相高效液相色谱技术RP-HPLC定量，利用液液萃取富集白酒中的生物胺，气相定性与液相定量均需要衍生，气相选用的衍生剂为三氟乙酸酐TFAA，液相采用的衍生剂为丹磺酰氯柱前衍生，包括生物胺的分离，气相衍生、液相柱前衍生条件进行优化和筛选；
(I) GC-MS定性方法
分离与衍生375mL酒样浓盐酸酸化(pHl. 5)后，利用旋转蒸发仪(40°C、抽真空)旋蒸到50mL，旋蒸时要加玻璃珠防止爆沸；剩余液体用二氯甲烷萃取两次，萃余液再旋蒸2 3min,调碱性(pHll)，用60mL 丁醇萃取三次。溶剂层先用等体积IM的NaOH洗，然后用两倍体积IM的HCl洗。HCl洗脱溶液再用丁醇萃取一次。剩余盐酸溶液减压浓缩至干燥盐。干燥盐用衍生剂用量为5mL三氟乙酸酐(TFAA)衍生，衍生反应不能含有水，要严格封闭，55°C，水浴30min ;然后用20mL饱和NaHCO3洗。加入固体NaHCO3直到溶液变碱性。然后用15mL乙醚萃取。乙醚溶液用20mL饱和NaHCO3洗，再用超纯水洗。加入无水硫酸钠干燥过夜。氮吹至IOOuL,立刻用GC-MS分析。 气相色谱条件FFAP柱(60mX0. 25mmX0. 25 μ m)分离的色谱条件气相色谱进样口和检测器温度为250°C，载气为氦气，流速2mL/min ;进样量I μ L，不分流进样；色谱柱升温程序初温50°C，保持2min，以4°C /min升至230°C，保持15min。质谱条件EI电离源；电子能量70eV ;离子源温度230 °C ;扫描范围35 350amu。(2) HPLC 定量方法
分离与衍生5mL白酒样品,加入I. 5g NaCl饱和,加入3mL正丁醇与氯仿(v/v 1:1)混合溶剂萃取，用PH为13的Na2CO3和NaOH缓冲溶液调pH至11. 5，涡旋仪旋转震荡4min，收集有机相，重复萃取两次。加入ImL IM HCl混匀，氮气吹干，加入2mL O. IM HCl溶解，加入2mL丹磺酰氯衍生剂(9mg/mL，溶剂为丙酮)，调pH为8. 6，衍生剂的体积用量与衍生前样品体积相同，震荡混匀后，40°C水浴避光衍生lh。衍生结束后，要加入200 μ L氨水中断反应，加入3mL乙酸乙酯，重复萃取三次，合并萃取液，氮气吹干，加入ImL乙腈溶解，O. 45 μ m有机滤膜过滤，进样。液相色谱条件Agilent C18色谱柱(4. 6 X 250mm, 5 μ m),检测波长为254nm,柱温为20°C，进样量10 μ L，利用外标法峰面积定量。梯度洗脱，流速为O. 4mL/min,流动相A为乙腈，B为超纯水。洗脱程序:0 6min，A为30% ;6 12min，A为30% 80% ;12 25min，A为80% 85% ;25 32min，A 为 85% 30%。本发明的有益效果本发明建立的方法在白酒中首次定性到9种生物胺，定量方法检测限可低至 ο μ g/L左右，线性相关系数大于O. 99，回收率为80. 199Γ104. 05%,相对标准偏差在4%以内。说明白酒中的生物胺可以利用该方法检测，可行性好，精密度高。
图I生物胺标准品GC-MS离子流色谱图。图2 5种生物胺HPLC标准品色谱图。I.甲胺，2.乙胺，3.吡咯烷，4.腐胺，5.尸胺。图3甲胺、乙胺、腐胺的标准曲线。图4吡咯烷标准曲线。
图5尸胺标准曲线。
具体实施例方式实施例I某一市售白酒中生物胺的定性定量
375mL酒样浓盐酸酸化(pHl. 5)后，利用旋转蒸发仪(40°C、抽真空)旋蒸到50mL，剩余液体用二氯甲烷萃取两次，萃余液再旋蒸2 3 min，调碱性(pHll)，用60mL 丁醇萃取三次。溶剂层先用等体积IM的NaOH洗，然后用两倍体积IM的HCl洗。HCl溶液再用丁醇萃取一次。剩余盐酸溶液减压浓缩至干燥盐。干燥盐用5mL三氟乙酸酐(TFAA)衍生，然后用20mL饱和NaHCO3洗。加入固体NaHCO3直到溶液变碱性。然后用15mL乙醚萃取。乙醚溶液用20mL饱和NaHCO3洗，再用超纯水洗。加入无水硫酸钠干燥过夜。氮吹至IOOyL,立刻用GC-MS分析。表Ι-a白酒中定性到的9种生物胺与保留时间
权利要求
1. 一种白酒中多种生物胺BAs的定性与定量方法，其特征在于应用气相色谱-串联质谱联用技术GC-MS/MS定性与紫外检测-反相高效液相色谱技术RP-HPLC定量，利用液液萃取富集白酒中的生物胺，气相定性与液相定量均需要衍生，气相选用的衍生剂为三氟乙酸酐TFAA，液相采用的衍生剂为丹磺酰氯柱前衍生，包括生物胺的分离，气相衍生、液相柱前衍生条件进行优化和筛选； (1)GC-MS定性方法 分离与衍生375mL酒样浓盐酸酸化调pH I. 5，利用旋转蒸发仪40°C、抽真空旋蒸到.50mL，旋蒸时要加玻璃珠防止爆沸；剩余液体用二氯甲烷萃取两次，萃余液再旋蒸2 3min，调碱性pHll，用60mL 丁醇萃取三次；溶剂层先用等体积IM的NaOH洗，然后用两倍体积IM的HCl洗，HCl洗脱溶液再用丁醇萃取一次，剩余HCl溶液减压浓缩至干燥盐；干燥盐用衍生剂用量为5mL三氟乙酸酐TFAA衍生，衍生反应不能含有水，要严格封闭，55°C，水浴.30min ;然后用20mL饱和NaHCO3洗，加入固体NaHCO3直到溶液变碱性，然后用15mL乙醚萃取，乙醚溶液用20mL饱和NaHCO3洗,再用超纯水洗,加入无水硫酸钠干燥过夜，氮吹至.100 μ L，立刻用GC-MS分析； 气相色谱条件=FFAP柱60mX O. 25mmX O. 25 μ m分离的色谱条件气相色谱进样口和检测器温度为250°C，载气为氦气，流速2mL/min ;进样量I μ L，不分流进样；色谱柱升温程序初温50°C，保持2min，以4°C /min升至230°C，保持15min ； 质谱条件EI电离源；电子能量70eV ;离子源温度230°C ;扫描范围35 350amu ； (2)HPLC定量方法 分离与衍生5mL白酒样品，加入I. 5g NaCl饱和，加入3mL正丁醇氯仿体积比1:1的混合溶剂萃取，用PH 13的Na2CO3和NaOH缓冲溶液调pH至11. 5，涡旋仪旋转震荡4min，收集有机相，重复萃取两次；加入ImL IM HCl混匀，氮气吹干，加入2mL O. IM HCl溶解，力口入2mL丹磺酰氯9mg/mL、溶剂为丙酮的丹磺酰氯衍生剂，调pH为8. 6，衍生剂的体积用量与衍生前样品体积相同，震荡混匀后，40°C水浴避光衍生Ih ;衍生结束后，要加入200 μ L氨水中断反应，加入3mL乙酸乙酯，重复萃取三次，合并萃取液，氮气吹干，加入ImL乙腈溶解，.O.45 μ m有机滤膜过滤，进样； 液相色谱条件=Agilent C18色谱柱4. 6X 250mm、5 μ m，检测波长为254nm，柱温为.20°C，进样量10 μ L，利用外标法峰面积定量，梯度洗脱，流速为O. 4mL/min,流动相A为乙腈，B为超纯水，洗脱程序:0 6min，A为30% ;6 12min，A为30% 80% ;12 25min，A为.80% 85% ;25 32min，A 为 85% 30%。
全文摘要
本发明公开了一种白酒中多种生物胺的定性与定量方法，属于白酒分析检测技术领域。本发明利用液液萃取富集白酒中的生物胺，气相定性与液相定量均需要衍生，气相选用的衍生剂为TFAA，液相采用的衍生剂为丹磺酰氯柱前衍生。本发明建立的方法在白酒中首次定性到9种生物胺，定量方法检测限可低至10μg/L左右，线性相关系数大于0.99，回收率为80.19%～104.05%，相对标准偏差在4%以内。说明白酒中的生物胺可以利用该方法检测，可行性好，精密度高。
文档编号G01N30/88GK102914606SQ201210400028
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月20日 优先权日2012年10月20日
发明者范文来, 徐岩, 温永柱 申请人:江南大学