专利名称：一种三聚氰胺的检测方法
技术领域：
本发明属于产品质量检测领域，尤其涉及一种三聚氰胺的检测方法。
背景技术：
三聚氰胺(Melamine)简称三胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，主要用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂。由于其氮的质量分数66%左右，一些不法厂商在饲料中大量添加，以提高产品中粗蛋白含量，水生生物食用含三聚氰胺的饲料后可能会在体内富集，严重损害了消费者的健康和利益，尤其是儿童，服用三聚氰胺超标的食品，会导致肾结石。2008年9月“三鹿奶粉事件”导致大量儿童肾结石，以三鹿，蒙牛，伊利等为首的乳品企业均在其产品内检出超标的三聚氰胺，一时间引起了人们对三聚氰胺的高度关注，随之，国家取消了食品类商品免检的待遇。这直接导致三聚氰胺的检测量大增。目前，用于三聚氰胺的检测的方法主要采用GB/T22388-2008的方法，其中包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法等。另外，目前一些检测机构提出采用电色谱仪进行检测，例如，中国专利CN102650627A公开了一种本发明涉及一种加压毛细管电色谱仪检测水产品中三聚氰胺的方法，步骤为1)样品制备；2)样品预处理；3)配制三聚氰胺标准溶液；4)采用加压毛细管电色谱进行分析；5)将样品经检测分析后根据其保留时间进行定量分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析。针对这些检测方法，液相色谱法的灵敏度较低，且分析时间较长，气质、液质联用仪，电色谱仪虽然检测灵敏度和分辨率很高，但是，这几种检测方法均需要采用氮气吹干仪，氮气吹干仪处理三聚氰胺样品虽然能够较快的处理样品，但是，氮气吹干仪一次只能处理少量样品，增加了检测时间，无法满足目前大量检测样品需同时检测的需求；从试管内被氮气吹扫而挥发出来的有机溶剂不经任何处理，直接散发到周围环境中，这些溶剂常常是强酸、强碱以及强腐蚀性物质。直接操作的实验人员极易因此出现健康问题，而这些溶剂挥发到空气里，也会对周围环境造成危害，包括办公室工作人员，周围绿化等。蒸汽会腐蚀仪器(针头)，导致交叉污染；另外，氮气吹干仪本身于由于长期处在这种环境中，也会很快出现生锈等被腐蚀现象，虽然有些氮气吹干仪的设计将针头包上一层PTFE以防腐，但针的尾部和仪器其它部件无法全部包上PTFE，不仅影响美观、性能，而且在操作时稍有不慎，便会将铁锈等碰落到样品中，造成样品污染；氮气吹干操作麻烦，必须有人一直看守，增加了检测人员的负担；消耗大量氮气，增加检测成本。由此可见，改进氮气吹干仪在三聚氰胺检测中的缺陷是非常必要的。技术内容为了解决目前检测方法存在的不能一次处理大量样品，有毒气体污染环境，消耗大量氮气的技术问题。本发明提供了如下技术方案一种三聚氰胺的检测方法，该方法包括如下步骤(I)样品的提取液态奶、奶粉、酸奶和奶糖等称取5. OOg样品于50mL具塞比色管，加入30mL浓度Iwt %的三氯乙酸溶液,润镟振荡40s以上,再加入IOmL浓度Iwt %三氯乙酸溶液,超声提取20分钟以上，加入2mL、浓度22g/L的乙酸铅溶液，用lwt%三氯乙酸溶液定容至刻度；充分混匀后，转移上层提取液29-32mL至50mL的离心试管，以5000r/min离心15min以上，得到待净化的上清液；奶酪、奶油和巧克力等称取5. OOg样品于50mL具塞比色管中，用5mL热水溶解或者在加热的条件下溶解，再加入25mL浓度^^%的三氯乙酸溶液，涡漩振荡40s以上，再加入IOmL三氯乙酸溶液超声提取20分钟以上，加入2mL、浓度22g/L的乙酸铅溶液，用Iwt %三氯乙酸溶液定容至刻度；充分混匀后，转移上层提取液29-32mL至50mL的离心试管，以5000r/min离心15min以上,得到待净化的上清液；(2)上清液的净化取基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物的混合型阳离子交换固相萃取柱，先依次用3-4mL甲醇、5-6mL水活化；移取5mL的待净化滤液至固相萃取柱中。再用3-5mL水、3-5mL甲醇淋洗,淋洗液送入回收装置,抽近干后用3_5mL体积分数5%的氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；所述氨化甲醇是5mL摩尔浓度为25% 28%的氨水和95mL甲醇，混匀后备用；⑶离心浓缩将12-24份(样品量调整到偶数，单数量样品可以用空的离心管配级成偶数)样品收集得到的洗脱液同时放入到真空离心浓缩仪的离心管中，进行真空离心干燥，在真空状态下辐射加热样品；并利用真空离心浓缩仪的冷阱捕捉溶剂蒸气，冷却，回收，送入回收
装置；⑷衍生化取上述干燥残留物，加入600 μ L的优纯级吡啶和200 μ L衍生化试剂，混匀，70°C反应40min以上；所述衍生化试剂是由体积比99 : I的N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)和三甲基氯硅烷(TMCS)，其中所述衍生化试剂是色谱纯的。
(5)三聚氰胺的定量检测首先，吸取三聚氰胺标准溶液，真空离心浓缩，衍生化，配成衍生化的标准化溶液，供测定，并绘制标准曲线；对步骤(4)得到的样品进行测定，比对标准曲线，即得到样品中三聚氰胺的含量。所述方法，还包括甲醇回收步骤将步骤(2)和(3)送到回收装置的回收液放入到甲醇蒸馏装置中，得到纯化的甲醇。所述方法，还包括将蒸馏纯化的甲醇重新送入到所述检测方法步骤(2)重复使用的步骤。采用本发明的方法检测三聚氰胺具有以下优点I、真空浓缩仪综合利用离心力、加热和外接真空泵提供的真空作用来进行溶剂蒸发，可同时处理多个样品而不会导致交叉污染。2、冷阱能有效捕捉大部分对真空泵有损害的溶剂蒸气，对高真空油泵提供有效的保护。3、真空泵使系统处于真空状态，降低溶剂的沸点，加快溶剂的蒸发速率。4、采用本发明的方法可以同时处理大量样品，最大可以同时处理24份样品，并可同时处理多种样品。
5、采用本发明的方法可以回收甲醇，最大可能的降低环境污染，回收的甲醇经蒸馏处理后可以重复使用，甲醇的重复利用率达80%以上，降低了成本。
附图I是三聚氰胺衍生物GC-MS选择离子质谱图。
具体实施例方式下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
三聚氰胺的检测方法，该方法包括如下步骤(I)样品的提取液态奶、奶粉、酸奶和奶糖等称取5. OOg样品于50mL具塞比色管，加入30mL浓度Iwt %的三氯乙酸溶液,润镟振荡40s以上,再加入IOmL浓度Iwt %三氯乙酸溶液,超声提取20分钟以上，加入2mL、浓度22g/L的乙酸铅溶液，用lwt%三氯乙酸溶液定容至刻度；充分混匀后，转移上层提取液29-32mL至50mL的离心试管，以5000r/min离心15min以上，得到待净化的上清液；奶酪、奶油和巧克力等称取5. OOg样品于50mL具塞比色管中，用5mL热水溶解或者在加热的条件下溶解，再加入25mL浓度^^%的三氯乙酸溶液，涡漩振荡40s以上，再加入IOmL三氯乙酸溶液超声提取20分钟以上，加入2mL、浓度22g/L的乙酸铅溶液，用Iwt %三氯乙酸溶液定容至刻度；充分混匀后，转移上层提取液29-32mL至50mL的离心试管，以5000r/min离心15min以上,得到待净化的上清液；(2)上清液的净化取基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物的混合型阳离子交换固相萃取柱，先依次用3-4mL甲醇、5-6mL水活化；移取5mL的待净化滤液至固相萃取柱中。再用3-5mL水、3-5mL甲醇淋洗,淋洗液送入回收装置,抽近干后用3_5mL体积分数5%的氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；所述氨化甲醇是5mL摩尔浓度为25% 28%的氨水和95mL甲醇，混匀后备用；(3)离心浓缩将12-24份(样品量调整到偶数，单数量样品可以用空的离心管配级成偶数)样品收集得到的洗脱液同时放入到真空离心浓缩仪的离心管中，进行真空离心干燥，在真空状态下辐射加热样品；并利用真空离心浓缩仪的冷阱捕捉溶剂蒸气，冷却，回收，送入回收
装置；(4)衍生化取上述干燥残留物，加入600 μ L的优纯级吡啶和200 μ L衍生化试剂，混匀，70°C反应40min以上；所述衍生化试剂是由体积比99 : I的N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)和三甲基氯硅烷(TMCS)，其中所述衍生化试剂是色谱纯的。(5)三聚氰胺的定量检测首先，吸取三聚氰胺标准溶液，真空离心浓缩，衍生化，配成衍生化的标准化溶液，供测定，并绘制标准曲线；
对步骤(4)得到的样品进行测定，比对标准曲线，即得到样品中三聚氰胺的含量。将步骤(2)和(3)送到回收装置的回收液放入到甲醇蒸馏装置中，得到纯化的甲醇，然后，将蒸馏纯化的甲醇重新送入到所述检测方法步骤(2)重复使用的步骤。其中，甲醇的回收率85wt%以上，重复利用率为80wt%以上。其中，所述真空离心浓缩仪主要由离心主机、冷阱、真空泵三部分组成，这算是一种在真空状态下离心样品，从而将溶剂蒸发以浓缩或干燥样品的仪器。并通过超低温的冷阱捕捉溶剂。离心浓缩后的样品可方便的用于各种定性和定量的分析。离心浓缩技术融合了离心、抽真空和热量三种因素，用于有效的蒸发各种溶剂。离心产生200_500Xg的离心力，防止爆沸及样品的损失。干燥后的溶质完全沉积在容器的底部，便于样品的完全回收。抽真空加速溶剂在SpeedVac浓缩仪中的蒸发。在浓缩过程中，样品始终处于一种低于室温的环境，可以防止热敏感样品的部分失活。此外，真空状态还能防止样品的氧 化。热量加速样品的蒸发速率。在没有外来热量的状态下，水溶液会在浓缩过程中结冰，本设备采用辐射加热技术，弥补蒸发时的热量损耗。热辐射是真空状态下给样品加热的最有效方式。所述标准液的制备方法是吸取三聚氰胺标准储备液ImL于IOOmL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此标准溶液ImL相当于10 μ g三聚氰胺标准品，于4°C冰箱内储存，有效期3个月。三聚氰胺标准储备液准确称取100mg(精确到O. Img)三聚氰胺标准品于IOOmL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为lmg/mL的标准储备液，于4°C避光保存。所述标准曲线的制备方法具体如下准确吸取三聚氰胺标准溶液0、0.4、0.8、1.6、4、8、16mL于7个IOOmL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。各取ImL用氮气吹干，衍生化。配制成衍生产物浓度分别为0、0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1、2 μ g/mL的标准溶液。反应液供GC-MS测定。以标准工作溶液浓度为横坐标，定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。三聚氰胺衍生物选择离子质谱图参见附图I。其中，GC-MS的操作参考条件a)色谱柱5%苯基二甲基聚硅氧烷石英毛细管柱，30mX0. 25mmX0. 25μπι，或相当者。b)流速1. OmT ,/mi η。c)程序升温70°C保持Imin,以10°C /min的速率升温至200°C,保持lOmin。d)传输线温度280°C。e)进样口温度250°C。f)进样方式不分流进样。g)进样量lyL。h)电离方式电子轰击电离(EI)。i)电离能量70eV。j)离子源温度230°C。k)扫描模式选择离子扫描，定性离子m/z 99、171、327、342，定量离子m/z 327。具体实施例下面通过实施例进一步说明本发明，但本发明并不限于此。下文中使用的原料是可商购的或者可根据本领域公知技术容易地制得。实施例一取液态奶样品18份，各称取5. OOg样品于50mL具塞比色管，加入30mL浓度lwt%的三氯乙酸溶液，涡漩振荡40s以上，再加入IOmL浓度Iwt %三氯乙酸溶液，超声提取20分钟以上，加入2mL、浓度22g/L的乙酸铅溶液，用Iwt%三氯乙酸溶液定容至刻度；充分混匀后，转移上层提取液29-32mL至50mL的离心试管，以5000r/min离心15min以上，得到待净化的上清液；经上清液净化，离心浓缩，衍生化，三聚氰胺的定量检测；检测时间12小时，甲 醇回收率90 %，重复利用率85 %。实施例二取巧克力样品24份,各称取5. OOg样品于50mL具塞比色管中，用5mL热水溶解或者在加热的条件下溶解，再加入25mL浓度^^%的三氯乙酸溶液，涡漩振荡40s以上，再加入IOmL三氯乙酸溶液超声提取20分钟以上，加入2mL、浓度22g/L的乙酸铅溶液，用lwt%三氯乙酸溶液定容至刻度；充分混匀后，转移上层提取液29-32mL至50mL的离心试管，以5000r/min离心15min以上，得到待净化的上清液；经上清液净化，离心浓缩，衍生化，三聚氰胺的定量检测；检测时间16小时，甲醇回收率95%，重复利用率90%。
权利要求
1.一种三聚氰胺检测的方法，该方法包括如下步骤 (1)样品的提取 液态奶、奶粉、酸奶和奶糖等称取5. OOg样品于50mL具塞比色管，加入30mL浓度lwt%的三氯乙酸溶液，涡漩振荡40s以上，再加入IOmL浓度Iwt %三氯乙酸溶液，超声提取20分钟以上，加入2mL、浓度22g/L的乙酸铅溶液，用lwt%三氯乙酸溶液定容至刻度；充分混匀后，转移上层提取液29-32mL至50mL的离心试管，以5000r/min离心15min以上，得到待净化的上清液； 奶酪、奶油和巧克力等称取5. OOg样品于50mL具塞比色管中，用5mL热水溶解或者在加热的条件下溶解，再加入25mL浓度^^%的三氯乙酸溶液，涡漩振荡40s以上，再加入IOmL三氯乙酸溶液超声提取20分钟以上，加入2mL、浓度22g/L的乙酸铅溶液，用Iwt %三氯乙酸溶液定容至刻度；充分混匀后，转移上层提取液29-32mL至50mL的离心试管，以5000r/min离心15min以上,得到待净化的上清液； (2)上清液的净化 取基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物的混合型阳离子交换固相萃取柱，先依次用3-4mL甲醇、5-6mL水活化；移取5mL的待净化滤液至固相萃取柱中。再用3_5mL水、3-5mL甲醇淋洗，淋洗液送入回收装置，抽近干后用3-5mL体积分数5%的氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；所述氨化甲醇是5mL摩尔浓度为25% 28%的氨水和95mL甲醇，混匀后备用; (3)离心浓缩 将12-24份(样品量调整到偶数，单数量样品可以用空的离心管配级成偶数)样品收集得到的洗脱液同时放入到真空离心浓缩仪的离心管中，进行真空离心干燥，在真空状态下辐射加热样品；并利用真空离心浓缩仪的冷阱捕捉溶剂蒸气，冷却，回收，送入回收装置； (4)衍生化 取上述干燥残留物，加入600 μ L的优纯级吡啶和200 μ L衍生化试剂，混匀，70°C反应40min以上； (5)三聚氰胺的定量检测 首先，吸取三聚氰胺标准溶液，真空离心浓缩，衍生化，配成衍生化的标准化溶液，供测定，并绘制标准曲线； 对步骤⑷得到的样品进行测定，比对标准曲线，即得到样品中三聚氰胺的含量。
2.如权利要求I所述的三聚氰胺检测的方法，其特征在于，所述衍生化试剂是由体积比99 : I的N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)和三甲基氯硅烷(TMCS)，其中所述衍生化试剂是色谱纯的。
3.如权利要求I或2所述的三聚氰胺检测的方法，其特征在于，还包括甲醇回收步骤将步骤(2)和(3)送到回收装置的回收液放入到甲醇蒸馏装置中，得到纯化的甲醇。
4.如权利要求3所述的三聚氰胺检测的方法，其特征在于，还包括将蒸馏纯化的甲醇重新送入到所述检测方法步骤(2)重复使用的步骤。
全文摘要
本发明涉及一种三聚氰胺检测的方法，步骤为(1)样品的提取；(2)上清液的净化(3)离心浓缩；(4)衍生化；(5)三聚氰胺的定量检测。采用本发明的方法可以同时处理大量样品，最大可以同时处理24份样品，并可同时处理多种样品；采用本发明的方法可以回收甲醇，最大可能的降低环境污染，回收的甲醇经蒸馏处理后可以重复使用，降低了成本；真空浓缩仪综合利用离心力、加热和外接真空泵提供的真空作用来进行溶剂蒸发，可同时处理多个样品而不会导致交叉污染。冷阱能有效捕捉大部分对真空泵有损害的溶剂蒸气，对高真空油泵提供有效的保护。真空泵使系统处于真空状态，降低溶剂的沸点，加快溶剂的蒸发速率。
文档编号G01N30/06GK102879504SQ20121040273
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者贾晓川, 于燕燕, 李晶, 丁宇, 于智睿, 周磊, 张彬, 王娜 申请人:天津出入境检验检疫局工业产品安全技术中心