专利名称：基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质检测技术，具体属于一种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法和试剂盒。
背景技术：
人中性粒细胞弹性蛋白酶(Human neutrophil elastase, HNE)是中性粒细胞释放的一种重要蛋白酶，承担多种生物功能，HNE与人类许多疾病的发生发展密切相关，如如肺气肿、囊性肺纤维化、急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征、慢性肠道疾病、心肌炎、关节炎等。此外，HNE在机体免疫防御、炎症反应及其调控过程中也发挥着重要的作用。HNE是重要的生物标识物，是多种疾病诊断的测定指标。建立高灵敏高特异的HNE检测方法，在研究HNE的生理病理功能，和疾病的诊断与治疗等方面具有重要的意义(Meyer-Hoffertj U. ; Wiedow, O. Curr. Opin. Hematol. 2011. 18，19-24. Sato, T. ; Takahashi ,S. ;Mizumotoj T. ; Haraoj M. ; Akizukij M. ; Takasugij M. ; Fukutomij T. ; Yamashitaj J. Surg.Oncol. 2006. 15，217 - 222.)。传统的HNE检测借助于酶分子对于特定性底物的选择性催化，产生荧光和生色团的变化等，但这种方法在选择性和灵敏度上存在着一定的局限性，特别是可以催化类似反应的酶分子会对检测产生很大干扰，只依赖底物的选择性并不能保证对HNE检测的特异性，从而导致检测方法的非特异性。其他一些方法借助免疫抗体来实现对于HNE的选择性检测，但免疫抗体在制备和稳定性等方面存在着局限性。(Pouyade, G. R. ;Franck, T. , Salciccia, A. ; Deby-Dupont, G. ; Grulke, S. ; Heyden, L. V; Sandersen, C. ; Serteyn, D. Vet.Tmmunol. ImmunopathoI. 2010. 135, 282-288.)核酸适配体(子)(Aptamer)是通过SELEX技术筛选出的一类能与蛋白质等革巴物质特异性结合的寡聚核苷酸片段，对目标分子具有高度亲和力和专一性的识别能力(Ellington, A. D. and Szostak, J. ff. Nature 1990, 346, 818 - 822. Tuerk, C. and Gold, L.Science 1990，249，505-510.)。核酸适配体作为亲和配体，与免疫抗体相比，具有显著的优点具有高的亲和力和高特异性；筛选制备方便；稳定性高；易于化学修饰；分子量小，所占空间小，在固相表面可获得很高的覆盖密度。因此核酸适配体在蛋白质的分析检测领域中显示出很多优点，可以克服常用的免疫抗体的在稳定性和制备等的一些局限，显示出应用前景，已有利用比色法、荧光检测法、石英晶体微天平方法、电化学方法等基于核酸适配体的蛋白质检测技术报道(Liu, J. ;Cao, Z. ;Lu, Y. Chem. Rev. 2009，109，1948 - 1998 ;Cho, E.J. ; Lee, J. -ff. ;Ellington, A. D. Annu. Rev. Anal. Chem. 2009, 2, 241 - 264.)。已报道的利用核酸适配体检测HNE的荧光偏振法或荧光染料标记的核酸探针置换法的灵敏度低，不能满足高灵敏检测的要求(Jayasena, S. D. Cl in. Chem. 1999，45，1628-1650; He, J.L. ;ffu, Z. -S. ; Zhang S. -B. ; Shen, G. -L. ; Yu, R.-Q. Talanta2010, 80，1264 - 1268.)
发明内容
本发明的目的是提供一种基于核酸适配体的高灵敏和高特异检测中性粒细胞弹性蛋白酶分子的检测方法和试剂盒，该方法和相应的试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高的优点。本发明基于核酸适配体修饰的酶标板的中性粒细胞弹性蛋白酶的检测方法是利用修饰在酶标板表面的可识别中性粒细胞弹性蛋白酶的核酸适配体选择性捕获中性粒细胞弹性蛋白酶，与样品分离，再加入中性粒细胞弹性蛋白酶的底物，中性粒细胞弹性蛋白酶催化水解底物生成产物，通过测定产物就可以实现对中性粒细胞弹性蛋白酶的检测(见图I)。本发明提供的一种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，步骤是(I)制备核酸适配体修饰的酶标板将可特异性识别中性粒细胞弹性蛋白酶分子的核酸适配体修饰到酶标板表面；(2)捕获反应利用上述酶标板在捕获反应溶液中与样品温育，捕获样品中的中·性粒细胞弹性蛋白酶，分离，用洗涤溶液洗涤；(3)酶催化反应将含有中性粒细胞弹性蛋白酶底物(生色底物或荧光底物)的酶反应溶液加入到捕获反应后的酶标板中，在37° C下进行酶催化反应；加入酶反应终止溶液，终止催化反应；(4)检测当采用生色底物时测定催化反应终止后溶液的吸光度，当采用荧光底物时测定催化反应终止后溶液的荧光强度；根据中性粒细胞弹性蛋白酶的标准品所得检测结果绘制标准曲线，根据待测样品的检测结果，对照标准曲线求出待测样品中中性粒细胞弹性蛋白酶的含量。所述的核酸适配体修饰的酶标板通过如下方法制得先将链霉亲和素修饰到酶标板上，再利用生物素与链霉亲和素的强相互作用将5’端带有生物素标记的核酸适配体固定到酶标板上；所述的核酸适配体的序列为SEQ ID NO
Io所述的捕获反应溶液100mMTris-HCl, 150mM NaCl,2mM MgCl2,6mM KCl,0. l%Tween 20，pH=7. 0。所述的洗涤溶液100mMTris-HCl, 150mM NaCl,2mM MgCl2,6mM KCl,0.l%Tween20，pH=7. 0。所述的酶反应溶液50mMTris-HCl, IM NaCl, IOmM CaCl2,0. l%Tween 20，pH=8. 0。所述的中性粒细胞弹性蛋白酶底物为荧光底物N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-7-amido-4-methylcoumarin (简写为 Meo-Suc-AAPV-AMC),其在酶反应溶液中浓度为 O. 2mM,或生色底物 N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val p-nitroanilide (简写为Meo-Suc-AAPV-pNA)，其在酶反应溶液中浓度为O. 84mM。酶反应终止溶液体积浓度为20%的乙酸溶液。本发明提供的一种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的试剂盒，其组成核酸适配体修饰的酶标板，中性粒细胞弹性蛋白酶标准物，捕获反应溶液，洗涤溶液，中性粒细胞弹性蛋白酶底物，酶反应溶液，酶反应终止溶液。核酸适配体修饰的酶标板按如下方法制得先将链霉亲和素修饰到酶标板上，再利用生物素与链霉亲和素的强相互作用将5’端带有生物素标记的核酸适配体固定到酶标板上；所述的核酸适配体的序列为SEQ ID N0:1。其可将中性粒细胞弹性蛋白酶捕获到酶标板上。
中性粒细胞弹性蛋白酶底物荧光底物为N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val -7-amido-4-methylcoumarin,其在酶反应溶液中浓度为O. 2mM ;或生色底物为N-Methoxys uccinyI-Ala-Ala-Pro-Val p-nitroanilide,其在酶反应溶液中浓度为O. 84mM。在酶催化反应中可产生生色产物或荧光产物，具有反应特异性，具有良好的催化反应特性。
捕获反应溶液100mMTris-HCl, 150mM NaCl,2mM MgCl2,6mM KC1,0. l%Tween20, pH=7. 0。使核酸适配体具有很好的亲和力，将中性粒细胞弹性蛋白酶特异性捕获。
洗涤溶液100mMTris-HCl, 150mM NaCl,2mM MgCl2,6mM KC1,0. l%Tween 20， pH=7. 0。去除不与核酸适配体结合的物质和非特异性结合的干扰物。
酶反应溶液50mMTris-HCl, IM NaCl, IOmM CaCl2,0. l%Tween 20，ρΗ=8· 0。使中性粒细胞弹性蛋白酶具有很好的活性，使得酶催化反应快速高效进行。
酶反应终止液体积浓度为20%的乙酸溶液。用于终止酶催化反应。
中性粒细胞弹性蛋白酶标准物用于建立检测的标准曲线。
与现有技术相比本发明具有如下的优点和效果
本发明将核酸适配体用于中性粒细胞弹性蛋白酶的捕获，充分利用核酸适配体的高稳定性、易制备、易引入功能团等方面的优点。利用酶标板上核酸适配体对于目标分子的捕获富集和高效的酶催化反应，本检测方法具有很高的检测灵敏度。采用生色底物时，可以检测到IOpM HNE (样品体积为100微升，37度下酶反应时间为2小时)，具有成本低等优点。 当采用荧光底物时，利用荧光检测可以进一步提高灵敏度，可以检测到IpM的ΗΝΕ(样品体积为100微升，37度下酶反应时间为2小时)。通过延长酶反应时间，检测灵敏度可以进一步提闻。
利用核酸适配体对于中性粒细胞弹性蛋白酶的特异性捕获和酶反应过程中中性粒细胞弹性蛋白酶对于底物的选择性催化，使得检测方法具有高度的选择性，结构功能类似的一些其它酶分子(如凝血酶、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶G、蛋白酶3等)和蛋白质(如白蛋白、免疫抗体G、转铁蛋白等)不干扰对HNE的检测。与基于荧光染料标记的核酸适配体的荧光检测方法相比，本发明在灵敏度和选择性上也具有明显的优势。
另外，本发明整个检测过程简单，容易操作，并不要求复杂的仪器设备。本发明采用核酸适配体作为亲和试剂可以克服使用免疫抗体在制备和稳定性等方面的局限性。利用酶标板作为固相基底，可以采用已经被酶联免疫分析广泛使用的检测平台，提高了检测的可操作性，便于快速处理大批量样品，易于商品化和实际应用，具有高通量、自动化分析的优势。
图I本发明检测方法的示意图。
图2采用生色底物Meo-Suc-AAPV-pNA和核酸适配体修饰的酶标板检测不同浓度的中性粒细胞弹性蛋白酶所产生的吸光度变化。
图3采用荧光底物Meo-Suc-AAPV-AMC和核酸适配体修饰的酶标板检测不同浓度6的中性粒细胞弹性蛋白酶所产生的荧光强度变化。
图4采用生色底物Meo-Suc-AAPV-pNA和核酸适配体修饰的酶标板检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法的特异性考察。
图5采用荧光底物Meo-Suc-AAPV-AMC和核酸适配体修饰的酶标板检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法的特异性考察。
具体实施例方式
实施例I :采用生色底物Meo-Suc-AAPV-pNA和核酸适配体修饰的酶标板检测中性粒细胞弹性蛋白酶
核酸适配体在酶标板上的固定带有生物素(biotin)标记的核酸适配体具有如下序列5，-biotin-TAG CGA TAC TGC GTG GGT TGG GGC GGG TAG GGC CAG CAG TCTCGT-3，。 在96孔酶标板(透明酶标板Costar 3590)上每孔加入100微升链霉亲和素(10 μ g/mL， O. IM Na2CO3, pH 9. O)在4° C下孵育过夜。洗涤后，采用封闭溶液(20mM Tris-HCl，140mM NaCl，2mg/mL BSA, 0. l%Tween 20，pH 7. 5)在37。C下温育30分，封闭微孔板上未结合位点。每孔加入100微升生物素标记的核酸适配体(200nM核酸适配体，20mM Tris-HCl, I M NaCl，0. l%Tween 20，pH 7. 5)，在37° C下反应I小时，洗涤3次，4° C下保存备用。
检测中性粒细胞弹性蛋白酶将中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)采用捕获反应溶液 (IOOmM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM MgCl2,6mM KC1，0. l%Tween 20，ρΗ=7· 0)稀释到不同浓度(O. 01ηΜ 20ηΜ);在核酸适配体包被的酶标板的微孔中加入100微升HNE溶液，室温下震荡温育I小时；然后弃去反应溶液，采用100微升洗涤溶液(IOOmM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM MgCl2,6mM KC1，0. l%Tween 20，pH=7. 0)洗3次，每次3分钟；取含有生色底物的酶反应溶液(O. 84mM 底物 Meo-Suc-AAPV-pNA，50mM Tris-HCl, IM NaCl, IOmM CaCl2,0. l%Tween 20，pH=8. 0) 100微升，加入到微孔中，37° C下震荡反应2小时，加入20微升终止液(20% 乙酸);采用酶标仪进行吸光度测定(波长为405nm);通过测定不同浓度的HNE标准物，检测吸光度变化情况，扣掉空白样品产生的吸光度，绘制标准曲线；未知样品中HNE的浓度由标准曲线计算得到。HNE在0. OlnMlnM浓度范围内与405nm处的吸光度变化呈良好线性关系(y=0. 372x+0. 026，R=O. 997)，最低浓度检测限为0. OlnM (图2，图2内插图显示了低浓度 HNE所对应的吸光度变化)。
实施例2 :采用荧光底物Meo-Suc-AAPV-AMC和核酸适配体修饰的酶标板检测中性粒细胞弹性蛋白酶
核酸适配体在酶标板上的固定带有生物素(biotin)的核酸适配体具有如下序列5， -biotin-TAG CGA TAC TGC GTG GGT TGG GGC GGG TAG GGC CAG CAG TCTCGT-3，。 在96孔酶标板(黑色酶标板，NUNC Maxisorp)上每孔加入100微升链霉亲和素(10 μ g/ mL链霉亲和素，0.1M Na2CO3, pH 9. 0)在4度下孵育过夜。洗涤后，采用封闭溶液(20mM Tris-HCl, 140mM NaCl，2mg/mL BSA，0. l%Tween 20,pH 7. 5)在 37。C 下温育 30 分，封闭微孔板上未结合位点。每孔加入100微升生物素标记的核酸适配体(200nM核酸适配体，20mM Tris-HC1,1M NaCl, 0. l%Tween20, pH 7.5)，在 37。C 下反应 I 小时，洗涤 3 次，4° C 下保存备用。
检测中性粒细胞弹性蛋白酶将中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)采用捕获反应缓冲液(IOOmM Tris-HCl，150mM NaCl, 2mM MgCl2,6mM KC1+0. l%Tween 20，pH 7.0)稀释到不同浓度(1ρΜ 2ηΜ);在核酸适配体包被的96孔黑色酶标板的微孔中加入100微升HNE溶液，室温下震荡温育I小时；然后弃去反应溶液，采用100微升洗涤溶液(IOOmM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM MgCl2,6mM KC1，0. l%Tween 20，pH=7. 0)洗 3 次，每次 3 分钟；取含有荧光底物的酶反应溶液(O. 2mM 荧光底物 Meo-Suc-AAPV-AMC，50mM Tris-HCl, IM NaCl+lOmM CaCl2,0.l%Tween20, pH=8. 0) 100微升，加入到微孔中，37° C下震荡反应2小时，加入20微升终止液(20%乙酸);采用带有荧光检测的酶标仪进行荧光强度检测(激发波长370nm，发射波长 440nm);通过检测不同浓度的HNE标准物，测定荧光强度，扣掉空白样品产生的荧光值，绘制标准曲线；未知样品中HNE的浓度由标准曲线计算得到。HNE在1ρ]\Γ2ηΜ浓度范围内与 440nm处的荧光强度变化呈良好线性关系(lgy=3. 005+1. IOllgx, R=O. 998，x单位为nM)，最低浓度检测限为IpM (图3)。
实施例3 :采用生色底物Meo-Suc-AAPV-pNA和核酸适配体修饰的酶标板检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法的特异性考察。
按照实施例I中的检测步骤进行检测，被检测蛋白质浓度如下人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE),猪胰弹性蛋白酶(porcine pancreatic elastase, PPE),胰凝乳蛋白酶 (chymotrypsin),人凝血酶(human a-thrombin),蛋白酶 3 (proteinase 3),和组织蛋白酶G (cathepsin G)浓度为0. 5nM。人中性粒细胞弹性蛋白酶(0. 5nM)与其它蛋白共存时的检测，考察的共存蛋白质包括溶菌酶(Iysozyme),人转铁蛋白(transferrin),血红蛋白 (hemoglobin, Hb),人白蛋白(human serum albumin, HSA)和免疫球蛋白 G (IgG),共存蛋白质的浓度均为50nM。只有人中性粒细胞弹性蛋白酶被特异性检测，其他被考察蛋白质均不产生任何干扰(图4)。
实施例4 :采用荧光底物Meo-Suc-AAPV-AMC和核酸适配体修饰的酶标板检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法的特异性考察
按照实施例2中的检测步骤进行检测，被检测蛋白质浓度如下人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE),猪胰弹性蛋白酶(porcine pancreatic elastase, PPE),胰凝乳蛋白酶 (chymotrypsin),人凝血酶(human a-thrombin),蛋白酶 3 (proteinase 3),和组织蛋白酶G (cathepsin G)浓度为0. 5nM。人中性粒细胞弹性蛋白酶(0. 5nM)与其它蛋白质共存时的检测，所考察的共存蛋白质包括溶菌酶(Iysozyme),人转铁蛋白(transferrin),血红蛋白(hemoglobin,Hb),人白蛋白(human serum albumin,HSA)和免疫球蛋白 G (50nM),共存蛋白质的浓度均为50nM。只有人中性粒细胞弹性蛋白酶被特异性检测，其他被考察蛋白质均不产生任何干扰(图5)。
实施例5 :—种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的试剂盒的制备。
试剂盒组成核酸适配体修饰的酶标板，中性粒细胞弹性蛋白酶标准物，捕获反应溶液，洗涤溶液，中性粒细胞弹性蛋白酶底物，酶反应溶液，酶反应终止液。具体为
核酸适配体修饰的酶标板的制备
黑色酶标板用于采用荧光底物和荧光法检测的实验，透明酶标板用于采用生色底物和吸光光度法检测的实验。96孔酶标板上每孔加入100微升链霉亲和素(10 μ g/mL, 0. IM Na2CO3, pH 9.0)在4° C下孵育过夜。洗涤后，采用封闭溶液(20mM Tris-HCl，140mMNaCl， 2mg/mLBSA,0. l%Tween 20)在37° C下温育30分，封闭微孔板上未结合位点。每孔加入CN 102928586 A书明说6/6页100微升生物素标记的核酸适配体(200nM)，在37° C下反应I小时，洗涤3次，4° C下保存备用。
核酸适配体生物素标记的可识别HNE的核酸适配体具有如下序列 5’ -biotin-TAG CGATAC TGC GTG GGT TGG GGC GGG TAG GGC CAG CAG TCT CGT-3’ (Lin, Y. ; Padmapriya, A. ; Morden, Κ. M. ;Jayasena, S. D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995,92, 11044 - 11048),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(Sangon Biotech (Shanghai)Co. Ltd.)。
中性粒细胞弹性蛋白酶底物
中性粒细胞弹性蛋白酶底物荧光底物为N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val -7-amido-4-methylcoumarin,其在酶反应溶液中浓度为O. 2mM ;或生色底物为N-Methoxys uccinyI-Ala-Ala-Pro-Val p-nitroanilide,其在酶反应溶液中浓度为 O. 84mM ；
捕获反应溶液100mMTris-HCl, 150mM NaCl,2mM MgCl2,6mM KC1,0. l%Tween20, pH=7. 0 ；
洗涤溶液100mMTris-HCl, 150mM NaCl,2mM MgCl2,6mM KC1,0. l%Tween 20， pH=7. 0 ；
酶反应溶液50mMTris-HCl, IM NaCl, IOmM CaCl2,0. l%Tween 20，pH=8. 0 ；·
酶反应终止液体积浓度为20 %的乙酸溶液；
中性粒细胞弹性蛋白酶标准物。
试剂盒的使用参照说明书中描述的检测方法进行。9
权利要求
1.一种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)制备核酸适配体修饰的酶标板先将链霉亲和素修饰到酶标板上，再利用生物素与链霉亲和素的强相互作用将5’端带有生物素标记的核酸适配体固定到酶标板上；所述的核酸适配体的序列为SEQ ID NO 1 ； (2)捕获反应利用上述酶标板在捕获反应溶液中与样品温育，捕获样品中的中性粒细胞弹性蛋白酶，分离，用洗涤溶液洗涤； (3)酶催化反应将含有中性粒细胞弹性蛋白酶底物的酶反应溶液加入到捕获反应后的酶标板中，在37° C下进行酶催化反应；加入酶反应终止溶液，终止催化反应；所述的中性粒细胞弹性蛋白酶底物为生色底物； (4)检测测定催化反应终止后溶液的吸光度；根据中性粒细胞弹性蛋白酶的标准品所得检测结果，绘制标准曲线，根据待测样品的检测结果，对照标准曲线求出待测样品中中性粒细胞弹性蛋白酶的含量。
2.如权利要求I所述的一种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中性粒细胞弹性蛋白酶底物为荧光底物；所述的步骤(4)检测测定催化反应终止后溶液的荧光强度；根据中性粒细胞弹性蛋白酶的标准品所得检测结果，绘制标准曲线，根据待测样品的检测结果，对照标准曲线求出待测样品中中性粒细胞弹性蛋白酶的含量。
3.如权利要求I所述的一种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的生色底物为 N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val p-nitroanilide,其在酶反应溶液中浓度为O. 84mM。
4.如权利要求2所述的一种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的突光底物为 N-Methoxy succiny l-Ala-Ala-Pro-Val-7-ami do-4-methy I Coumarin,其在酶反应溶液中浓度为O. 2mM。
5.如权利要求I或2所述的一种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的捕获反应溶液组成为100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM MgCl2,6mMKC1,0. l%Tween 20 ；pH=7. 0。
6.如权利要求I或2所述的一种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的洗涤溶液组成为100mM Tris-HCl，150mM NaCl, 2mM MgCl2,6mMKC1,0. l%Tween 20 ；pH=7. 0。
7.如权利要求I或2所述的一种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的酶反应溶液组成为50mM Tris-HC1,1M NaCl, IOmM CaCl2,O.l%Tween20 ；pH=8. O。
8.如权利要求I或2所述的一种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的酶反应终止溶液是体积浓度为20%的乙酸溶液。
9.一种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的试剂盒，其特征在于包括 核酸适配体修饰的酶标板其按如下方法制得先将链霉亲和素修饰到酶标板上，再利用生物素与链霉亲和素的强相互作用将5’端带有生物素标记的核酸适配体固定到酶标板上；所述的核酸适配体的序列为SEQ ID NO :1 ;中性粒细胞弹性蛋白酶底物为生色底物其为N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Valp-nitroanilide,其在酶反应溶液中浓度为O. 84mM ； 捕获反应溶液100mM Tris-HCl, 150mM NaCl,2mM MgCl2,6mM KC1,0. l%Tween20,pH=7. 0 ；洗涤溶液IOOmM Tris-HCl, 150mM NaCl，2mM MgCl2,6mM KCl，0. l%Tween 20，pH=7. 0 ；酶反应溶液50mM Tris-HCl, IM NaCl，IOmM CaCl2,0. l%Tween 20，pH=8. 0 ； 酶反应终止液体积浓度为20%的乙酸溶液； 中性粒细胞弹性蛋白酶的标准物。
10.如权利要求9所述的一种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的试剂盒，其特征在于，所述透明的酶标板用黑色的酶标板代替，所述的生色底物用荧光底物N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-7-amido-4-methylcoumarin 代替,其在酶反应溶液中浓度为O. 2mM。
全文摘要
本发明提供了一种基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法及其试剂盒，本发明将核酸适配体修饰到酶标板上作为识别试剂，选择性捕获中性粒细胞弹性蛋白酶分子，再通过中性粒细胞弹性蛋白酶催化底物反应生成产物，通过测定吸光度或荧光强度的变化，实现对人中性粒细胞弹性蛋白酶的高灵敏高特异性检测。本发明具有操作简单、快速、易于高通量检测、特异性好、灵敏度高的优点。
文档编号G01N33/558GK102928586SQ20121040278
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者赵强, 程琳 申请人:山西大学