专利名称：以两相酶生物传感器实时监测葡萄糖氧化酶活力的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测氧化还原酶催化活性的方法。具体涉及到采用溶液中的葡萄糖氧化酶(GOx)和固定化的辣根过氧化物酶(HRP)所构成的双相酶生物传感器对GOx酶的活力进行不间断监测的工艺方法。
背景技术：
GOx酶多是从黑曲霉、青霉素、米曲霉等中提取，已广泛用于食品加工和血糖的医学测量。在食品工业中，GOx酶已普遍在牛奶、啤酒、水果、肉类等的去氧保鲜，以及蛋类和油炸食品的脱糖等领域得到了应用。在血糖检测中，葡萄糖传感器就是将难以直接测定的葡萄糖进行氧化，生成易于测定的02或!1202。O2可利用瓦勃呼吸仪进行测量(第一代传感器)，而H2O2可以通过在625nm下检测H2O2与邻联甲苯胺的蓝色生成物进行测定。后来，用二茂铁等电子媒介体代替了 O2 (第二代传感器)，这不仅解决了溶液中溶解氧缺乏的问 题，也使其他电极代替钼电极成为了可能。有学者将GOx酶和HRP酶同时固定在电极上设计出双酶传感器[刘海鹰，邓家祺·分析化学1995，23 :154-158 ;Lomillo MAA et al.，Anal. Chim. Acta2005,547 :209-214 ；Delvauxa M et al. , Biosens.Bioelec. 2005, 20 1587-1594 ;李春香，曾云龙.分析科学学报 2006，22 :339-341 ;Vanesa Sanz V et al.，Biosens. Bioelec. 2007，22 :2876-2883 ;郭小丽等·物理化学学报 2007，23 :585-589 ;李于善等·化学世界2009，11 :657-664 ;林洁华等·中国科学B辑化学2008，38 :1011-1017 ;李峰等.中国科学B辑化学2009，39 :640-645]。将GOx酶催化产生的H2O2再经HRP酶的催化进一步还原成H2O,同时测量电信号。再后，有人尝试采用直接电子传递法进行测量(第三代传感器)。作为一类重要的氧化还原酶，对GOx酶的活力测定和反应动力学研究是生物化学、医学和食品工业等领域必不可少的手段。现有的GOx酶活性测定可分为气压法、化学滴定法和电极法。其中，气压法依据的是以瓦勃呼吸仪测量GOx酶催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸时的耗氧量。化学滴定法是用过量的氢氧化钠滴定中和生成的葡萄糖酸，然后用盐酸进行反滴定。氧电极法则是用钼电极的电化学信号测量H2O2的生成。检测方法通常分为终态测量和连续测量。前者包括气压法、显色法、液相色谱法、传感器法等，在对糖尿病人的血糖检测方面，当前普遍使用的血糖仪亦是一种终态测量方法。这些检测多是在催化反应进行一段时间后，通过蛋白质变性、冷却、稀释等方法停止反应，在反应的终态对底物或产物进行测量。它们不能对酶活性的实时变化进行连续跟踪；而后者包括紫外光谱、荧光光谱、动力学分析等方法，它们可以对酶活性进行连续跟踪。
发明内容
本发明的目的之一是设计一种两相双酶传感器。本发明的目的之二是为连续监测葡萄糖氧化酶的活力提供一种实验方法。
传统的双酶传感器是GOx酶与HRP酶一同固定在电极上，目的是测定葡萄糖的浓度，而不是酶的活力。本发明所检测的目标则是溶液中的游离酶。为了达到上述目的，本发明将GOx酶溶解于电解液中；只将HRP酶固定在电极表面上，形成两相酶体系。在该体系中，β -D-吡喃葡萄糖分子在GOx酶的催化下被溶液中的溶解氧氧化生成葡萄糖酸和Η202。H2O2进一步被固定在电极上的HRP还原成H2O,而HRP则被氧化成两种HRP中间体。氢醌分子将HRP氧化中间体重新还原 成HRP，自身氧化成苯醌。苯醌分子在负电极上得到电子重新还原为氢醌，而电极失去电子产生电流。这一连串的反应的总体结果是，GOx酶催化葡萄糖分子氧化为葡萄糖酸，同时产生电流。电流能够敏感地反映出氧化反应的相对速率，并能够通过反应速率来计算酶催化活力。具体工艺如下电化学传感器采用酶生物传感器三电极系统将玻碳电极作为工作电极，钼丝作为对电极，甘汞电极(SCE)作为参比电极(附图I)。将HRP酶与牛血清白蛋白(BSA)混合并覆盖在玻碳电极上，加入戊二醛使BSA交联成膜。将酶修饰后的玻碳电极浸入到含有氢醌的电解液中，同时浸入对电极和参比电极。加入微量H2O2，使电化学工作站在-O. 4 O. 2V的电压范围内进行循环伏安扫描，以确定生物传感器的还原峰值电压，并在随后进行电流-时间曲线测定中施加这一电压。在峰值电压下，测定电流随时间的变化，得到背景电流-时间曲线(计时安培线)。在溶液中，加入GOx酶和微量的β-D-吡喃葡萄糖后电流呈现出线性上升的趋势(附图2)，这说明酶催化反应已经开始。由于酶催化葡萄糖氧化过程中不断生成H2O2，其生成的速率等于葡萄糖氧化的速率。而生成的H2O2在HRP酶的催化下将氢醌氧化为苯醌，苯醌可夺取电极上的电子而还原，这样H2O2在电极表面的浓度正比于电子的流速(即电流)。电流上升的斜率反映了 H2O2浓度的增高。从H2O2浓度上升的速率可计算出葡萄糖氧化酶的活力。搅拌或旋转圆盘电极可明显改善传感器体系的传质效应，使电极扩散层变薄。对流使H2O2分子更容易接近电极表面，电极表面的H2O2浓度更接近于本体浓度，从而使固定HRP酶的效率上升，输出电流也随之整体抬升。但传质的改善并不影响GOx酶的催化效率。在加入葡萄糖大约20s后，电流则以较慢的速率平稳上升，在测试期间(特别是在反应的初期)呈线性。在葡萄糖浓度O. 25、0. 5、0. 75、1和1.25mm0l/L下，斜率分别为-I. 013,-1. 97,-2. 845,-3. 825和-4. 484 μ A/s。它们代表了反应的初速率，并且反映了酶在该底物浓度下的相对活力。传感器电流⑴上升斜率的变化与β -D-吡喃葡萄糖的浓度[GOx]有关，它符合Michaelis-Menten方程。将附图2的数据代入Lineweaver-Burk方程，拟合得到直线1/i=O. 24(±1· 79X10_3)/[G0x]+0. 028( + 3. 87X 1(Γ3)，相关系数为 O. 999，ρ < O. 0001，由此得到动力学常数 imax = -O. 24/0. 028 = -3. 57 μ A 和 K111 = 1/0. 24 = 8. 57 X l(T3mol/L。如果标定了在实际葡萄糖浓度下的传感器电流，并绘制了标准校对曲线，即可将电流值换算成葡萄糖浓度，由此可换算成Michaelis常数Km和最大速率Vmax (转换数keat)。值得注意的是传质会影响动力学电流的测量。但根据Levich方程，当搅拌或电极的转数恒定时，传质控制电流亦为定值，并不对动力学方程的形式产生影响。本发明所构建的传感器提供了一种新型的葡萄糖氧化酶活性检测方法，特别适用于对酶动力学和酶机理的分析研究，并可对酶活性的变化进行连续监测。本发明的优点在于I.本发明所述的方法可用于酶活性检测。为酶活性实验，特别是为需要对酶活性进行精密的，不间断的监测的研究和应用领域提供了一种新的方法，同时为酶传感器提供了一种新的应用途径。2.本发明所述的方法可对酶动力学、酶抑制和酶催化机理的研究提供一种实验技术。特别适用于在外界刺激下酶活性的变化进行实时跟踪。3.本发明所述的方法也可用于微量葡萄糖浓度的测量，为发展能够对血糖进行连续测量的仪器提供了一种可借鉴的途径。
图I是两相酶传感器结构示意图。GOx为葡萄糖氧化酶，HRP为辣根过氧化物酶。图2描绘了在不同葡萄糖浓度下电流随时间变化的曲线。在HRP传感器中，向电解液中加入葡萄糖氧化酶，并分别在不同的测量体系中加入β -D-吡喃葡萄糖，使葡萄糖的浓度分别为O. 25,0. 5,0. 75、I. O和I. 25mmol/L，得到5条以不同斜率上升的计时安培线。
具体实施方式
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实施例I :在修饰前，用砂布上覆盖O. 05mm的氧化铝糊浆对玻碳电极的表面进行打磨抛光，随后分别用丙酮、50% NaOH溶液、50%硝酸、双蒸水对玻碳电极进行超声清洗，室温干燥。将2. 5mg300U/mL HRP 和 4mg BSA 溶于 O. 2mL 的磷酸盐缓冲液(O. 05mol/L, pH 值7.0)中形成混合液。然后将20 μ L的混合液滴加到玻碳电极表面。再将电极置于一个含有25%戊二醛蒸汽的封闭的容器内进行交联4h，室温干燥lh，在4°C下储藏待用。实施例2 用电化学工作站(ChemLab-IO)和一套常规的三电极系统进行循环伏安实验。其中，以修饰过的玻碳电极作为工作电极；钼丝作为对电极；饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极；PBS(0. 05mol/L, pH值7· O)作为支持电解液。循环伏安实验的电势扫描范围(相对于SCE)为-0.4 0.2V，扫描速率100mV/s。实验在室温下进行。实施例3 考察底物影响的实验在盛有IOmL支持电解液的反应池中进行。在搅拌或旋转圆盘电极作用下，加入O. 2mg/L的GOx (EC1. I. 3. 4，35U/mg，来自黑曲霉)和lmmol/L氢醌，在-O. 25V电压下记录初始电流的基线。待基线平稳后(约50s后)，分别加入浓度为O. 25、
O.5、0. 75、I和I. 25mmol/L的β -D-吡喃葡萄糖溶液，分别得到呈逐渐上升趋势的电流_时间曲线。实施例4 求出在反应初期给定葡萄糖浓度下电流-时间曲线上升的斜率。将不同葡萄糖浓度下的斜率代入Lineweaver-Burk方程，即可求出常数imax和Km。如果标定了在实际葡萄糖浓度下的传感器电流，即可将电流值换算成葡萄糖浓度。
权利要求
1.一种检测葡萄糖氧化酶活力的工艺方法，其特征在于所述的工艺方法是采用电化学传感器通过连续测量葡萄糖氧化反应的速率来获得葡萄糖氧化酶活力的。
2.根据权利要求I所述的一种检测葡萄糖氧化酶活力的工艺方法，其特征在于电化学酶传感器是一种两相酶体系；葡萄糖氧化酶溶解在溶液中，而辣根过氧化物酶固定在电极表面上。
3.根据权利要求I所述的一种检测葡萄糖氧化酶活力的工艺方法，其特征在于辣根过氧化物酶是通过牛血清白蛋白与戊二醛的交联固定在电极表面上的。
4.根据权利要求I所述的一种检测葡萄糖氧化酶活力的工艺方法，其特征在于溶液中含有作为底物的β-D-吡喃葡萄糖。
5.根据权利要求I所述的一种检测葡萄糖氧化酶活力的工艺方法，其特征在于溶液中含有作为电子媒介体的氢醌。
全文摘要
本发明公开了一种电化学测量葡萄糖氧化酶(GOx)催化活性的工艺方法。所述的工艺方法是构建一种两相酶电化学传感器通过对H2O2浓度的不间断测量来实现的，而H2O2浓度的连续上升则来源于葡萄糖在GOx酶催化下的氧化反应。体系中GOx酶溶解在电解液中，辣根过氧化物酶(HRP)固定在电极上。溶液中的GOx酶将葡萄糖氧化为葡萄糖酸同时生成H2O2。HRP酶则催化氢醌将扩散到电极表面的H2O2还原，而被氧化的氢醌在电极上获取电子而产生电流。在这一反应序列中，传感器的输出电流与葡萄糖和H2O2的浓度有着化学计量关系，由此可计算出GOx酶的活力。此方法可作为GOx酶活力检测的一种新手段具有灵敏、简便和设备成本低的特点。
文档编号G01N27/48GK102901767SQ20121040760
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者黄积涛, 黄薇, 宫泽, 李敏 申请人:南开大学