专利名称：一种口蹄疫病毒抗体的elisa试剂盒及其制备方法
一种口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒及其制备方法技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种口蹄疫病毒(FMDV)抗体的ELISA试剂盒及其制备方法，利用非蛋白多聚体定向偶联FMDV人工合成多肽作为抗原快速检测口蹄疫病毒。
技术背景
口蹄疫由口蹄疫病毒(FMDV)所致急性、热性、高度接触性传染病。主要侵害偶蹄兽，以发热、口腔黏膜及蹄部和乳房皮肤发生水泡和溃烂为特征，是国际兽疫局规定的A类传染病，易通过空气传播，传染性强，流行迅速，偶尔感染人，主要发生在与患畜密切接触的人员，多为亚临床感染。
对畜牧产业来讲，口蹄疫是一个相当大的经济威胁，这种高传染性疾病影响所有的偶蹄类动物，并且在世界上广泛传播。FMD的病原为口蹄疫病毒(Foot- and- mouth disease virus, FMDV)。口蹄疫病毒(FMDV)属于小RNA毒科口蹄疫病毒属，有A、0、C、 Asial、SAT1、SAT2、SAT3七个血清型，各血清型间无交叉免疫保护，这种血清型可以用传统的 血清学方法诊断。
FMDV基因组为单股正链RNA，长约8. 5Kb。基因组的中部是一个大的开放阅读框 (0RF)，编码病毒的多聚蛋白，该聚蛋白经裂解后形成L前导蛋白、Pl区结构蛋白、P2区和 P3区非结构蛋白。FMDV Pl区结构蛋白最终成熟裂解为4种结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4。 研究发现FMDV抗原位点几乎都集中在Pl区，其中VP1、VP2、VP3、位于抗原蛋白衣壳表面， VP4位于衣壳内部，4种结构蛋白都具有免疫原性。现已证明，对于O型口蹄疫，有3个中和性抗原位点在VPl上，位于21 40、141 160、200 213位氨基酸，其中141 160位及200 213位氨基酸为B细胞表位，引发体液免疫反应。从病毒衣壳蛋白分离的VPl可诱导动物产生针对该表位的中和性抗体。
目前世界各地对病毒类疾病的诊断方法主要有病毒分离、分子生物学诊断 (RT-PCR)和基于血清学试验的免疫过氧化物酶细胞单层测定法(IPMA)，中和试验(SN)，间接免疫荧光试验(ILFT)，和酶联免疫吸附试验(ELISA)等等。与其他方法与相比，ELISA检测操作简便，易于标准化，快速敏感，非常适合进行大规模流行病调查和疫病监测。ELISA检测又分为间接ELISA和竞争ELISA。传统的ELISA法检测中，包被抗原的用量大，一般需要 5 ομ g/mL。由于抗原的使用量大，使得其检测成本也较为高昂，不利于该方法的推广使用。目前市面上销售的产品主要为荷兰赛迪诊断公司的口蹄疫病毒O型抗体检测试剂盒， 它只能检测O型口蹄疫病毒，不能检测其他血清型，且价格昂贵。
近年来，人们已经开始尝试利用衣壳蛋白上的抗原表位设计重组基因工程抗原， 或者使用人工合成的特异免疫活性多肽来检测和预防FMD。如能将合成多肽更广泛地用于疾病诊断的试剂中，可以缩短产品的研发时间，简化生产程序，降低生产成本。但是合成多肽成功地用于疾病的诊断的成功例子很少。这是由于保持包被多肽在固相(ELISA板)上正确方向性的技术问题一直未解决，从而严重影响了多肽与目标抗体的结合，导致多肽ELISA 的灵敏度偏低，非特异背景读值偏高
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种检测口蹄疫病毒(FMDV)抗体的ELISA试剂盒，利用非蛋白多聚体定向偶联FMDV人工合成反应原性多肽作为抗原，以获得灵敏度高、特异性高、操作简单、并快速检测口蹄疫病毒的ELISA检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种口蹄疫病毒(FMDV)抗体的ELISA试剂盒的制备方法。
为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下一种口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，包括非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液包被的酶标板；阳性血清和阴性血清各I管，其中阳性血清为FMDV标准阳性血清稀释液，阴性血清为FMDV标准阴性血清稀释液；用辣根过氧化物酶标记羊抗猪 IgG的稀释液的酶标二抗I瓶；抗体稀释液I瓶；底物显色液I瓶；终止液I瓶。
所述非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液是非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原用包被液按照O. 01 μ g/mL- 5 μ g/mL浓度稀释； 偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原是通过以下方法制备得到的1)选取反应原性多肽溶解，得到多肽溶液；2)取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液；3)在多肽溶液或非蛋白多聚体溶液中加入偶联剂，混合均匀；4)将多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均匀，搅拌反应，使多肽偶联到非蛋白多聚体·上；5)用透析袋去除未参与结合的偶联剂及游离多肽，纯化，冻干，得到偶联多肽；其中口蹄疫病毒反应原性多肽为SEQ ID NO:1 SEQ ID NO: 18系列多肽中的一种或几种。
优选的，所述偶联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳二亚胺(EDC)、N, N' -二环己基碳二亚胺(DCC)U-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚基胺盐酸盐(EEDQ)、戊二醛中的一种或两种以上混合。
优选的，所述非蛋白多聚体为具有可偶联基团的多糖，可偶联基团为氨基(-NH2)， 羧基(-C00H)，巯基(-SH)中的至少一种。
本发明中通过DNAStar、Genebank、ProtScale等分析软件对猪口蹄疫病毒蛋白的抗原表位进行预测，确定天然抗原的氨基酸序列，然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇 (印itopes)。使用ELISA检测不同多肽与猪口蹄疫病毒抗血清的反应，最后选出具有良好反应的口蹄疫病毒反应原性多肽。
本发明中所述偶联多肽抗原包被液包被的酶标板是用非蛋白多聚体定向偶联多肽抗原包被液包被酶标板，每孔100 μ L, 4°C过夜包被,包被浓度为O. 01 μ g/mL- 5 μ g/mL, 用PBST洗涤液250 μ I/孔洗涤2-4次后拍干，用封闭液150 μ I/孔，37°C封闭lh，洗涤液 PBST 250 μ I/孔洗涤3次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4°C保存；所述包被液为1.59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9· 6，并定容至1000mL。本发明中所采用的酶标板为至少8孔的酶标板，优选的为48孔或96孔的酶标板。本发明中所述的辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG的稀释液是用HRP保护液按照辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG与HRP保护液体积比为1: 2000-10000的比例稀释，酶标二抗每瓶量为 12mL ;所述 HRP 保护液为 O. 1% BSA，l.Og BSA, 0.25% EDTA, 2. 5gEDTA，加PBS 至 IOOOmL0本发明中所述的FMDV标准阳性血清稀释液是用抗体稀释液按照体积比为1:16-64的比例将FMDV标准阳性血清稀释，每管量为ImL ；FMDV标准阴性血清稀释液用抗体稀释液按照体积比为1:16-64的比例将FMDV标准阴性血清稀释，每管量为lmL。本发明中所述的抗体稀释液为O. 1%BSA,1. Og BSA加入PBS至IOOOmL ;每瓶量为12mL0 本发明中所述的底物显色液为50mg TMB, IOmL DMS0，9. 8g柠檬酸和L 2mL 30%H2O2加蒸馏水定容至IOOOmL ;每管量为12mL。本发明中所述的终止液包括双蒸水178. 3mL和98%的浓硫酸21. 7mL,每管量为6mT, η
本发明所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒还包括I瓶洗涤液，所述洗涤液为O. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12Η20，8· Og NaCl，0. 2g KC1，0. 5mL Tween-20 (0. 05% V/V)，力口双蒸水定容至IOOmL, pH值为7. 4。一种口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒的制备方法，包括以下步骤
O用非蛋白多聚体偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液包被酶标板将非蛋白多聚体偶联多肽抗原用包被液稀释，然后将稀释的偶联多肽抗原包被酶标板，每孔100 μ L，4°C过夜包被，包被浓度为0. 01 μ g/mL- 5 μ g/mL,次日用PBST洗涤液250 μ I/孔洗涤2_4次后拍干，用封闭液150 μ I/孔，37°C封闭lh，洗涤液PBST 250 μ I/孔洗涤3次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4°C保存；
2)抗体稀释液(AD)配制称取1.Og BSA (O. 1%)，加PBS至1000mL，4°C保存；
3)底物液显色液配制4mLTMB (50mg TMB溶于IOmL DMSO中)，9. 8g柠檬酸，1. 2mL30% H2O2加蒸馏水定容至IOOOmL，4°C避光保存；
4)终止液配制双蒸水178.3mL，逐滴加入浓硫酸(98%) 21. 7mL ；
5)阴阳性血清稀释用抗体稀释液按阳性血清/阴性血清与抗体稀释剂按体积比为1:16-1:64稀释，ImL/管分装，4°C保存；
6)酶标二抗配制用HRP保护液按HRP保护液与辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG体积比为1:2000-1:10000的比例稀释辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG，4°C保存；
7)试剂盒的组装将非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被的酶标板I块、ImL/管的阴阳性血清各I管、12mL/瓶的抗体稀释液I瓶、12mL/瓶的酶标二抗I瓶、12mL/瓶的底物显色液I瓶、6mL/瓶的终止液I瓶、操作说明书一份组装成ELISA试剂盒。上述制备方法中所述的包被液为1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9. 6，并定容至1000mL。相比现有技术，本发明的有益效果在于本发明采用非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原作为包被抗原，有效提高多肽与目标抗体的结合效率，从而显著提高可检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高，本发明的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒具有操作简单、诊断速度快、在进行大规模检测中经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。采用本发明的ELISA检测试剂盒检测口蹄疫病毒抗体，包被抗原用量可减至10ng/mL，降低了检测成本，有利于推广使用。下面结合具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。
具体实施例方式本发明中所采用的偶联多肽的制备方法如下
O口蹄疫病毒反应原性多肽的筛选
有效多肽段的选择和确定，通过DNAStar、Genebank、ProtScale等分析软件对猪口蹄疫病毒蛋白的抗原表位进行预测，确定天然抗原的氨基酸序列，然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇(印itopes)，使用ELISA检测不同多肽与猪口蹄疫病毒抗血清的反应，最后选出具有良好反应的口蹄疫病毒反应原性多肽，本发明中采用以下筛选出来的多肽如下
Pl Lys Tyr Ser Asp Ala Arg Val Ser Asn Val Arg Gly Asp Leu Arg Val Leu AlaGln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro Thr Ser Ser Asn Tyr ；
P2 Lys Tyr Ser Asp Ala Arg Ala Ser Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu AlaGln Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
P3 His Gln Thr Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala GluArg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe ；
P4 Ser Lys Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val LeuAla Gln Lys Ala Glu Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe ；
P5 Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn ThrVal Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala GlnLys Ala Glu Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe ；
P6 Lys Tyr Asp Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu AlaGln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
P7 Lys Tyr Ala Glu Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu AlaGln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
P8 Lys Tyr Ala Gly Gly Pro Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Arg Val Leu AlaGln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
P9 Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu AlaGln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
PlO Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu AlaPro Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
Pll Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu AlaGln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
P12 Lys Tyr Gly Lys Ser Pro Val Ala Asn Ala Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu ThrPro Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr ；
权利要求
1.一种口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于包括非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液包被的酶标板；阳性血清和阴性血清各I管，其中阳性血清为FMDV标准阳性血清稀释液，阴性血清为FMDV标准阴性血清稀释液；用辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG的稀释液I瓶；抗体稀释液I瓶；底物显色液I瓶；终止液I瓶。
2.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液是非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原用包被液按照O. 01 μ g/mL- 5 μ g/mL浓度稀释，偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原是通过以下方法制备得到的1)选取反应原性多肽溶解，得到反应原性多肽溶液；2)取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液；3)在反应原性多肽溶液或非蛋白多聚体溶液中加入偶联剂，混合均匀；4)将反应原性多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均匀，搅拌反应，使反应原性多肽偶联到非蛋白多聚体上；5)用透析袋去除未参与结合的偶联剂及游离多肽，纯化，冻干，得到多聚体偶联反应原性多肽；其中口蹄疫病毒反应原性多肽为SEQ ID NO:1 SEQ ID NO: 18系列多肽中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液包被的酶标板是用非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液包被的至少8孔的酶标板，每孔ΙΟΟμ L，4°C过夜包被，包被浓度为O. 01 μ g/mL- 5 μ g/mL,用PBST洗涤液250 μ I/孔洗涤2-4次后拍干，用封闭液150 μ I/ 孔，37°C封闭lh，洗涤液PBST 250 μ I/孔洗涤3次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4°C保存；所述包被液为1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9.6，并定容至IOOOmL0
4.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG的稀释液是用HRP保护液按照辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG与 HRP保护液体积比为1: 2000-10000的比例稀释，酶标二抗每瓶量为12mL ;所述HRP保护液为 O. 1%BSA1. Og, O. 25%EDTA2. 5g，加 PBS 至 IOOOmL0
5.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述FMDV标准阳性血清稀释液是用抗体稀释液按照体积比为1:16-64的比例将FMDV标准阳性血清稀释，每管量为ImL ;FMDV标准阴性血清稀释液用抗体稀释液按照体积比为1:16-64的比例将FMDV标准阴性血清稀释，每管量为lmL。
6.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述抗体稀释液为O. 1%BSA,1. Og BSA加入PBS至IOOOmL ;每瓶量为12mL。
7.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于所述底物显色液为50mg TMB ,IOmL DMS0，9. 8g柠檬酸和L 2mL 30% H2O2加蒸馏水定容至 IOOOmL ;每管量为12mL。
8.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述终止液包括双蒸水178. 3mL和98%的浓硫酸21. 7mL,每管量为6mL。
9.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于其还包括I 瓶洗涤液，所述洗涤液为 O. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12Η20，8· Og NaCl，0.2g KCl，0.5mL Tween-20 (0. 05% V/V)，加双蒸水定容至 IOOmL, pH 值为 7. 4。
10.一种口蹄疫病毒抗体的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)用非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被液包被酶标板；2)抗体稀释液配制；3)底物液显色液配制；4)终止液配制；5)阴阳性血清稀释；6)酶标二抗配制；7)试剂盒的组装将非蛋白多聚体定向偶联口蹄疫病毒反应原性多肽抗原包被的酶标板I块、阴阳性血清各I管、抗体稀释液I瓶、酶标二抗I瓶、底物显色液I瓶、终止液I瓶、 操作说明书一份组装成ELISA检测试剂盒。
全文摘要
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种口蹄疫病毒(FMDV)抗体的ELISA试剂盒及其制备方法，利用非蛋白多聚体定向偶联FMDV人工合成多肽作为抗原快速检测口蹄疫病毒。本发明采用非蛋白多聚体定向偶联多肽抗原作为包被液，有效提高多肽与目标抗体的结合效率，从而显著提高可检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高。本发明的口蹄疫病毒抗体ELISA检测试剂盒具有操作简单、诊断速度快、在进行大规模检测中经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。采用本发明的ELISA检测试剂盒检测口蹄疫病毒抗体，包被抗原用量可减至10ng/mL，降低了检测成本，有利于推广使用。
文档编号G01N33/68GK102998460SQ201210427310
公开日2013年3月27日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者李其昌, 陈善真, 李中圣, 刘小琴, 罗均, 赵焱, 陈克宏, 王贵平 申请人:广东现代农业集团研究院有限公司