一种检测杂色曲霉毒素的快速检测试剂板的制备方法
【专利摘要】本发明是一项检测杂色曲霉毒素的快速检测试剂板的制备方法，主要由上下两块塑料卡壳，试纸条组成。其中，试纸条的底层为支撑层。中间层为吸附层，固定在支撑层上；外层为保护层，固定在吸附层上，吸附层从测试样品端依次为纤维层，吸附偶联杂色曲霉毒素的金标载体蛋白纤维层，纤维素膜层，手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上有用杂色曲霉毒素的载体蛋白溶液划的检测印迹，称T线，用羊抗兔抗抗体溶液划对照印迹，称C线。最后的测试结果由C线和T线所显的颜色判断。本产品具有成本低，方法快速、简便，准确率高等特点。
【专利说明】一种检测杂色曲霉毒素的快速检测试剂板的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品安全检测领域，具体涉及检测粮食作物如大麦、小麦、玉米，饼柏、豆饼、花生饼和常见饲草、麦秸和稻草等是否被杂色曲霉毒素污然。
【背景技术】
[0002]杂色曲霉素(ST)主要是杂色曲霉和构巢曲霉的最终代谢产物，同时又是黄曲霉和寄生曲霉合成黄血霉毒素过程后期的中间产物。据报道，感染了杂色曲霉的玉米在27°C的环境下，21天可产生杂色曲霉毒素12 g/kg以上。杂色曲霉毒素在1954年由杂色曲霉培养物中首先分离出的，但并未引起人们的足够重视，至发现黄曲霉毒素的强致癌性后，才开始注意。用14?标记方法已证实杂色曲霉毒素能转变成黄曲霉毒素马，而且有人认为杂色曲霉毒素可能是非洲某些地区肝癌的病因。
[0003]能产生ST的菌种主要是杂色曲霉、构巢曲霉和离蠕孢霉。此外，谢瓦曲霉、赤曲霉、焦曲霉、阿姆斯特丹曲霉、黄褐曲霉、四脊曲霉、变色曲霉、爪曲霉、毛壳霉及黄曲霉和寄生曲霉等也可产生ST。上述这些霉菌广泛存在于自然界，可污染大麦、小麦、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等粮食、食品和饲草，尤其对小麦、玉米、花生等饲料和饲草污染更为严重。产毒量最高的是杂色曲霉，其次是构巢曲霉和离蠕孢霉，前者产生ST的量约为后者的2倍。
【发明内容】
[0004]本发明是一项针对粮食中的杂色曲霉毒素所开展研究，目的是为了克服现有技术的不足，提供一种特异性强，灵敏度高，且操作简单方便，适用于现场快速筛选杂色曲霉毒素阳性样本，只需对样品经过简单处理即可检测的杂色曲霉毒素快速试纸定量检测方法。
[0005]本发明所制作的免疫胶体金检测试剂板由本产品主要由上下两块塑料卡壳,试纸条组成。试纸条包含样品垫、金标垫、NC膜、吸水纸。NC膜上划有检测线(T线)，质控线(C线)。试剂条上依次紧密粘贴着样品垫、金标垫，NC膜和吸水纸。其中样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸相邻之间有2 mm的重叠。其作用有两方面:第一是为了使样品溶液和样品垫之间有充分的反应时间，样品垫上的缓冲体系可以中和样品溶液的酸碱度，保证样品溶液中的有效成分与金标垫上的抗体顺利结合；另一方面是为了让样品溶液顺利通过NC膜的孔，一直延展到吸水纸；金标垫上包被有抗杂色曲霉毒素抗体与胶体金的结合物，检测线和质控线上分别划有杂色曲霉毒素载体蛋白偶联物和羊抗兔抗抗体。
[0006]本发明所制备的快速检测试剂板应用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标垫上的抗体反应显色，快速的检测粮食中的杂色曲霉毒残留。若是样品溶液中含有杂色曲霉毒素，杂色曲霉毒素先和金标垫上的抗体先结合，直至扩散到检测线。因为金标垫上的抗体活性位点因被样品溶液中的杂色曲霉毒素载体蛋白偶联物占据而无法与检测线上杂色曲霉毒素特异性抗原结合。当样品中的杂色曲霉毒素含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色比质控线显色浅甚至不显色，此时结果为阳性。反之，当样品中杂色曲霉毒素含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与控制线相近或偏深，判定为阴性。
[0007]本发明制备的免疫胶体金快速检测试剂板，试剂板的各部分组成成分与功能如下:
1、塑料卡壳:起固定试纸条及标示功能区，显示加样孔，标示检测线、质控线；
2、试纸条为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸和其他配件；
3、样品垫由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液的作用；
4、金标垫由玻纤制成，其上标记有抗杂色曲霉毒素抗体与胶体金的结合物，是样品溶液中的有效成分与金标抗体发生反应的场所；
5、NC膜部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来；
6、吸水纸为较厚的滤纸，其作用是将移动上来的多余的溶液吸收。
[0008]本发明试剂板具有如下有益效果:
(1)特异性好。本发明试剂板的抗杂色曲霉毒素抗体对杂色曲霉毒素的交叉反应率均为100%，与其他种类的抗生素没有交叉反应；
(2)操作简便快速。本发明试剂板将免疫层析反应所需的大部分原料已整合到试剂条中，滴样后抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短了检样时间，滴样后5-8分钟内即可读取结果。本发明试剂板的操作不需任何专业培训，普通人员均可操作，只需按说明滴样后用肉眼判读即可；
(3)不依赖于实验设备。本发明试剂板在直接滴样跑板后，通过肉眼判断NC膜上检测线和质控线的颜色深浅对比来判读结果，整个检测过程无需用到任何实验设备，适合于野外及现场操作，易于推广；
(4)成本低,效益好。本发明试剂板生产工艺简单,可实现单个样本检测,生产成本低，大大降低了检测费用。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]附图1为本发明检测试纸条的结构示意图:
图中I为样液吸收部分2为胶体金标记部分3为检测反应部分4为检测线5为参考线6为吸水部分。
[0010]附图2为本发明试纸条的结果判读图。
[0011]【具体实施方式】
1.胶体金溶液的制备
所需胶体金颗粒的平均大小为30 nm，其制备方法为:制备I L，量取超纯水900 mL于锥形烧瓶中，加热至沸腾。再加入20 mL HAuCl4溶液，加热至激烈沸腾后又加入20 mL柠檬酸钠溶液等颜色转成红色后再继续加热15 min，冷却至室温后用超纯水定容至I L，放入4 °C冰箱保存。
[0012]2.金标垫的制备
取已制备好的胶体金溶液100 mL，用0.1 moL/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入2 mg抗杂色曲霉毒素单抗,搅拌20 min, 20000 r/m离心15 min,弃上清液,加入10 mLP H 7.4的PBS缓冲液清洗2次。将沉淀用10 mL含2 % BSA的PBS缓冲液(pH 7.4)溶解,用0.22 Mm无菌过滤器过滤后，4°C保存备用。
[0013]3.杂色曲霉毒素-BSA偶联物的制备，杂色曲霉毒素抗体的制备
(1)杂色曲霉毒素与载体蛋白的偶联
采用碳二亚胺(EDC-HCl)法将杂色曲霉毒素与载体蛋白偶联制备免疫抗原及包被抗原。称取20 mgBSA,加入I mL蒸懼水。另外用I mL蒸懼水溶解20 mg EDC-HCl和20 mg杂色曲霉毒素，加入到上述溶液中。将溶液混匀后，置于4°C下避光反应12 h(期间可颠倒混匀)。之后用PBS缓冲液透析4天，期间每间隔8小时换液I次。再将溶液离心，收集上清液，-20°C下冻存备用；
(2)杂色曲霉毒素抗体的制备
取6-8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的杂色曲霉毒素-BSA偶联物与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按100 ug/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫I次，用不完全佐剂腹腔注射。融合前3d强化免疫I次，不用佐剂，剂量加倍。
[0014]细胞融合按常规方法进行:
将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:10的比例混合，在50 % PEG作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37°C，5% CO2培养箱中培养。融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛选择10 mg/L杂色曲霉毒素载体蛋白(BSA)偶联物包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠人工IgG-1RP (1:1000)，OPD显色。筛选出的阳性孔再用杂色曲霉毒素-BSA包被的酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2X 10_3 moL/L杂色曲霉毒素溶液等量混合，37°C感作I h，加入已包被的酶标板中。另外用PBS (0.01 moL/L，pH7.4)替代杂色曲霉毒素溶液作对照，其余步骤同上。若杂色曲霉毒素阻断后的OD值降至对照孔的50%以下，则判为阳性孔。经2-3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。
[0015]体外培养:将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5 X IO5 mL时停止换液，细胞全部死亡后收集培养液。体内诱生腹水:给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株10个细胞，7天后抽取腹水。
[0016]4.杂色曲霉毒素免疫胶体金快速检测试剂板的组装
用划膜机把适当浓度的杂色曲霉毒素载体蛋白偶联物及羊抗兔抗抗体在NC膜上，分别作为检测线和质控线，37°C烘箱干燥8 h。检测试剂组成为一个PVC试纸条，在其上按顺序粘上样品垫、金标垫、N C膜和吸水纸。用切割机将贴好的试纸板切割成4 mm宽的条，装入塑料卡壳中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。
[0017]5.杂色曲霉毒素免疫胶体金快速检测试剂板检测实施操作方法
(I)样品处理
(a)直接提取法
将饲料、谷物、麦芽样品进行粉碎以使75%的样品可以通过20目筛，样品的大小颗粒与速溶咖啡相当。称取3.0 g粉碎好的样品，加入9 mL样品提取液(提取液配制:50 mL甲醇+50 mL水，加4 g氯化钠混匀即得样品提取液，可按需配置)，充分搅拌混合(10 min)，静置20 min后轻轻吸取上清液，按1:1比例与样本稀释液混合均匀后进行样品检测；
(b)烘干/吹干处理法 将饲料、谷物、麦芽样品进行粉碎以使75%的样品可以通过20目筛，样品的大小颗粒与速溶咖啡相当。称取3.0 g粉碎好的样品，加入9 mL样品提取液(提取液配制:先用20 mL水将加4 g氯化钠溶解，再加入80 mL甲醇，即得样品提取液，可按需配置)，充分搅拌混合(3分钟)，静置20分钟，轻轻吸取上清液I mL，放于110°C烘箱中烘干(约I h)，用0.5 mL10%甲醇充分溶解后即可进行样品检测。
[0018](2)检测步骤
用一次性吸管缓慢垂直滴加2滴样本(约50 ML)于加样孔，加样后开始计时。加样后切勿移动检测板，5- 8分钟判读结果。
[0019](3)结果判断
阴性(一):T线(检测线，靠近加样孔一端)显色，表明样品中杂色曲霉毒素浓度过低或不含杂色曲霉毒素；阳性(+ )T线无显色，则表明样品中杂色曲霉毒素浓度过高；无效结果:未出现C线(对照线)，可能是操作不当或检测板已失效，用新的检测板重新测试。
【权利要求】
1.这是一项检测大麦、小麦、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等粮食、食品和饲草等中杂色曲霉毒素的快速检测卡快速检测试剂板的制备方法，其特征是NC膜上贴有包被了抗杂色曲霉毒素抗体的胶体金金标垫，从样品垫到吸水纸方向依次的检测线和质控线，上面划的是杂色曲霉毒素载体蛋白偶联物和羊抗兔抗抗体。
2.如权利要求书第一条所述的试剂板制备方法，其特征在于将胶体金与抗杂色曲霉毒素抗体按一定比例混合标记，使其形成稳定的金颗粒，制作成金标垫。
3.如权利要求书第一条所述的试剂板制备方法，本实用新型发明中检测用抗原是杂色曲霉毒素与载体物质形成的偶合物，其中载体物质包括蛋白质、蛋白质片段、合成多肽、半合成多肽、多糖，如血清白蛋白、球蛋白、脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖，示例性的载体物质包括牛血清白蛋白、卵清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、L-多聚赖氨酸等；另外，载体物质也可以是具有活性基团的其他合成或天然聚合物，如白喉毒素、破伤风毒素、酵母、尼龙、右旋葡聚糖、纤维素等，同样也可以用来制备检测用抗原，第二种属动物蛋白指非抗体来源属动物的蛋白，例如，抗体为鼠源性，则第二种属动物蛋白可以是卵清白蛋白、兔血清白蛋白等鸡、兔或其他非鼠源性动物蛋白。
4.如权利要求书第一条所述的试剂板制备方法，其特征在于样品中杂色曲霉毒素的多少和检测板上的检测线显色深浅有关，如果检测线显色较浅或不显色，断定为阳性，反之为阴性。
5.如权利要求书第一条所述的试剂板制备方法，其特征在于工艺流程包括制备抗杂色曲霉毒素抗体,制备胶体金溶液,制备胶体金标记抗杂色曲霉毒素抗体和组装杂色曲霉毒素免疫胶体金快速检测试剂板。
【文档编号】G01N33/558GK103808925SQ201210438057
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月6日 优先权日:2012年11月6日
【发明者】杜道林, 祝文珍 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司