专利名称：一种定量检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒以及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于体外核酸诊断领域，涉及一种定量检测游离T细胞受体切除环(T-cell receptor excision circles, TRECs)和 κ -删除重组切除环(κ-deletingrecombinatio n excision circles, KRECs)基因的实时突光定量聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)试剂盒及其应用。
背景技术：
原发性免疫缺陷病(PrimaryImmunodeficiency Disease, PID)是因免疫系统遗传缺陷或先天发育不全造成免疫功能障碍所致的免疫缺陷病，其总发病率为:美国1/10000，澳大利亚2.82/100000人，日本和瑞典1/5000人，我国香港地区1/8000人。国内缺乏全面的统计资料，如果按照1/10000的发病率，我国每年出生的2500万个新生儿中有2500个新发的PID病例，整个儿童期累计患者达到3万-6万例。原发性免疫缺陷病，与遗传相关，常发生在婴幼儿，可出现反复感染，严重的可威胁生命。因其中有些可能获得有效的治疗，因此及时诊断仍很重要。2001年11月，美国疾病控制和预防中心(Centers for DiseaseControland Prevention,⑶C)在乔治亚洲首府亚特兰大召开专题研讨会，建立针对新生儿筛查(Newborn Screening, NBS)实验和早期识别PID的方案，以便能早期诊断和治疗PID患者。2009年美国⑶C在美国维斯康星州进行重症联合免疫缺陷(SevereCombinedImmunodefieieney Disease, SCID)新生儿筛查。按免疫缺陷性质的不同，原发性免疫缺陷病可分为体液免疫缺陷为主(即抗体缺乏为主的免疫缺陷)、细胞免疫缺陷为主以及两者兼有的联合性免疫缺陷三大类。此外，补体缺陷、吞噬细胞缺陷等非特异性免疫缺陷也属于本组。重症联合免疫缺陷病是以T淋巴细胞缺乏或功能异常，伴或不伴有B淋巴细胞和NK细胞数量减少或功能缺陷为特征的一组疾病，新生儿发病率大约在1/50000至1/100000，该病发病年龄早，临床表现重，预后较差，如果没有得到及时的诊断和治疗，多在2岁内死亡。SCID是一种严重的联合免疫缺陷，患儿如果不进行有效的免疫重建，往往在婴儿期死亡，免疫重建的时间与预后的关系密切，如果在出生3个月内进行造血干细胞移植存活率接近95%，而3个月后进行造血干细胞移植存活率降至76%，因此将SCID纳入新生儿筛查非常必要。目前SCID主要分为T-B+SCID和T-B-SCID两大类，其中T-B+SCID的致病原因有Y c基因缺陷、Janus Kinase 3( JAK3)基因缺陷、IL-7R α基因缺陷、CD45基因缺陷、CD3 δ /CD3 ε /CD3 ζ基因缺陷；T_B_SCID的致病原因有RAG1/2基因缺陷、DCLREIC基因缺陷、ADA基因缺陷、DNA PKcs基因缺陷、网状组织发育不全。除此以外，SCID还包括Oemnn综合征、DNA连接酶V1、Cemunnos/XLF缺陷、CD40配体缺陷、CD40缺陷、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺陷、CD3Y缺陷、CD8缺陷、ZAP-70缺陷、MHC I类分子缺陷、MHC II类分子缺陷、钙离子通道缺陷等。导致SCID的原因繁多，诊断非常困难，但是所有SCID的共同特征是成熟T细胞的数量显著降低。T细胞在胸腺中分化的过程是发生在T细胞受体基因的重排的时候，最终是V、D和J基因片段的结合；在每个V、D和J基因片段重排的过程中，都会有被切除的环状DNA产物，被切割下来的DNA形成游离T细胞受体切除环(T-cell receptor excision circles,TRECs)，70%表达α β TCRs的T细胞在成熟晚期都产生5Rec-<pJa TREC。TRECs在T细胞中非常稳定，并不随着细胞的增殖而增加，而是不断被稀释，新生儿TRECs的水平最高，但在出生后5年TRECs的水平明显降低。利用定量PCR检测SRec-Vja TRECs可以反映外周血最新产生的T淋巴细胞数量，病人T细胞中TRECs缺乏或不同程度的减少，可以作为SCID的筛查方法，筛查出T细胞成熟缺陷的新生儿，有利于早诊断早治疗，减少新生儿死亡。抗体缺乏为主的免疫缺陷病属于细胞免疫缺陷类，是由于B细胞早期发育障碍引起的一组原发性免疫缺陷症，由于体液免疫缺陷，容易反复发生细菌感染，表现为B细胞和免疫球蛋白不同程度的减少，是发病率最高的原发性免疫缺陷病。目前分为以下几类:1)严重低丙种球蛋白血症，致病原因有BTK基因缺陷、μ链缺乏、λ 5链缺乏、Ig a缺乏、Ig β缺乏、B细胞连接蛋白(BLNK)缺乏、骨髓发育不良等，其中X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)是最常见的体液免疫缺陷症，其病因是Bruton酪氨酸激酶(Bruton’s Tyrosine Kinase,BTK)缺陷，表现为B细胞和免疫球蛋白显著低下；2)血清IgG和IgA的重度减少伴B细胞正常、减少或显著减少，致病原因有普通变异型免疫缺陷病(Common Variable ImmunodeficiencyDisease, CVID)、可诱导共刺激分子(Inducible Co-Stimulator, IC0S)缺陷、CD19 缺陷、X连锁淋巴组织增殖综合症(X-linked Lymph Proliferative Disease,XLP);3)血清 IgG 和IgA的重度减少，IgM正常或增高(即高IgM综合症)，致病原因有⑶40配体缺陷、⑶40缺陷、活化诱导胞唳脱氨 基酶(Activation-1nduced Cytidine Deaminase, AICDA)缺陷、尿卩密唳N-糖基化酶(Uracil-N-Glycosylase，UNG)缺陷；4)同种型或轻链缺乏，致病原因有Ig重链缺乏、κ链缺乏、选择性IgG亚类缺陷、选择性IgA缺陷等。抗体缺乏为主的免疫缺陷病病因繁多，诊断非常困难，但共同特征是B淋巴细胞缺乏或不同程度的减少。在B细胞成熟过程中，免疫球蛋白的λ链发生的基因重排时形成的κ -删除重组切除环(κ -deleting recombination excision circles, KRECs), KRECs 也不随着细胞的增殖而增加，而是不断被稀释。因为抗体缺乏为主的免疫缺陷病中的B细胞成熟缺陷发生在κ -删除重组前，病人B细胞中KRECs缺乏或不同程度的减少，利用定量PCR法检测KRECs可以作为抗体缺乏为主的免疫缺陷病的新生儿筛查方法，因此通过对KRECs的定量测定可以筛查出患有B细胞成熟缺陷的新生儿。联合筛查新生儿原发性T细胞及B细胞免疫缺陷，能够检测新生儿T细胞和B细胞水平，不仅可以筛查SCID及抗体缺陷为主的免疫缺陷病，而且能够为其他与T细胞和B细胞发育相关的原发性免疫缺陷病或其他系统疾病提供临床相关指征，有利于早期诊断及治疗。但是，目前还缺乏可以联合定量检测TRECs和KRECs的方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种通过定量检测TRECs和KRECs基因的拷贝数，用来筛查新生儿原发性T细胞和B细胞免疫缺陷的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前存在市场上的所有类型的荧光定量基因扩增仪。本发明能够检测新生儿T细胞和B细胞的水平，判断新生儿免疫系统功能正常与否，在临床检验领域有良好的应用前景。本发明的另一个目的是在于提供了筛查新生儿T细胞和B细胞免疫缺陷中的应用，上述试剂盒所需的样本获取、储存方便，灵敏度和特异性高，检测方法简便、快速，实验
结果可靠。为了实现上述的目的，本发明提供:一种定量检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒其中包括DNA提取液、巢式PCR反应液、包含TRECs基因插入序列的标准品1、包含KRECs基因插入序列的标准品I1、包含β _actin基因插入序列的标准品II1、阴性对照品、空白对照品、包含TRECs基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液1、包含KRECs基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液II和包含β -actin基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液 III。在本发明的一个方案中，巢式PCR反应液是由TRECs、KRECs和β-Actin的PCR正向引物、反向引物，2Xtaq PCR MasterMix，lmMMgC12和无菌的超纯水组成。在本发明的一个具体方案中，TRECs基因的巢式PCR正向引物(SEQ NO:1)为5’ -GAGGGCAGCCCTCTCCAAGGCAAAATGG-3’，反向引物(SEQ NO:2)为 5’ -TGATCTTGTCTGACATTTGCTCCGTGGT-3’。KRECs 基因的巢式 PCR 正向引物(SEQN0:3)为 5，-GCTCAGCGCCCATTACGTTTCTG-3’，反向引物(SEQN0:4)为 5，-CTGTGAGGGACACGCAGCCTG-3，。β -actin 基因的巢式 PCR正向引物(SEQ NO:5)为 5’ -CTCATTTCCCTCTCAGGCATGG-3，，反向引物(SEQ NO:6)为5’ -CCACGTCACACTTCA TGATGGA-3’。在本发明的一个方案中，荧光PCR反应液I是由TRECs荧光PCR引物和探针、2.5Xreal time Mix、牛血清白蛋白(BSA)、20xPCR Enhancer和无菌的超纯水组成。在本发明的一个具体方案中，TRECs基因的荧光PCR正向引物(SEQ NO: 7)为5’ -TGAGAACGGTGAATGAAGAGC-3’，反向引物(SEQ NO:8)为 5’ -CCATGCTGACACCTCTGG-3’ 和探针(SEQ NO:9)为 FAM-ACGGTGATGCATAGGCACCTGCACC-TRAMA。在本发明的一个方案中，荧光PCR反应液II是由KRECs荧光PCR引物和探针、2.5 Xreal time Mix、BSA、20xPCR Enhancer和无菌的超纯水组成。在本发明的一个具体方案中，KRECs 基因的荧光 PCR 正向引物(SEQ NO: 10)为 5’-GTGGCATTATTTGTATCACTGTGC-3’，反向引物(SEQ NO: 11)为 5’-CAGCTCTTACCCTAGAGTTTCTGC-3’和探针(SEQ NO: 12)为 VIC-CACGGGAGCAGGTTGGCAGCGC-TRAMA。在本发明的一个方案中，荧光PCR反应液III是由β-Actin荧光PCR引物和探针、2.5 Xreal time Mix、BSA、20xPCR Enhancer和无菌的超纯水组成。在本发明的一个具体方案中，β-actin基因的荧光PCR正向引物(SEQ NO: 13)为 5’-CTCATTTCCCTCTCAGGCATGG-3’，反向引物(SEQ NO:14)为 5’ -CCACGTCACACTTCATGATGGA-3，和探针(SEQN0:15)为VIC-CTGTGGCATCCACGAAACT-TRAMA。在本发明的一个方案中，荧光PCR反应液1、荧光PCR反应液II和荧光PCR反应液III中所述的TRECs、KRECs和β -actin基因的特异性探针均为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光报告基团，是FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的一种；3’端为荧光淬灭基团，是TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。在本发明的反应体系中，可以使用一个或者多个荧光探针，所标记的荧光报告基团可以为一种或者两种。在本发明的一个具体方案中，TRECs标记探针5’端为FAM探针，3’端为TAMRA探针；KRECs标记探针5’端为VIC探针，3’端为TAMRA探针；β -Actin标记探针5’端为VIC探针，3’端为TAMRA探针。在本发明的一个方案中，标准品I是含有插入TRECs基因131个核苷酸片段连接入PUC57载体质粒。在本发明的一个具体方案中，所述的TRECs基因的插入序列(SEQNO:16)为 5’ -TCGTGAGAACGGTGAATGAAGAGCAGACAGGGCCCGTGCCAGCTGCAGGGTTTAGGCACGGGGTGCAGGTGCCTATGCATCACCGTGCACAGGAGTGGGCACCTTTACAAMACCAGAGGTGTCAGCATGG-3，。标准品 I用分光光度计测A26tl定量，存放浓度为1.0Χ IO8拷贝/ul、1.0 X IO7拷贝/ul、1.0 X IO6拷贝/ul、1.0X105 拷贝 /ul、1.0X104 拷贝 /ul、1.0X103 拷贝 /ul 6 个浓度梯度。在本发明的一个方案中，标准品II是含有插入KRECs基因89个核苷酸片段连接入PUC57载体质粒。在本发明的一个具体方案中，所述的KRECs基因的插入序列(SEQ NO: 17)为 5，-TCCCTTAGTGGCATTATTTGTATCACTGTGCACAGTGTGCGCTGCCAACCTGCTCCCGTGCAGAAACTCTAGGGTAAGAGCTGGCTCCT-3’。标准品II用分光光度计测A26tl定量，存放浓度为1.0X IO8拷贝/ul、1.0X107 拷贝 /ul、l.0XlO6 拷贝 /ul、l.0X IO5 拷贝 /ul、l.0X IO4 拷贝 /ul、1.0X103拷贝/ul 6个浓度梯度。在本发明的一个方案中，标准品荧光PCR反应液III是含有插入β -actin基因70个核苷酸片段连接入PUC57载体质粒。在本发明的一个具体方案中，所述的β-actin基因的插入序列(SEQ NO: 18)为:5’-ATTTCCCTCTCAGGCATGGAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTACCTTCAACTCCATCATGAAGTGTGACG-3’。标准品III用分光光度计测A260定量，存放浓度为1.0X IO8拷贝 /ul、l.0XlO7 拷贝 /ul、l.0XlO6 拷贝 /ul、l.0XlO5 拷贝 /ul、l.0XlO4 拷贝 /ul、
1.0X IO3拷贝/ul 6个浓度梯度。在本发明的一个方案中，阴性对照品为TRECs、KRECs和β -actin重组质粒，其浓度为5.0X IO5拷贝/ul。
`
在本发明的一个方案中，空白对照品为无菌的超纯水。在本发明的另一个方面，还提供了一种定量检测TRECs和KRECs基因的拷贝数，在筛查新生儿T细胞核B细胞免疫缺陷中的应用，实时荧光PCR试剂盒对新生儿T细胞和B细胞免疫缺陷的检测方法，该方法包括下列步骤:I)用DNA提取液对干血滤纸片DNA进行提取:2)将标准品和待测样品加入巢式PCR反应液，用PCR检测仪对TRECs、KRECs和β-actin基因进行扩增；3)将扩增后的PCR产物加入实时荧光定量PCR反应体系，用荧光定量检测仪检测进行PCR检测；4)通过比较待测样品和标准品的循环域值，根据标准曲线计算待测样品的起始TRECs、KRECs 和 β -actin 基因拷贝数。在提取的DNA量足够时，也可不经过巢式PCR反应体系，直接加入实时定量PCR反应体系中去。本发明的有益效果:I)样本获取、储存方便。本发明对新生儿干血滤纸片仅取3mm直径的纸片提取DNA即可完成该项目的检测，干血滤纸片为新生儿常规获得，并且用血量很少，减少新生儿抽取的血量，同时干血滤纸片有利于长期保存，大大降低了样本的获得、储存及运输等问题的出现。2)灵敏度和特异性高。采取特异性引物、探针及巢式PCR，并对样本提取的DNA进行普通PCR扩增18个循环，有效的提高了检测基因的拷贝数，提高了对样本检测的灵敏性，而阳性样本中的TRECs和KRECs几乎没有，使得样本检测结果的阴性与阳性很容易进行判定。3)检测方法简单，检测速度快，结果以拷贝数表示，定量结果准确可靠。有利于在医院及实验室推广应用。4)通过选择样本自身的管家基因β-actin作为内参，若扩增的内参的拷贝数在正常范围内，TRECs和KRECs的拷贝数非常低，则阳性结果可靠，否则需重新测定，因此能更有效地减少假阳性结果的出现，从而保证数据的可靠性。总之，本发明灵敏度高，特异性好，检测方法简单快速，实验结果可靠。本发明填补了原发性免疫缺陷病的普查及新生儿筛查的空白，不仅可以筛查SCID及抗体缺陷为主的免疫缺陷病，而且能够为其他与T细胞和B细胞发育相关的原发性免疫缺陷病或其他系统疾病提供临床相关指征，有利于早期断及治疗。
图1.TRECs标准品real time PCR扩增曲线及标准曲线。图2.KRECs标准品real time PCR扩增曲线及标准曲线。
图3.β-actin标准品real time PCR扩增曲线及标准曲线。图4.正常儿童DNA样本的real time PCR TRECs的扩增曲线。图5.SCID阳性儿童DNA样本的real time PCR TRECs的扩增曲线。图6.正常儿童DNA样本的real time PCR KRECs的扩增曲线。图7.XLA阳性儿童DNA样本的real time PCR KRECs的扩增曲线。图8.空白对照品的扩增曲线。图9.正常儿童DNA样本的real time PCR β-actin的扩增曲线。图10.SCID和XLA阳性儿童DNA样本的real time PCR β-actin的扩增曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如:精编分子生物学指南，F.M.奥斯柏等主编，科学出版社，1995，分子克隆实验指南(第三版);D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。实施例1:试剂盒的制备1.引物与探针的设计与合成根据UCSC 网站上 UCSC Human Gene Sorter 查询 TRECs、KRECs 和 β -actin 基因序列(http://genome, ucsc.edu/cg1-bin/hgNear),利用 Primer3.0 在 TRECs、KRECs和β -actin基因上设计巢式PCR的上下游引物和荧光定量PCR上下游引物和探针，其中TRECs、KRECs和β -actin的巢式PCR上游引物与其基因的结合位置在其实时荧光定量PCR上游引物与该基因结合位置的上游，TRECs、KRECs和β -actin的巢式PCR下游引物与其基因的结合位置在其实时荧光定量PCR下游引物与该基因结合位置的下游。所选引物对于基因的结合有很好的特异性，有较高的PCR扩增效率。引物与探针均委托Life Technologies公司进行合成，其中引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化。TRECs的探针5’端标记为FAM荧光基团，3’端标记为TAMRA荧光基团；KRECs的探针5’端标记为VIC荧光基团，3’端标记为TAMRA荧光基团；β -actin的探针5’端标记为VIC荧光基团，3’端标记为TAMRA荧光基团。引物序列如表I。表I插入基因、特异性引物以及探针序列
权利要求
1.一种定量检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，其中包括DNA提取液、巢式PCR反应液、包含TRECs基因插入序列的标准品1、包含KRECs基因插入序列的标准品I1、包含β-actin基因插入序列的标准品II1、包含TRECs基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液1、包含KRECs基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液II和包含β -actin基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液III。
2.权利要求1所述的试剂盒，其中所述的巢式PCR反应液包括: 1)巢式PCR扩增TRECs基因的正向引物，其碱基序列如SEQNO:1所示； 2)巢式PCR扩增TRECs基因的反向引物，其碱基序列如SEQNO:2所示； 3)巢式PCR扩增KRECs基因的正向引物，其碱基序列如SEQNO:3所示； 4)巢式PCR扩增KRECs基因的反向引物，其碱基序列如SEQNO:4所示； 5)巢式PCR扩增β-actin基因的正向引物，其碱基序列如SEQN0:5所示； 6)巢式PCR扩增β-actin基因的反向引物，其碱基序列如SEQNO:6所示。
3.权利要求1所述的试剂盒，其中所述的荧光PCR反应液I包括: O实时荧光PCR检测TRECs基因的正向引物，其碱基序列如SEQ NO: 7所示； 2)实时荧光PCR检测TRECs基因的反向引物，其碱基序列如SEQNO:8所示； 3)用于检测TRECs基因的探针，其碱基序列如SEQNO:9所示； 其中所述的荧光PCR反应液II包括: O实时荧光PCR检测KRECs基因的正向引物，其碱基序列如SEQN0:10所示； 2)实时荧光PCR检测KRECs基因的反向引物，其碱基序列如SEQN0:11所示； 3)用于检测KRECs基因的探针，其碱基序列如SEQNO: 12所示； 其中所述的荧光PCR反应液III包括: O实时荧光PCR检测β-actin基因的正向引物，其碱基序列如SEQNO: 13所示； 2)实时荧光PCR检测β-actin基因的反向引物，其碱基序列如SEQN0:14所示； 3)用于检测β-actin基因的探针，其碱基序列如SEQNO: 15所示。
4.权利要求1所述的试剂盒，其中所述的标准品I，其碱基序列如SEQNO: 16所示；其中所述的标准品II，其喊基序列如SEQ NO: 17所不；其中所述的标准品III,其喊基序列如SEQ NO: 18 所示。
5.权利要求1至4所述的试剂盒，所述的特异性荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光发光基团，是FAM、VIC、TET、J0E、R0X、CY3、CY5、HEX中的一种；标记探针3’端的为一种荧光淬灭基团，是TAMRA、DABCYL, NFQ中的一种。
6.权利要求1至4所述的试剂盒，所述的Taqman探针5’端标记FAM或者VIC，3’端标记 TAMRA。
7.权利要求1至6所述的试剂盒在新生儿T细胞及B细胞免疫缺陷检测中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于定量检测TRECs和KRECs基因实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。本发明包括一个以巢式PCR技术为基础的PCR反应体系和以实时荧光PCR技术为基础的实时荧光定量(Realtime)PCR反应体系。其中巢式PCR反应体系包括针对TRECs、KRECs和β-actin基因的正、反向引物；荧光PCR反应体系包括针对TRECs、KRECs和β-actin基因的正、反向引物和特异性荧光探针。该试剂盒可以快速地联合筛查新生儿免疫系统T细胞水平和B细胞水平，具有高灵敏度和稳定性，以及非常好的重现性，此方法适用于TRECs和KRECs的联合定量检测，能应用于新生儿免疫系统功能筛查，具有实际的临床应用价值。
文档编号G01N21/64GK103173533SQ20121047071
公开日2013年6月26日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者王晓川, 刘丹如, 王牧, 房聪 申请人:无锡联合利康临床检验所有限公司