专利名称：多肽标志物Pep5酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及ELISA检测技术，具体地说，涉及一种多肽标志物Pep5酶联免疫检测 试剂盒。
背景技术：
结肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，其发病率占胃肠道肿瘤的第3位。近年随 着人民生活水平的提高和饮食结构的改变，其发病率呈逐年上升趋势，严重地威胁着人类 健康。结肠癌常用的诊断方法有大便潜血检查、钡剂造影、结肠镜检查和血清肿瘤标志物 (tumor markers, TM),前两种方法敏感性较低,结肠镜检查为侵入性检查,较多患者难以接 受。TM检测在癌症筛查、诊断和治疗后随访、复发的检出和预后判断中发挥着重要作用。早 期大肠癌患者预后较好，但患者常无临床症状，诊断率很低。因此，筛选和建立用于癌症早 期诊断的、高敏感、高特异的血清学诊断技术，提供癌症早期预警普查，具有重大意义，市场 前景可观。
目前国内外广泛采用检测血清中CEA、CA242来检测结肠癌。CEA是一种糖蛋白抗 原，从结肠腺癌和胚结肠黏膜组织中分离得到，是常见的结直肠癌肿瘤标记物。由于内胚层 来源的恶性肿瘤如结直肠癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等均存在CEA异常表达，且CEA释 放入体循环时先经门静脉进入肝脏，而肝脏对CEA有降解作用，可影响其在外周血液中的 浓度，因此CEA诊断结直肠癌不具备特异性。CA242最早是从人结直肠癌细胞Colo205单 抗发现的，是一种唾液酸化的糖类抗原，与肿瘤局部宿主抗肿瘤免疫反应有关，机体免疫抑 制越明显，血清CA242水平越高。研究者认为CA242更适用于胰腺癌和消化道恶性肿瘤尤 其是结直肠癌的诊断。
血清中丰富的多肽资源在目前重大疾病诊断中发挥着重要作用。采用目前常规的 临床手段进行多肽检测逐渐引起学术界和医药界的高度重视，基于多肽的肿瘤诊断技术正 开始向临床应用高速发展，肿瘤的早期预警技术也在开发之中，一些多肽的联合应用有可 能为肿瘤等重大疾病的预警提供革新性的突破。发明内容
本发明的目的是提供一种多肽标志物P印5酶联免疫检测试剂盒。
为了实现本发明目的，本发明的一种多肽标志物Pep5酶联免疫检测试剂盒，所述 检测试剂盒含有经酶(优选辣根过氧化物酶)标记的由保藏号为CGMCC No. 5269的单克隆抗 体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
优选地，所述检测试剂盒还含有包被液、封闭液、清洗液、显色液、2M硫酸、终止液 和固相反应板中的一种或多种。更优选所述显色液为TMB显色液。
其中，以多妝标志物Pep5 抗原(序列 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-A rg-Asp-Gln-Gly-Hi s-Gly-Hi s-Gln的多肽，命名为P印5)与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH) 的偶联物免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后筛选出的杂交瘤细胞株。本发明提供的抗多肽标志物P印5的单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105(S卩，抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105)现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2011 年9月27日，保藏号为CGMCC No. 5269。
本发明还提供利用上述检测试剂盒定量检测肠腺癌血清中多肽标志物P印5方法，包括如下步骤将待测血清与包被液包被过夜，清洗若干次，采用封闭液进行封闭，清洗若干次，加入酶标记的多肽抗体，清洗若干次，显色液显色，加入终止液进行终止，检测 0^450 值。
其中，HRP标记的单克隆抗体与血清样品中的多肽标志物P印5抗原发生特异性结合，并用显色液显色。
具体步骤如下
I)包被取5-30 μ L待测血清，加入70 μ L-95 μ L包被液，置于96孔板中，4°C放置过夜或37°C放置2小时；同时加入100 μ L包被液作为阴性对照；
2)清洗弃包被液，用O. 01M、pH7. 4PBST缓冲液200-300 μ L清洗5-7次，拍干；
3)封闭加入200-300 μ L 5%的脱脂奶粉，37°C静置封闭2小时；
4)清洗弃封闭液，用O. 01M、pH7. 4PBST缓冲液200-300 μ L清洗5-7次，拍干；
5)酶结合物加入80-120 μ L HRP标记抗体，37°C静置I小时；6)清洗弃抗体溶液，用O. 01M、pH7. 4PBST缓冲液200-300 μ L清洗5-7次，拍干；
7)显色加入80-120yL显色液，37°C避光孵育15min显色；8)终止加入 30-70 μ L 2M硫酸，终止反应；
9)读数用酶联检测仪测定OD45tlnm的光吸收值；
10)判定以检测OD值与阴性OD值之比大于等于2.1为阳性。
本发明所提供的单克隆抗体针对多肽标志物Pep5抗原的特异性结合强；多肽标志物Pep5抗原的检测方法的操作步骤简便快捷，利于临床检测；可进行高通量、低成本的酶联检测仪检测。
本发明将多肽抗体与ELSIA技术联合，可以同时检测多个生物标志群，并可用于大规模的样本检测，是验证血清标志物和应用于临床检测的理想工具。
图1为本发明实施例5中将本发明的多肽标志物Pep5酶联免疫检测试剂盒应用于肠腺癌血清与正常血清的ROC曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1多肽标志物抗原单克隆抗体的制备方法
I)采用偶联载体蛋白KLH的合成的多肽5作为免疫抗原免疫BALB/C小鼠；其中， 多妝 5 全长序列为Asn-Leu_Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln。
2)2周后检测尾血滴度，达到1 :1000以上后，取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0小鼠 骨髓瘤细胞在PEG作用下进行融合；3)通过ELISA方法进行筛选，用有限稀释法对分泌抗体阳性的杂交瘤细胞进行克 隆纯化；4)筛选出10株针对合成肽5的杂交瘤细胞，意外地发现其中一株敏感性较 高(lng/孔)，扩增细胞系，制备并纯化单抗腹水，检测单抗的效价(1:200000)、滴度 (0. 0005ug/ml)及亚型鉴定(IgG2b)等，得到抗多肽5的特异性单克隆抗体。将该杂交 瘤细胞株命名为抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105，并于2011 年9月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCC No.5269。实施例2结肠癌ELISA检测试剂盒显色液的研究1)过氧化氢-TMB显色液底物液A中过氧化氢(H202)体积浓度为0. 3^2% ；2)过氧化氢-TMB显色液显色液B中四甲基联苯胺(TMB)质量浓度为0. 2^1% ；3)过氧化氢-TMB显色液显色液A中缓冲液体系为醋酸缓冲液体系、柠檬酸缓冲 液体系。实施例3结肠癌ELISA检测试剂盒显色液的研究1)过氧化脲-TMB显色液底物液A中过氧化脲体积浓度为0. 3^2% ；2)过氧化脲-TMB显色液显色液B中四甲基联苯胺(TMB)质量浓度为0. 2 1%0 ；3)过氧化脲-TMB显色液显色液B中有机相DMF/DMS0比例实施例4多肽标志物抗原的ELISA检测方法样本临床确诊的肠腺癌血清70份、正常血清160份。1)取5 ii L临床血清，加入95 u L包被液，置于96孔板中,4°C放置过夜；同时加入 100 uL包被液作为阴性对照；2)弃包被液，用0. 01M、pH7. 4PBST缓冲液300 u L清洗5次，拍干；3)加入300 u L 5%的脱脂奶粉，37°C静置封闭2小时；4)弃封闭液，用0. 01M、pH7. 4PBST缓冲液300 u L清洗5次，拍干；5)加入100 u L HRP标记多肽抗体，37°C静置1小时；6)弃抗体溶液，用0. 01M、pH7. 4PBST缓冲液300 u L清洗5次，拍干。7)加入100 u LTMB显色液(底物A :显色液B=1:1 )，37°C避光孵育lOmin显色；8)加入50 ii L 2M硫酸，终止反应；9)用酶联检测仪测定0D45(lnm的光吸收值；10)以检测0D值与阴性0D值之比大于等于2. 1为阳性。实施例5多肽标志物P印5酶联免疫检测试剂盒的制备1)1. 25 u g/ml辣根过氧化物酶标记的实施例1的抗多肽Pep5的特异性单克隆抗 体；2)包被液0. 1M pH9. 6的碳酸盐缓冲液；3)封闭液5g/100ml脱脂奶粉；4)显色液TMB显色液5)终止液2M硫酸；
6)固相反应板96孔聚乙烯酶联板；
7)清洗液PBST 洗液(0·01Μ、ρΗ7·4)
结果经统计，如图1中ROC曲线所示，敏感度达到92. 9%，特异度达到83. 9%，表明将本发明的多肽标志物P印5酶联免疫检测试剂盒(酶联免疫吸附法)应用于肠腺癌血清检测，特异性强、重复性好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.多肽标志物Pep5酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有经酶标记的由保藏号为CGMCC No. 5269的单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，酶标记时使用的标记酶为辣根过氧化物酶。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还含有包被液、封闭液、清洗液、显色液、2M硫酸、终止液和固相反应板中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述显色液为TMB显色液。
全文摘要
本发明提供了一种多肽标志物Pep5酶联免疫检测试剂盒，所述检测试剂盒含有经酶标记的由保藏号为CGMCC No.5269的单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。本发明所提供的由所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体制备的检测试剂盒可用于检测肠腺癌，操作步骤简便快捷，有利于高通量地临床检测，而且检测成本低。
文档编号G01N33/577GK102998452SQ20121047952
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者魏开华, 肖汉族, 孙云波, 傅海媛, 侯利平, 黄亚娟, 宋纯艳, 杨保安, 甄蓓, 徐淑芳, 张拓, 王东茂, 周晓明, 原剑 申请人:北京正旦国际科技有限责任公司, 湖南金健药业有限责任公司