专利名称：一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，具体地，涉及一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法。
背景技术：
棉花是关系国计民生的战略物资，也是仅次于粮食的第二大农作物。棉铃虫是危害棉田的主要害虫之一，上世纪90年代初棉铃虫的大爆发给我国的国民经济造成了巨大的经济损失。为了有效的防治棉铃虫，1996年转基因棉花在美国商业化种植，之后其种植面积在世界范围内快速增长，我国1997年由河北省开始引种美国Bt-CrylAc抗虫棉，1999 年国产抗虫棉开始商业化种植。2001年以前Bt棉花主要种植于黄河流域棉区，种植面积约50万公顷，到2006年已广泛种植于各个棉区，面积达400万公顷，占全国棉花种植面积的70%，2011年中国的转基因棉花种植比例达到71. 5%。
转Bt棉花的广泛种植在带来巨大收益的同时，害虫对Bt的抗药性也成为一个不容忽视的问题。Tabashnik等2008年报道美国的东南部棉铃虫在田间对Bt棉产生了抗性； Tabashnik等2010报道印度从2002年开始使用第一代转基因棉花，到2009年田间的红铃虫已对CrylAc产生了抗性。很多国际育种公司先后开发了第二代转基因棉花，如Monsanto 公司的 Bollgard II (表达 Cry2Ab 和 CrylAc 蛋白)，DowAgroSciences 公司的 WideStrike (表达CrylF和CrylAc蛋白)，Syngenta公司的VipCot (表达Vip3A和CrylAb蛋白)等。
转双价基因抗虫棉花除扩大杀虫谱外，还可以起到延缓靶标害虫抗性发展的作用。因此，新蛋白的选择基本原则是表达的两种蛋白之间不存在交互抗性，评价新蛋白与抗性棉铃虫的交互抗性及蛋白间的协同作用，对未来转双价基因抗虫棉花的推广具有重要影响。转基因植物的制备过程是一个复杂漫长的过程，受多种因素的影响，转基因植物由于基因突变等影响，其效果具有不确定性，需要进行大量筛选工作。因此，在新基因转入棉花前， 在室内对其新型蛋白的效果进行评价可以节省大量的人力、物力、财力。
目前主要是采用多次生物测定的方法分别测定新蛋白对棉铃虫的防治效果、新蛋白对抗性棉铃虫的治理效果、两种蛋白混用对敏感棉铃虫的增效；没有评价两种蛋白混用对抗性棉铃虫的治理效果。
因此迫切需要一种通过一次生物测定，就可以评价两种蛋白混用治理棉铃虫的效果O发明内容
本发明目的是提供一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法，用于简单、快速、高效的全面评价两种蛋白的作用效果。
本发明通过二因素D-饱和最优试验设计、采用表面涂抹法对敏感和抗性棉铃虫初孵幼虫分别进行生物测定，根据回归方程，对两种蛋白的作用效果、主要作用因子、最优的浓度组合进行分析。
具体地，所述方法包括以下步骤
I)选择两种用于治理棉铃虫的药物；
2)接种敏感或抗性棉铃虫幼虫；
3)观察幼虫死亡情况，计算死亡率；
4)建立二因素D-饱和方法建立回归方程，评价两种药物的治理效果。
其中，所述药物为Cry2Ab蛋白、CryIAb蛋白、CrylF蛋白、Vip3A蛋白和CrylAc蛋白等中的任意两种。所述药物的浓度为0-4. 760 μ g/cm2。
其中，所述棉铃虫幼虫的接种量为24头以上棉铃虫幼虫/单位体积药物。所述棉铃虫幼虫培养的人工饲料为改进的棉铃虫饲料，饲料组成包括玉米粉、黄豆粉、酵母粉、蔗糖、维生素(具体配方参照《人工饲养棉铃虫技术的改进》中的配方4，植物保护，梁革梅等， 1999 );所述棉铃虫幼虫培养的条件为温度27 ± 2°C，湿度75 土 10%，光照14:10 (L: D) h。
对于敏感品系棉铃虫，建立回归方程夕=9.04+.1.83X!+0.31x2-1J9 xf-0.80 χ22-0.808 χ,χ2, χ代表第一种药物浓度编码值，χ2代表第二种药物浓度编码值、f 代表理论死亡率，
当回归方程的差异显著性分析达到显著水平时(F>F O. 05)，表明实际死亡率与》 吻合，回归方程能反应实际情况；
当两因素的回归系数差异显著时(t>t O. 05)，表明两种药物作用显著；
将两因素的回归系数绝对值大小，绝对值大的为起主要作用的药物；
通过交互效应、最优浓度配比分析，得到两种药物作用的最佳浓度配比。
优选地,所述两种药物为CrylAc蛋白和Cry2Ab蛋白时,其治理敏感棉铃虫浓度均为1. 75-3. 65 μ g/cm2。
对于BtR品系棉铃虫，建立回归方程f-5.383+0.473xl+0.526x2-0.105xl2-0,474 x22-0.0lSlxU2；xl 代表第一种药物浓度编码值，x2代表第二种药物浓度编码值、彳代表理论死亡率，
当回归方程的差异显著性分析达到显著水平时(F>F O. 05)，表明实际死亡率与f 吻合，回归方程能反应实际情况；
当两因素的回归系数差异显著时(t>t O. 05)，表明两种药物作用显著；
将两因素的回归系数绝对值大小，绝对值大的为起主要作用的药物；
通过交互效应、最优浓度配比分析，得到两种药物作用的最佳浓度配比。
优选地,所述两种药物为CrylAc蛋白和Cry2Ab蛋白时,其治理BtR品系CrylAc 抗性棉铃虫的最佳浓度配比为CrylAc蛋白浓度为2. 49-4. 23 μ g/cm2, Cry2Ab蛋白浓度为1. 10-4. 28 μ g/cm2。
本发明实施例中还进一步提供以下具体地实施方案
I)供试棉铃虫
敏感品系和BtR品系CrylAc抗性品系棉铃虫的初鮮幼虫。
2)两种Bt蛋白的浓度配比
利用二因素D-饱和最优试验设计，针对两种蛋白因素，按下表的浓度设计3次重复的饱和试验，进行生物测定。
表I 二因素的编码及浓度设置
权利要求
1.一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法，包括以下步骤 1)选择两种用于治理棉铃虫的药物； 2)接种敏感或抗性棉铃虫幼虫； 3)观察幼虫死亡情况，计算死亡率； 4)建立ニ因素D-饱和方法建立回归方程，评价两种药物的治理效果。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述药物为Cry2Ab蛋白、CrylAc蛋白、CrylF蛋白、Vip3A蛋白和CrylAb蛋白中的任意两种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述药物的浓度为0-4.760 μ g/cm2。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述棉铃虫幼虫的培养条件为温度27±2°C，湿度 75 ±10%，光照 14: IOh。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，对于敏感品系棉铃虫，建立回归方程1=9,04+1.831-0,31^-1.891^-0,801/-0.^8 X1X2J1 代表第一种药物浓度编码值，χ2代表第二种药物浓度编码值、$代表理论死亡率； 当回归方程的差异显著性分析达到显著水平时，表明实际死亡率与f吻合，回归方程能反应实际情况； 当两因素的回归系数差异显著时，表明两种药物作用显著； 将两因素的回归系数绝对值大小相比，绝对值大的为起主要作用的药物； 通过交互效应、最优浓度配比分析，得到两种药物作用的最佳浓度配比。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于，所述两种药物为CrylAc蛋白和Cry2Ab蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,CryIAc蛋白和Cry2Ab蛋白治理敏感品系棉铃虫的浓度均为I. 75-3. 65 μ g/cm2。
8.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，对于BtR品系棉铃虫，建立回归方程卜5.383+0.4731^0.52^2-0.105114.474)1/-0.01811^2; X1 代表第一种药物浓度编码值，X2代表第二种药物浓度编码值、タ代表理论死亡率； 当回归方程的差异显著性分析达到显著水平吋，表明I与y吻合,回归方程能反应实际情况； 当两因素的回归系数差异显著时，表明两种药物作用显著； 将两因素的回归系数绝对值大小相比，绝对值大的为起主要作用的药物； 通过交互效应、最优浓度配比分析，得到两种药物作用的最佳浓度配比。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于，所述两种药物为CrylAc蛋白和Cry2Ab蛋白时，其治理BtR品系CryIAc抗性棉铃虫的浓度为CryIAc蛋白2. 49-4. 23 μ g/cm2,Cry2Ab蛋白I. 10-4. 28 μ g/cm2。
全文摘要
本发明涉及一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法。该方法包括以下步骤1)选择两种用于治理棉铃虫的药物；2)接种敏感或抗性棉铃虫幼虫；3)观察幼虫死亡情况，计算死亡率；4)建立二因素D-饱和方法建立回归方程，评价两种药物的治理效果。本发明方法可操作性强，准确高效，可在Bt蛋白或其他蛋白防治害虫和治理抗性的效果评价中广泛应用。
文档编号G01N33/68GK102981001SQ20121048044
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者梁革梅, 魏纪珍, 张丽丽, 高珍, 张永军 申请人:中国农业科学院植物保护研究所