专利名称：一种基于三掺铌酸锂晶体的光学生物检测方法
技术领域：
本 发明涉及一种光学生物检测方法，具体地是一种基于三掺铌酸锂晶体的非挥发性全息布拉格光栅的光学生物检测方法。
背景技术：
1967年，Updike和Hicks将葡萄糖氧化酶(GOD)固定化膜和氧电极组装在一起，制成了基于葡萄糖酶电极的第一种生物传感器，之后各种以生物检测为目的的生物传感器，如热敏生物传感器、场效应管生物传感器、压电生物传感器、光学生物传感器、声波道生物传感器、酶电极生物传感器、介体生物传感器等广泛应用到生产生活中来。其中，光学生物传感器(optical-bio sensor)是一种强大的检测分析工具,是目前研究最广，发展最快的生物传感器之一。根据光学检测原理的不同，可将其分为表面等离子共振生物传感器、干涉生物传感器、光波导生物传感器、光纤环谐振器生物传感器、光纤生物传感器、光子晶体生物传感器等类型。其中基于布拉格光栅的光学生物传感器受到人们的广泛关注，并且在生物分子检测领域得到广泛应用。制作基于布拉格光栅的光学生物传感器基质主要为碳化硅、二氧化硅等半导体材料和铌酸锂晶体。以二氧化娃(silicon-on-silicon)为基质紫外写入波导光栅，例如G. D. Emmerson 等人，(Emmerson, G. D. ；ffatts, S. P. ;Gawith, C. B. E. ; Albanis, V.
;Ibsen, M. ; Williams, R. B. ; Smith, P. G. R. Fabrication of directly UV-writtenchannel waveguides with simultaneously defined integral Bragg gratings,况现以TTBW ,38(2002)，1531-1532)和(1. J. G. Sparrow, P. G. R. Smith,G. D. Emmerson, S. P. Watts, and C. Riziotis, Planar Bragg Grating Sensors—Fabrication and Applications: A ReYie^Journal of Sensors, 2009 (2009),12 pp)中所提出的一种直接利用相干紫外光写入布拉格光栅的方法。该方法在三层锗掺杂的二氧化硅基质的通道波导中使用244nm的相干紫外光在样品内写入布拉格光栅。由于紫外相干光源的价格非常昂贵，同时整个光栅的制备过程非常复杂，这些因素大大限制了该方法的实用性。与半导体基质相比，LiNbO3晶体具有优异的电光和声光等特性，其中电光效应在光折变效应的研究中占据重要地位，而基于光折变效应的应用引起越来越多的关注。另外，掺杂过渡金属Cr、Cu、Fe,Ce, Mn等离子(载流子)可以提高光折变效应，灵敏度和响应时间，因此利用LiNbO3晶体良好的光折变效应，在掺杂LiNbO3晶体中写入光折变光栅，以光折变光栅为生物传感器进行生物分子检测具有很大的发展潜力。目前为止运用掺Cu、掺Fe、掺Mn等单掺铌酸锂晶体制作波导光栅。D. RUND等人(J Hukriede, D Runde and D Kid.Fabrication and application of holographic Bragg gratings in lithium niobatechannel waveguides.^ Phys. D: App1. Phys. 36 (2003) Rl - R16.)在惨铜的银酸锂晶体内形成的波导中全息地记录折射率光栅，并且使用绿光记录光栅，用不敏感的1. 5um附近的红外光读取反射几何，使用热固定法来确保布拉格光栅长时间的稳定性。D. RUND等人(D. RUNDE, S. BRUNKEN, C. E. RUTER, D. KIP.1ntegrated optical electric field sensorbased on a Bragg grating in lithium niobate.Phys. B . 86, 91 - 95 (2007))实用波长为514. 5nm的氩离子激光器产生的两束干涉光记录光栅，为了保证光栅不被可见光擦除，在光栅的记录过程中温度保持在453K写入光栅。但是，上述单掺的铌酸锂晶体存在一些缺陷，具体表现写入的光栅具有挥发性，必须采用热固定或电固定的方法；对光栅进行固定时，相关仪器的使用使得检测成本提高，同时为微型化检测的实现带来不便。因此，为了解决单掺铌酸锂晶体上写入光栅的缺陷，1998年Buse等人(K.Buse, A. Adibi, D. Psaltis. Non-volatile holographic storage in doubly dopedlithiumniobate crystals . NATURE . 393 . (1998))首次提出在双惨 LiNbO3 = Fe :Mn 晶体上写入全息光栅，用两束相干红光同汞灯发出的紫外光共同照射晶体，写入稳定的、非挥发的全息光栅。但这一方法同样存在这问题，写入光栅时间太长，需要几百分钟，这将严重影响光栅在高灵敏度、实时检测处理中的应用。
由此提出在双掺铌酸锂晶体中掺入IV B族过渡金属后，写入的布拉格光栅在直接写入非挥发的布拉格光栅的同时缩短了写入时间。而本发明人李晓春所研究的一种“铪铁锰三掺铌酸锂晶体及其制备方法”，并获得专利，其专利号为ZL 200810054952. 6.。在2009年(Y. Kong, F. Liu, T. Tian, Sh. Liu, Sh. Chen, R. Rupp, and J. Xu, Fast responsivenonvolatile holographic storage in LiNb03 triply doped with Zr, Fe, and Mn,Opt.Lett. 34 (2009) 3896-3898.)中利用 LiNbO3 = Cu Ce:Zr 实现非挥发全息数据存储；2010年(F. Liu, Y. Kong, X. Ge, H. Liu, Sh. Liu, Sh. Chen, R. Rupp, and J. Xu, Improvedsensitivity of nonvolatile holographic storage in triply doped LiNb03:Zr, Cu, Ce,Opt. Express 18 (2010) 6333-6339.)中利用 LiNbO3 = Fe :Mn: Zr 实现非挥发的全息数据存储。在此基础上，发明人以三掺铌酸锂晶体为基质，进行了光学生物检测方法的探讨。
发明内容
本发明的问题在于以三掺铌酸锂晶体为基质，写入非挥发性全息布拉格光栅，实现生物分子高精度、低成本的快速的检测方法，并提供一种基于三掺铌酸锂晶体的光学生物检测方法。为了实现上述目的，本发明所提供的一种基于三掺铌酸锂晶体的光学生物检测方法，其所述方法如下
基于三掺铌酸锂晶体波导光栅基质；
形成于所述基质上的波导；
形成于所述波导上的全息布拉格光栅；
形成于所述全息布拉格光栅上的生物识别分子；
形成于所述生物识别分子上的靶分子；
形成于所述靶分子上的波导光栅反射光波长变化；
形成于所述波导光栅反射光波长变化上的生物分子浓度。在上述技术方案中，本发明进一步的附加技术特征在于 所述基于三掺铌酸锂晶体波导光栅基质是LiNbO3 = Fe Mn:Hf, LiNbO3:Fe =Mn:Zr,LiNbO3ICu :Ce:Hf。所述形成于所述基质上的波导是钛扩散形成波导。其所述钛扩散形成波导是在z切I传播铌酸锂晶体表面在1000 1150 C，18 24小时，进行内扩散处理，后蚀刻为带状结构，再对波导两端面进行抛光处理。所述形成于所述波导上的全息布拉格光栅是由两束相干可见光和一束紫外光相向同时作用下在波导中产生的非挥发性光栅。所述形成于所述全息布拉格光栅上的生物识别分子是在波导光栅表面进行硅烷化修饰；其硅烷化修饰是将带有羧基或是甲基活性基团的硅烷化试剂滴到波导光栅表面，反应l(Tl5min，取出由甲苯清洗后，再用甲醇淋洗到洗脱液呈中性，再用干燥氮气吹干或置于110°烘箱中干燥。所述形成于所述生物识别分子上的靶分子是生物识别分子与硅烷化修饰的晶体表面共价结合后，与生物识别分子特异性结合的分子。所述形成于所述靶分子上的波导光栅反射光波长变化是由光纤连接器相连的光谱仪探测。所述形成于所述波导光栅反射光波长变化上的生物分子浓度是由反射波长的变化，结合生物识别分子的已知浓度，描绘出波长变化与生物分子浓度的曲线，实现生物分子的定量检测。本发明方法利用强光折变效应的三掺锂酸铌晶体作为基质，克服了单掺铌酸锂晶体紫外光写入光栅成本高，写入光栅可见光即可擦除，光栅结构易挥发；而双掺铌酸锂晶体光栅虽然可写入稳定的光栅，但是写入时间太长的不足；与现有的光学生物检测方法相比，所具有的优点与积极效果在于对不同分析物进行识别和检测，实现了全光法快速写入稳定的、非挥发的光栅；采用两束相向而相干绿光和UV LED发出的紫外光来写入光栅，实现了低成本、高通量的快速实时检测。本发明检测方法还具有光折变效应的三掺铌酸锂晶体表面绑定生物分子，同靶分子发生特异性反应来定量检测靶分子的浓度，同其它的碳化硅、二氧化硅以及单掺或双掺光栅基质表面生物特异性反应检测相比，具有快速、方便、更高的检测灵敏度等优点。本发明光学生物检测方法适用于定量检测食品中有害成分、农药残留、毒品等的微量浓度，也可以广泛应用于临床检验、诊断、毒品检测、食品工业以及个体医疗等领域，具有非常广阔的市场前景。
图1是本发明方法全息光栅的写入图。图2是本发明方法多通量定量检测图。
具体实施例方式下面对本发明的具体实施方式
做出进一步的说明。实施本发明所提供的一种光学生物传感器检测方法，包括本发明方法采用的在三掺锂酸铌晶体上全光写入稳定的、非挥发的波导光栅的方法，在光栅上绑定生物识别分子，与靶分子发生特异性反应，使光学性质发生变化，进而定量检测靶分子浓度，具体检测方法按下列步骤进行
(I)波导的形成采用高温钛内扩散的方法，在Z切y传播三掺Hf，Fe, Mn铌酸锂晶体表面形成光波导，晶体表面依次经过电子束蒸发、火焰水解法、真空蒸发或溅射72nm钛膜、光刻法蚀刻宽为8um的带状结构、高温100(Tll00 C，18 24小时处理，最后对波导两端面进行抛光处理。(2)全息光栅的写入如图1所示，固体激光器发出的波长为532nm的可见绿光经过偏振器后成为寻常偏振光，后经分束器BS分为两光束，这两束光分别经平面镜Ml、M2反射后形成两束相干光，与UV LED发出的中心波长为365nm的紫外光共同辐照晶体。晶体置
于转台上，根据公式,能够通过旋转转台来精确控制两束光之间的角度。经过十
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分钟左右写入稳定的、非挥发的光栅。(3)传感器表面修饰实现对生物识别分子-抗体的固定，采取以下措施对制备的光学-生物传感器表面进行处理将传感器表面清洗干净并完全干燥，然后将带有活性基团，如羧基或氨基官能团的硅烷化试剂滴到传感器表面，反应l(Tl5min之后取出，先用甲苯清洗，再用甲醇淋洗数次，直至洗脱液呈中性。用干燥氮气吹干或置于110°烘箱中干燥。经硅烷化处理过的传感器表面可以很好共价结合生物识别分子，使得靶分子与生物识别分子特异性结合。(4)制备高通量的生物分子检测系统采用微流阵列技术来建立高通量的生物分子检测基质，将写入的光栅阵列结构作为多通道检测结构，用于传送被固定的生物识别分子-抗体或适体探针等检测物。光栅的长度以及周期需要进行设计，利用全息的方法写入了 30个周期为364. 57nm的光栅阵列，在该范围内，可制作30个不同的检测条，这些检测条可同时检测六组浓度不同的五种生物分子。实验时，将能够识别不同生物分子的已知浓度的抗体固定在光栅的不同位置处，且每一组的抗体浓度均不相同。测量时，将一个体液样本引入到各个微结构中，五种靶分子-抗原可同时检测出来。进行合理设计光栅结构，使得以此检测能同时提供6组以上的数据。 (5)建立高通量的定量检测系统在生物分子特异性结合反应完成以后，由于三掺锂酸铌晶体良好的光折变效应，光栅对折射率具有高灵敏性，使晶体表面折射率发生明显的改变，根据公式Xp = 2nA,利用光谱仪对反射波长进行检测，由反射波长的变化，结合已知浓度的固定生物识别分子，描绘出波长变化一检测物浓度曲线，实现多种生物分子的定量检测。在本发明实施例中，利用三掺铌酸锂晶体LiNbO3 = Fe =Mn:Hf制作非挥发性布拉格光栅进行生物分子定量检测。在三掺铌酸锂晶体中全光写入全息布拉格光栅，利用两束波长为532nm的相干绿光和一束UV LED产生的紫外光同时相向照射晶体写入光栅。读取光栅时，关闭UV LED，只用一束532nm的可见光照射，直到光栅稳定。由于三掺铌酸锂晶体具有更好的光折变效应，可以实现高灵敏度的生物分子检测；可以在十分钟左右的时间内写入稳定的、非挥发的光栅；写入光栅时使用UV LED发射的紫外光，同紫外光激光器相比，降低了检测成本的同时实现仪器集成化的目的，有利于实时快速检测；由于较大的光栅周期常数可形成芯片似的阵列，可以实现多通量生物分子检测的目的。布拉格光栅形成后，在硅烷化修饰的基质表面绑定生物识别分子，靶分子与其发生特异性结合，接下来进行生物检测。Emmerson, G. D.等人在 2011 年(D. Bhatta, A. A. Michel, M. Marti Villalba, G. D.Emmerson,1. J. G. Sparrow, E. A. Perkins, M. B. McDonnell, R. W. Ely, G. A. Cartwright,Optical microchip array biosensor for multiplexed detection of bio-hazardousagents, Biosensors and Bioelectronics30 (2011), 78-86)中，基于二氧化娃的布拉格光栅相应位置上绑定抗体，靶分子-抗原与抗体发生特异性反应，导致局部折射率发生改变，根据公式4 二可知折射率的变化表现为反射光波长发生变化。因为在波导中传输
的光通过传感反应的布拉格光栅处，包括生物分子特异性反应的光栅结构反映了精确定义的光波长。因为布拉格光栅表面的特异性反应是独立进行的，可以在单一光学芯片传感器上实现多路高通量检测。本发明正是利用这一方法进行生物检测布拉格光栅上特异性反应改变晶体的折射率，使得反射光的波长发生变化，通过检测反射光波长的变化量，定量检测靶分子的浓度。
下面以待测物黄曲霉素(AFBl)为例，进一步详细说明本发明的一种光学生物传感器的检测方法，其具体实施方式
是按下列步骤进行的
步骤一、波导的制作
使用对晶体表面进行z切y传播的三掺Hf，Fe, Mn铌酸锂晶体，将72nm钛薄膜通过电子束蒸发的方式沉积在晶体表面，光刻法蚀刻为宽6um的带状结构、然后置于高温1050 C的湿氧环境中进行约18小时的高温内扩散处理，最后对波导两端面进行抛光处理。之后将晶体置于297K恒温环境下保存。步骤二、全息光栅的形成
如图1所示，全固态半导体激光器发出的波长为532nm的可见绿光经过偏振器后成为寻常偏振光，后经分束器BS分为两光束，这两束光分别经平面镜Ml、M2反射后形成两束相干光，与UV LED发射的中心波长为365nm的紫外光共同辐照晶体，读取光栅时，关闭快门1、2、3，反复进行光栅的写入读取，直到写入稳定的光栅。晶体置于转台上，根据公式
A =,能够通过旋转转台来精确控制两束光之间的角度，本实施案例取2 =93. 71°
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光栅写入交，此操作在常温下进行，形成光栅周期为364. 57nm的波导光栅。步骤三、传感器表面处理
硅烷化之前先将传感器表面清洗干净并完全干燥，然后将带有羧基或是甲基的活性基团的硅烷化试剂滴到传感器表面，反应l(Tl5min之后取出，先用甲苯清洗，继而用甲醇淋洗数次，直至洗脱液呈中性。用干燥氮气吹干或置于110°烘箱中干燥。表面硅烷化处理后，晶体表面可以更好地绑定毒品抗体分子。步骤四、制备高通量的AFBl检测系统
利用步骤二形成的周期为364. 57nm的光栅阵列，在该范围内，可制作30个不同的检测条，这些检测条可同时检测六组浓度不同的AFB1。采用微流阵列技术来建立高通量的AFBl检测基质，将写入的光栅阵列结构作为多通道检测结构，用于传送被固定的AFBl抗体或适体探针以及检测物。将能够识别不同AFBl分子的已知浓度的抗体固定在光栅的不同位置处，且每一组的抗体浓度均不相同。测量时，将一个体液样本引入到各个微结构中，五种AFBl分子可同时检测出来。
步骤五、建立高通量的定量AFBl检测系统
在AFBl分子抗原抗体特异性结合反应完成以后，由光栅对折射率的灵敏性知其表面折射率发生明显的改变，根据公式Xp = 2 n A，利用光谱仪对反射波长进行扫描，由反射波长的变化，结合固定抗体的已知浓度，描绘出Al -concentration曲线，即可实现多种AFBl分子的定量检测。
权利要求
1.一种基于三掺铌酸锂晶体的光学生物检测方法，其所述方法是基于三掺铌酸锂晶体波导光栅基质；形成于所述基质上的波导；形成于所述波导上的全息布拉格光栅；形成于所述全息布拉格光栅上的生物识别分子；形成于所述生物识别分子上的靶分子；形成于所述靶分子上的波导光栅反射光波长变化；形成于所述波导光栅反射光波长变化上的生物分子浓度。
2.如权利要求I所述的光学生物检测方法，其所述基于三掺铌酸锂晶体波导光栅基质是 LiNbO3 = Fe :Mn:Hf、LiNbO3 = Fe Mn:Zr, LiNbO3:Cu CeiHf0
3.如权利要求I所述的光学生物检测方法，其所述形成于所述基质上的波导是钛扩散形成波导。
4.如权利要求3所述的光学生物检测方法，其所述钛扩散形成波导是在z切y传播铌酸锂晶体表面在1000 1150 C，18 24小时，进行内扩散处理，后蚀刻为带状结构，再对波导两端面进行抛光处理。
5.如权利要求I所述的光学生物检测方法，其所述形成于所述波导上的全息布拉格光栅是由两束相干可见光和一束紫外光相向同时作用下在波导中产生的非挥发性光栅。
6.对如权利要求I所述的光学生物检测方法，其所述形成于所述全息布拉格光栅上的生物识别分子是在波导光栅表面进行硅烷化修饰。
7.如权利要求6所述的光学生物检测方法，其所述硅烷化修饰是将带有羧基或是甲基的活性基团的硅烷化试剂滴到波导光栅表面，反应l(Tl5min，取出由甲苯清洗后，再用甲醇淋洗到洗脱液呈中性，再用干燥氮气吹干或置于110°烘箱中干燥。
8.如权利要求I所述的光学生物检测方法，其所述形成于所述生物识别分子上的靶分子是生物识别分子与硅烷化修饰的晶体表面共价结合后，与生物识别分子特异性结合的分子。
9.如权利要求I所述的光学生物检测方法，其所述形成于所述靶分子上的波导光栅反射光波长变化是由光纤连接器相连的光谱仪探测。
10.如权利要求I所述的光学生物检测方法，其所述形成于所述波导光栅反射光波长变化上的生物分子浓度是由反射波长的变化，结合生物识别分子的已知浓度，描绘出波长变化与生物分子浓度的曲线，实现生物分子的定量检测。
全文摘要
一种基于三掺铌酸锂晶体的光学生物检测方法是基于三掺铌酸锂晶体波导光栅基质；形成于所述基质上的波导；形成于所述波导上的全息布拉格光栅；形成于所述全息布拉格光栅上的生物识别分子；形成于所述生物识别分子上的靶分子；形成于所述靶分子上的波导光栅反射光波长变化；形成于所述波导光栅反射光波长变化上的生物分子浓度。本方法具有全光快速写入非挥发全息光栅的特点，同时实现了低成本，生物分子高精度、多通量、快速地定量检测，适用于定量检测食品中有害成分、农药残留和毒品等的微量浓度，具有广阔的市场前景。
文档编号G01N21/41GK102980872SQ201210496788
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者李晓春, 崔彩娥, 张玲玲, 于化忠 申请人:太原理工大学