检测标记蛋白的方法和装置制造方法
检测标记蛋白的方法和装置制造方法
【专利摘要】一种检测标记蛋白的方法，其包括：将包含标记蛋白的样本溶液和能够与该标记蛋白的标记相结合的标识结合剂接触；将该样本溶液与结合物接触，该结合物可与未和标记结合的标识结合剂相结合；并且，根据该样本溶液和结合物接触所引起的标识信号变化，确定该样本溶液中标记蛋白的浓度。本发明还涉及一种检测标记蛋白的装置。
【专利说明】检测标记蛋白的方法和装置
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及检测标记蛋白的方法和装置。
【背景技术】
[0002]标记蛋白在蛋白表达与纯化中已非常引人注目。鉴于标记蛋白在结构和功能研究中的应用持续增长，需要能够迅速、便利地对标记蛋白检测的方法。
[0003]目前，对复杂混合物中标记蛋白的检测通常需要至少两个小时，因而常常显得冗长。现有检测方法的示例有酶联免疫吸附试验法、蛋白免疫印迹法和基于特定着色的方法。前述最后一类方法的一个示例为针对寡聚组氨酸标记融合蛋白进行特定且敏感染色的InVision?寡聚组氨酸标记凝胶内染色，分类号LC6030、LC6033。根据从互联网网址http://tools, invitrogen.com/content/sfs/manuals/invisionstain_man.pdf 可获取的使用说明(修订于2012年3月19日，出版号为25-0671)，为寡聚组氨酸标记融合蛋白染色以供检测至少需要2小时20分钟。
[0004]因此，有必要开发新的或者改进的检测标记蛋白的方法和装置。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种新的或者改进的检测标记蛋白的方法和装置。
[0006]一方面，本发明涉及的方法包括:将包含标记蛋白的样本溶液和能够与该标记蛋白的标记相结合的标识结合剂接触；将该样本溶液与结合物接触，该结合物可与未和标记结合的标识结合剂相结合；并且，根据该样本溶液和结合物接触所引起的标识信号变化，确定该样本溶液中标记蛋白的浓度。
[0007]另一方面，本发明涉及的装置包括:测试条，其包含:样本接收区，以接收包含标记蛋白的样本溶液；结合区，其包含能够与该标记蛋白的标记结合的标识结合剂；和检测区，其包含可与未和标记结合的标识结合剂相结合的结合物。
[0008]本发明所涉及的检测标记蛋白的方法和装置解决了现有技术的技术问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]通过结合附图对于本发明的实施例进行描述，可以更好地理解本发明，在附图中:
[0010]图1是根据本发明的一个实施例所提供的装置的测试条的立体示意图。
[0011]图2是是图1中测试条的剖面示意图。
[0012]图3是例5中获得的照片。
[0013]图4是例5中获得的图表。
[0014]图5是例6中获得的照片。
【具体实施方式】[0015]说明书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。
[0016]在以下的说明书和权利要求中，除非清楚地另外指出，单复数不加以限制。
[0017]本申请所提及的“可”、“可以”、“可能”和“可为”表示在一定环境下发生的可能性；具有指定的性质，特征或者功能的可能性；和/或通过显示一个或者多个能力、性能而适合于另一种动作，或者与该适合的动作相关的可能性。因此，用于“可”、“可以”、“可能”和“可为”表示修饰的术语显然适合、能够或者适于所表示的能力，功能，或者用途，同时考虑在一些情况下，所修饰的术语可能有时不适合、不能或者不合适。例如，在一些情况下，事件或者能力可能是所期望的，而在其它情况下，该事件或者能力不能发生。这种区别通过术语“可”、“可以”、“可能”和“可为”涵盖。
[0018]本发明涉及的方法可用于检测样本溶液中标记蛋白的存在和/或数量，S卩，标记蛋白的浓度。
[0019]样本溶液可能是包含标记蛋白的任何溶液。样本溶液可能是用标记蛋白制得的溶液。在一些实施例中，样本溶液可由纯化的标记蛋白样本用例如磷酸盐缓冲溶液缓冲稀释而得。
[0020]本发明提及的“标记蛋白”表示包含标记的蛋白。标记的例子包括但不限于，寡聚组氨酸、谷胱苷肽硫基转移酶、多肽标记物、链霉结合肽I1、麦芽糖结合蛋白、血球凝集素、原癌基因、T7标记、S标记、钙调蛋白结合肽、类弹性蛋白多肽、抗体的可结晶片段、硫氧还蛋白、NusA和白蛋白结合域。标记蛋白的示例包括但不限于寡聚组氨酸标记蛋白和有可结晶片段的人体抗体。
[0021]在包含标记蛋白的样本溶液与标识结合剂接触后，标记与该标识结合剂结合。本发明中提及的“标识结合剂”是指与标识物结合的结合剂。该标识结合剂能够与标记蛋白的标记相结合。结合剂的例子包括但不限于，抗体、抗体片段或适体。在一些实施例中，结合剂是标记的特异性抗体，例如寡聚组氨酸的特异性抗体，或者针对人体抗体可结晶片段的特异性非人体抗体。寡聚组氨酸的特异性抗体的一个示例为可从如美国宾夕法尼亚州Gilbertsville市Rockland Immunochemicals Inc.获取的抗-6X寡聚组氨酸抗原决定标记(兔)抗体，产品标号600-401-382。针对人体抗体可结晶片段的特异性非人体抗体的一个不例为可从如美国宾夕法尼亚州Gilbertsville市Rocklandlmmunochemicals Inc.获取的抗人体IgG可结晶片段(山羊)抗体，产品标号609-1103。
[0022]标识物可能是任何能够被视觉检测或光学仪器检测到的物理的、或化学的标识物。标识物可能是通过反应产生颜色的酶-基质组合、有色微粒(例如橡胶微粒)、胶态金属、金属熔胶、碳熔胶、荧光物质、以及脂质体囊或聚合体囊。标识物来源示例包括但不限于，胶体金、乳胶珠、荧光微球、磁珠、量子点和升频转换磷。在一些实施例中，标识物来源于胶体金。
[0023]当将样本溶液和结合物接触时，如果有未与标记结合的标识结合剂，该标识结合剂与结合物结合，从而在接触前后产生标识信号变化。
[0024]本发明提及的“结合物”是指可与未和标记结合的标识结合剂相结合的物质。在一些实施例中，结合物是一种不同于标记蛋白的物质(如肽、蛋白、或微球)，但包含该标记。在一些实施例中，结合物是标记。
[0025]由于信号的强度是与标识物的数量有关，从而与样本溶液中标记蛋白的浓度负相关，因此标记蛋白的浓度可通过诸如视觉或使用光谱学检测到的信号变化确定。在使用光谱学时，可建立一个校准曲线，用于量化标记蛋白的浓度。
[0026]在一些实施例中，样本溶液在与结合物接触后，与控制物相接触。
[0027]本发明中提及的“控制物”是指一种能够与标识结合剂相结合的物质。在一些实施例中，控制物是针对人体抗体可结晶片段的结合剂的非人体抗体的结合剂。针对人体抗体可结晶片段的结合剂的非人体抗体的结合剂的一个示例是可从如美国宾夕法尼亚州Gilbertsville 市 Rockland Immunochemicals Inc.获取的抗山羊 IgG 可结晶片段(兔)抗体，产品标号105-4103。抗山羊抗体确保只有来自山羊的配对抗体会被截留。来自山羊以外的其他物种的抗体对也可用。
[0028]蛋白A或G既可以与抗人体IgG (山羊)之类的抗体结合，也可与任何人体IgG分析物相结合，故可以用作控制物。在一些实施例中，控制物是蛋白A或其IgG结合变体、蛋白G或其IgG结合变体、和蛋白L或其IgG结合变体中的至少一种。在一些实施例中，控制物只有一种，是蛋白A。
[0029]蛋白A的一个示例可从美国新泽西州通用电气医疗生物科学公司获取，产品号为17-0872-02。蛋白A的IgG结合变体的一个示例为可从美国新泽西州通用电气医疗生物科学公司获取的MabSelect SuRe?配体。蛋白G的一个示例可从美国新泽西州通用电气医疗生物科学公司获取，产品号为17-0619-09。
[0030]在下文中，将根据【专利附图】
【附图说明】本发明的实施方式，将不会详细描述众所周知的功能和结构，以避免因不必要的细节而使本发明变得令人费解。
[0031]请参考图1和图2，根据本发明的一个实施例提供的一个装置的一个测试条I包括:用于接收包含标记蛋白的样本溶液的样本接收区2 ;包含能够与标记蛋白的标记结合的标识结合剂的结合区3 ;和包含可与未和标记结合的标识结合剂相结合的结合物的检测区4。
[0032]在一些实施例中，可将样本溶液扩散通过结合区3和检测区4以与标识结合剂和结合物相接触。相应地，标记蛋白的浓度可根据包含标记蛋白的样本溶液扩散通过检测区4前后，检测区4的信号变化予以确定。
[0033]样本接收区2可能是样本溶液能够添加并由此扩散的任何形状或结构。样本接收区2可能是测试条I的一部分或者是一个样本垫。
[0034]在一些实施例中，样本接收区2可能是通过将一个玻璃纤维条浸入一种包含诸如牛血清白蛋白、吐温20的磷酸盐缓冲溶液中，并在饱和后将该玻璃纤维条干燥而制得的一个样本垫。
[0035]可通过诸如将样本溶液滴在样本溶液接收区2或将样本接收区2浸入样本溶液中等方式，从而使样本溶液与样本接收区2接触。
[0036]样本溶液从样本接收区2通过毛细作用向前扩散。当样本溶液扩散通过结合区3时，标识结合剂从结合区3释放出来以与样本溶液一起向前扩散。标记蛋白的标记与一些标识结合剂结合。[0037]结合区3可能是样本溶液能够由此扩散的任何形状或结构。结合区3可能是测试条I的一部分或者是一个结合垫。
[0038]在一些实施例中，结合区3可能是通过用一个玻璃纤维条吸收结合溶液后干燥而制得的一个结合垫。该结合溶液包含标识结合剂。
[0039]当样本溶液扩散通过检测区4时，一些未与标记结合的标识结合剂与结合物结合，并停留在检测区4。
[0040]检测区4的标识物产生的信号可通过裸眼观察或使用光学仪器进行检测。
[0041]在一些实施例中，标识结合剂为彩色，样本溶液中标记蛋白的浓度根据检测区4的颜色变化确定。在一些实施例中，检测区4的颜色随着样本溶液中标记蛋白的浓度的增加或减少而变化。因此，标记蛋白的存在和/或数量可通过检测颜色的变化来确定。
[0042]例如，如果样本溶液中没有标记蛋白，检测区4的颜色增至最强，因为来自结合区3的标识结合剂能停留的都停留在检测区4。相似地，如果第一测试条的检测区的颜色比第二测试条的检测区的颜色深，则用第一测试条检测的第一样本溶液中标记蛋白的浓度低于用第二测试条检测的第二样本溶液中标记蛋白的浓度，反之亦然。颜色的变化可通过视觉观察或使用光谱学进行检测。
[0043]在一些实施例中，检测区4中标识物的信号强度可通过光学仪器进行检测。检测区4的信号强度可能是该光学仪器的输出。在一些实施例中，信号强度是测试条阅读器输出信号最高点的高度。
[0044]将已知标记蛋白浓度的溶液在测试条上扩散并检测相应检测区的信号强度，可建立标记蛋白的浓度与检测区信号强度之间的函数公式。待测样本溶液中标记蛋白的浓度可通过使用该函数公式与测得的检测区4的相应信号强度而计算得出。
[0045]在一些实施例中，测试条I包括包含控制物的控制区5。样本溶液通过检测区4后向前扩散，未在检测区4停留的标识结合剂与控制区5的控制物结合，停留在控制区5。
[0046]控制区5中标识物产生的信号可通过裸眼观察或使用光学仪器进行检测。一些实施例中，控制区5信号的产生表明样本溶液从检测区4向控制区5扩散的完成。一些实施例中，如果所有的标识结合剂都停留在检测区4，在控制区5将不能检测到标识物。一些实施例中，如果部分标识结合剂停留在检测区4，因为标记蛋白的浓度与控制区5的标识物数量正相关，所以控制区5测得的标识物的数量可用于提高样本溶液中标记蛋白浓度的检测精度。
[0047]检测区4与控制区5也可被分别称作T线与C线。在一些实施例中，检测区4与控制区5可能通过将一种T线溶液与一种C线溶液分别加在一个膜7的两个相互隔开的区域而形成。膜7可由如硝化纤维制得。T线溶液包含结合物。C线溶液包含控制物。
[0048]在一些实施例中，测试条I包含吸收区6，其距离控制区5比距离检测区4近。
[0049]吸收区6帮助增强样本溶液离开样本接收区2的毛细作用，以牵引样本溶液离开样本接收区2，通过结合区3、检测区4与控制区5。吸收区6可能是测试条I的一部分或者是一个吸收垫。在一些实施例中，吸收区6可能是由吸水材料如棉纸、纤维素、二氧化硅微纤维滤纸、玻璃纤维与石英纤维滤纸等制成的吸收垫。
[0050]测试条I可能是包含任何吸水材料、并能够让样本溶液扩散的长形条。测试条I的样本接收区2、结合区3、检测区4、控制区5与吸收区6可由相同或不同材料制成。测试条I的样本吸收区2、结合区3、检测区4、控制区5与吸收区6 —体成型或组装在一起。
[0051]在一些实施例中，样本接收区2、结合区3、膜7与吸收区6组装在一起。一些实施例中，结合区3与样本接收区2和膜7重叠，且膜7也与吸收区6重叠。
[0052]在一些实施例中，测试条I可能包含一个由诸如塑料材料如聚酯(Mylar? )或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)制成的支撑垫8，以支撑置于其上的样本接收区2、结合区3、检测区4、控制区5和吸收区6。
[0053]在一些实施例中，可能提供一个塑料壳体(没有图示)以将测试条I包在其中。在一些实施例中，样本接收区2可能位于塑料壳体之外。
[0054]通过本发明的方法，将样本溶液与标识结合剂和结合物接触，并根据接触结合物前后的标识信号变化确定标记蛋白的浓度，用时很短。因此，本方法简单迅速。标识结合剂与结合物至少对包含特定标记的一系列蛋白普遍适用，故当需要检测包含该特定标记的任意该系列蛋白时，测试条I无需更换；因此可节省设计与制造测试条I的成本。
[0055]示例
[0056]下述实验示例为本【技术领域】内的技术人员实施本发明提供进一步的指导。示例并不限定权利要求书中界定的本发明的范围。
[0057]例I
[0058]结合垫的制备
[0059]将金-纳米颗粒溶液(I毫升，金-纳米颗粒，40纳米)(来自中国上海市上海快灵生物科技有限公司)注入一个1.5毫升的微离心试管，然后加入5微升0.2摩尔/升碳酸钾溶液(来自中国上 海市国药集团化学试剂有限公司)，振荡以充分混合。再加入另外的4微升小鼠寡聚组氨酸标记单克隆抗体(寡聚组氨酸抗体)(5毫克/毫升，来自中国上海市艾比玛特生物医药(上海)有限公司)后，立即振荡该溶液，然后等待10分钟以得到结合溶液。
[0060]然后，结合溶液以每分钟11000转的速度离心分离10分钟。去除上层清液后，将100微升含有1/1000牛血清白蛋白(来自比利时Acros Organics)的0.01摩尔/升的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液(由磷酸氢钠、磷酸二氢钠与氯化钠在水中制得)的再悬浮溶液注入微离心试管中，再次溶解与胶体金颗粒结合的寡聚组氨酸抗体(即纳米金颗粒-寡聚组氨酸抗体)。在包含20微升纳米金颗粒-寡聚组氨酸抗体与180微升结合稀释液(含有3%海藻糖、0.5%牛血清白蛋白与1%吐温20的0.01摩尔/升磷酸盐缓冲溶液)的微离心试管中置入一根3361&^玻璃纤维(0.8厘米宽X4厘米长，从美国新泽西州的通用电气医疗生物科学有限公司获得)，1-2分钟后所有溶液被该33Glass玻璃纤维均匀吸收。将其在干燥炉中以37摄氏度干燥3小时后，得到可供后续测试条组装使用的结合垫。
[0061]例2
[0062]样本垫的制备
[0063]将一根3361&88玻璃纤维(1.5厘米宽X4厘米长)浸入由含有1%牛血清白蛋白与0.5%吐温20的0.1摩尔/升磷酸盐缓冲溶液组成的样本垫溶液中，直至充分渗透。将其在干燥炉中以37摄氏度干燥3小时后，得到可供后续测试条组装使用的样本垫。
[0064]例3
[0065]含有T线与C线的膜的制备
[0066]C线溶液为通过将20微升3毫克/毫升蛋白A (来自中国杭州市隆基生物技术有限公司)与40微升0.01摩尔/升磷酸盐缓冲溶液(pH7.2)混合而制得的I毫克/毫升蛋白A溶液。
[0067]寡聚组氨酸标记绿色荧光蛋白(I毫克/毫升，在大肠杆菌中过量表达)被用作T线溶液。
[0068]将硝化纤维膜7(FF120HP，来自美国新泽西州通用电气医疗生物科学有限公司)粘在一个具有粘性的塑料支撑垫8 (DB-6，来自中国上海市上海杰一生物技术有限公司)上。
[0069]用分配平台(美国加利福尼亚州欧文市BioDot Inc.)将T线溶液与C线溶液以
0.5微升/厘米的速度分别加在FF120HP膜上，以分别形成检测区4与控制区5。
[0070]例4
[0071]条的组装
[0072]将棉质可吸水的垫6 (470，来自美国新泽西州通用电气医疗生物科学有限公司)贴在具有粘性的支撑垫8上，并与例3中粘在支撑垫8上的FF120HP膜7重叠1_2毫米。
[0073]例I中制备的结合垫3装在膜7的另外一边、与膜7有1-2毫米的重合，而样本垫2与结合垫3有1-2毫米的重合。
[0074]组合条被金标割刀ZQ2000 (中国上海市上海金标生物科技有限公司)切割成如图1和图2所示的4毫米宽的长条，用于后述实验。
[0075]例5
[0076]寡聚组氨酸标记绿色荧光蛋白的检测
[0077]纯化的寡聚组氨酸蛋白样本(在大肠杆菌中过量表达)分别被10毫摩尔/升磷酸盐缓冲液稀释至O晕克/晕升，0.268晕克/晕升,0.536晕克/晕升，1.072晕克/晕升。150微升的稀释所得的每种标准溶液被加入96孔板的一孔，然后向四个孔中分别插入一条测试条并竖立，使样本溶液可以沿测试条向上扩散。这些测试条和例4中所制备的相似，但是膜上没有C线。
[0078]10分钟后，这些测试条被取出，其照片如图3所示。在图3中，测试条I是放入不含寡聚组氨酸标记蛋白的0.01摩尔的磷酸盐缓冲液孔中的那条，测试条II是放入0.268毫克/毫升寡聚组氨酸标记蛋白的0.01摩尔的磷酸盐缓冲液孔中的那条，测试条III是放入0.536毫克/毫升寡聚组氨酸标记蛋白的0.01摩尔的磷酸盐缓冲液孔中的那条，而测试条IV是放入1.072毫克/毫升组氨酸标记蛋白的0.01摩尔的磷酸盐缓冲液孔中的那条。可以从图3看出，测试条中T线4的颜色随着寡聚组氨酸标记蛋白浓度的增加而变浅，也就是，测试条I的T线的颜色最深，而测试条IV的T线颜色最浅。
[0079]测试条被放置于金标测试条阅读器DT2030(中国上海市上海金标生物科技有限公司)，读取基于T线信号强度的定量信号。图4所示为测试条上T线峰值相对于寡聚组氨酸标记蛋白样品浓度的校正曲线。
[0080]例6
[0081]例5中的实验在本例中重复，但是扩散至测试条V，VI和VII的样本溶液的浓度与例5不同，且本例中测试条均含C线。
[0082]图5中展示了含有3个测试条的照片，其中，测试条V浸入的是完全不含寡聚组氨酸标记蛋白的0.01摩尔/升磷酸盐缓冲溶液，测试条VI浸入的是含有3克/升寡聚组氨酸标记蛋白的0.01摩尔/升磷酸盐缓冲溶液，测试条VII浸入的是含有5克/升寡聚组氨酸标记蛋白的0.0l摩尔/升磷酸盐缓冲溶液。图5的结果表明在实验条件下，寡聚组氨酸标记绿色荧光蛋白的检测上限可超过3毫克/毫升。
[0083]尽管在【具体实施方式】中对本发明的部分特征进行了详细的说明和描述，但在不脱离本发明精神的前提下，可以对本发明进行各种改变和替换。同样的，本领域熟练技术人员也可以根据常规实验获得本发明公开的其它改变和等同物。所有这些改变，替换和等同物都在本发明所定义的权利要求的构思和范围之内。
【权利要求】
1.一种检测标记蛋白的方法，其特征在于，包括: 将包含标记蛋白的样本溶液和能够与该标记蛋白的标记相结合的标识结合剂接触； 将该样本溶液与结合物接触，该结合物可与未和标记结合的标识结合剂相结合；并且，根据该样本溶液和结合物接触所引起的标识信号变化，确定该样本溶液中标记蛋白的浓度。
2.如权利要求1所述的检测标记蛋白的方法，其特征在于，其包括: 提供具有样本接收区、结合区与检测区的测试条，其中，结合区包含该标识结合剂，检测区包含该结合物； 将该包含标记蛋白的样本溶液扩散并通过样本接收区、结合区与检测区；和根据该包含标记蛋白的样本溶液扩散并通过检测区所引起的标识信号变化，确定该样本溶液中标记蛋白的浓度。
3.如权利要求2所述的检测标记蛋白的方法，其特征在于，所述根据标识信号变化确定该样本溶液中标记蛋白的浓度是指根据检测区的颜色变化。
4.一种检测标记蛋白的装置，其包括: 测试条，其包含: 样本接收区，以接收包含标记蛋白的样本溶液； 结合区，其包含能够与该标记蛋白的标记结合的标识结合剂；和 检测区，其包含可与未和标记结合的标识结合剂相结合的结合物。
5.如权利要求4所述的检测标记蛋白的装置，其特征在于，所述测试条包括包含能够与标识结合剂结合的控制物的控制区，所述控制物是蛋白A或其IgG结合变体、蛋白G或其IgG结合变体、蛋白L或其IgG结合变体、及针对人体抗体可结晶片段的结合剂的非人体抗体的结合剂中的至少一种。
6.如权利要求4所述的装置，其特征在于，所述标识结合剂包含来源于胶体金、乳胶珠、荧光微球、磁珠、量子点和升频转换磷中的至少一种的标识物。
7.如权利要求4所述的装置，其特征在于，所述标识结合剂包括包含抗体、抗体片段或适体中的至少一种的结合剂。
8.如权利要求4至7中任一权利要求所述的检测标记蛋白的装置，其特征在于，所述标记是寡聚组氨酸、谷胱苷肽硫基转移酶、多肽标记物、链霉结合肽I1、麦芽糖结合蛋白、血球凝集素、原癌基因、T7标记、S标记、钙调蛋白结合肽、抗体的可结晶片段、类弹性蛋白多肽、硫氧还蛋白、NusA和白蛋白结合域中的至少一种。
9.如权利要求8所述的检测标记蛋白的装置，其特征在于，所述测试条包括包含能够与标识结合剂结合的控制物的控制区，所述控制物是蛋白A。
10.如权利要求9所述的检测标记蛋白的装置，其特征在于，所述标记是寡聚组氨酸，标识结合剂包含寡聚组氨酸抗体。
11.如权利要求10所述的检测标记蛋白的装置，其特征在于，所述标识结合剂包含来源于胶体金的标识物。
12.如权利要求8所述的检测标记蛋白的装置，其中标记是人体抗体的可结晶片段，而且标识结合剂包括人体抗体的可结晶片段的抗体，所述测试条包括包含可与标识结合剂结合的控制物，其中控制物是针对人体抗体可结晶片段的结合剂的非人体抗体的结合剂。
【文档编号】G01N21/78GK103852465SQ201210505981
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2012年11月30日
【发明者】贡纳.马姆奎斯特, 阿克.丹尼尔森, 陆梁华, 侯嵘, 陈林 申请人:通用电气公司
【专利摘要】一种检测标记蛋白的方法，其包括：将包含标记蛋白的样本溶液和能够与该标记蛋白的标记相结合的标识结合剂接触；将该样本溶液与结合物接触，该结合物可与未和标记结合的标识结合剂相结合；并且，根据该样本溶液和结合物接触所引起的标识信号变化，确定该样本溶液中标记蛋白的浓度。本发明还涉及一种检测标记蛋白的装置。
【专利说明】检测标记蛋白的方法和装置
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及检测标记蛋白的方法和装置。
【背景技术】
[0002]标记蛋白在蛋白表达与纯化中已非常引人注目。鉴于标记蛋白在结构和功能研究中的应用持续增长，需要能够迅速、便利地对标记蛋白检测的方法。
[0003]目前，对复杂混合物中标记蛋白的检测通常需要至少两个小时，因而常常显得冗长。现有检测方法的示例有酶联免疫吸附试验法、蛋白免疫印迹法和基于特定着色的方法。前述最后一类方法的一个示例为针对寡聚组氨酸标记融合蛋白进行特定且敏感染色的InVision?寡聚组氨酸标记凝胶内染色，分类号LC6030、LC6033。根据从互联网网址http://tools, invitrogen.com/content/sfs/manuals/invisionstain_man.pdf 可获取的使用说明(修订于2012年3月19日，出版号为25-0671)，为寡聚组氨酸标记融合蛋白染色以供检测至少需要2小时20分钟。
[0004]因此，有必要开发新的或者改进的检测标记蛋白的方法和装置。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种新的或者改进的检测标记蛋白的方法和装置。
[0006]一方面，本发明涉及的方法包括:将包含标记蛋白的样本溶液和能够与该标记蛋白的标记相结合的标识结合剂接触；将该样本溶液与结合物接触，该结合物可与未和标记结合的标识结合剂相结合；并且，根据该样本溶液和结合物接触所引起的标识信号变化，确定该样本溶液中标记蛋白的浓度。
[0007]另一方面，本发明涉及的装置包括:测试条，其包含:样本接收区，以接收包含标记蛋白的样本溶液；结合区，其包含能够与该标记蛋白的标记结合的标识结合剂；和检测区，其包含可与未和标记结合的标识结合剂相结合的结合物。
[0008]本发明所涉及的检测标记蛋白的方法和装置解决了现有技术的技术问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]通过结合附图对于本发明的实施例进行描述，可以更好地理解本发明，在附图中:
[0010]图1是根据本发明的一个实施例所提供的装置的测试条的立体示意图。
[0011]图2是是图1中测试条的剖面示意图。
[0012]图3是例5中获得的照片。
[0013]图4是例5中获得的图表。
[0014]图5是例6中获得的照片。
【具体实施方式】[0015]说明书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。
[0016]在以下的说明书和权利要求中，除非清楚地另外指出，单复数不加以限制。
[0017]本申请所提及的“可”、“可以”、“可能”和“可为”表示在一定环境下发生的可能性；具有指定的性质，特征或者功能的可能性；和/或通过显示一个或者多个能力、性能而适合于另一种动作，或者与该适合的动作相关的可能性。因此，用于“可”、“可以”、“可能”和“可为”表示修饰的术语显然适合、能够或者适于所表示的能力，功能，或者用途，同时考虑在一些情况下，所修饰的术语可能有时不适合、不能或者不合适。例如，在一些情况下，事件或者能力可能是所期望的，而在其它情况下，该事件或者能力不能发生。这种区别通过术语“可”、“可以”、“可能”和“可为”涵盖。
[0018]本发明涉及的方法可用于检测样本溶液中标记蛋白的存在和/或数量，S卩，标记蛋白的浓度。
[0019]样本溶液可能是包含标记蛋白的任何溶液。样本溶液可能是用标记蛋白制得的溶液。在一些实施例中，样本溶液可由纯化的标记蛋白样本用例如磷酸盐缓冲溶液缓冲稀释而得。
[0020]本发明提及的“标记蛋白”表示包含标记的蛋白。标记的例子包括但不限于，寡聚组氨酸、谷胱苷肽硫基转移酶、多肽标记物、链霉结合肽I1、麦芽糖结合蛋白、血球凝集素、原癌基因、T7标记、S标记、钙调蛋白结合肽、类弹性蛋白多肽、抗体的可结晶片段、硫氧还蛋白、NusA和白蛋白结合域。标记蛋白的示例包括但不限于寡聚组氨酸标记蛋白和有可结晶片段的人体抗体。
[0021]在包含标记蛋白的样本溶液与标识结合剂接触后，标记与该标识结合剂结合。本发明中提及的“标识结合剂”是指与标识物结合的结合剂。该标识结合剂能够与标记蛋白的标记相结合。结合剂的例子包括但不限于，抗体、抗体片段或适体。在一些实施例中，结合剂是标记的特异性抗体，例如寡聚组氨酸的特异性抗体，或者针对人体抗体可结晶片段的特异性非人体抗体。寡聚组氨酸的特异性抗体的一个示例为可从如美国宾夕法尼亚州Gilbertsville市Rockland Immunochemicals Inc.获取的抗-6X寡聚组氨酸抗原决定标记(兔)抗体，产品标号600-401-382。针对人体抗体可结晶片段的特异性非人体抗体的一个不例为可从如美国宾夕法尼亚州Gilbertsville市Rocklandlmmunochemicals Inc.获取的抗人体IgG可结晶片段(山羊)抗体，产品标号609-1103。
[0022]标识物可能是任何能够被视觉检测或光学仪器检测到的物理的、或化学的标识物。标识物可能是通过反应产生颜色的酶-基质组合、有色微粒(例如橡胶微粒)、胶态金属、金属熔胶、碳熔胶、荧光物质、以及脂质体囊或聚合体囊。标识物来源示例包括但不限于，胶体金、乳胶珠、荧光微球、磁珠、量子点和升频转换磷。在一些实施例中，标识物来源于胶体金。
[0023]当将样本溶液和结合物接触时，如果有未与标记结合的标识结合剂，该标识结合剂与结合物结合，从而在接触前后产生标识信号变化。
[0024]本发明提及的“结合物”是指可与未和标记结合的标识结合剂相结合的物质。在一些实施例中，结合物是一种不同于标记蛋白的物质(如肽、蛋白、或微球)，但包含该标记。在一些实施例中，结合物是标记。
[0025]由于信号的强度是与标识物的数量有关，从而与样本溶液中标记蛋白的浓度负相关，因此标记蛋白的浓度可通过诸如视觉或使用光谱学检测到的信号变化确定。在使用光谱学时，可建立一个校准曲线，用于量化标记蛋白的浓度。
[0026]在一些实施例中，样本溶液在与结合物接触后，与控制物相接触。
[0027]本发明中提及的“控制物”是指一种能够与标识结合剂相结合的物质。在一些实施例中，控制物是针对人体抗体可结晶片段的结合剂的非人体抗体的结合剂。针对人体抗体可结晶片段的结合剂的非人体抗体的结合剂的一个示例是可从如美国宾夕法尼亚州Gilbertsville 市 Rockland Immunochemicals Inc.获取的抗山羊 IgG 可结晶片段(兔)抗体，产品标号105-4103。抗山羊抗体确保只有来自山羊的配对抗体会被截留。来自山羊以外的其他物种的抗体对也可用。
[0028]蛋白A或G既可以与抗人体IgG (山羊)之类的抗体结合，也可与任何人体IgG分析物相结合，故可以用作控制物。在一些实施例中，控制物是蛋白A或其IgG结合变体、蛋白G或其IgG结合变体、和蛋白L或其IgG结合变体中的至少一种。在一些实施例中，控制物只有一种，是蛋白A。
[0029]蛋白A的一个示例可从美国新泽西州通用电气医疗生物科学公司获取，产品号为17-0872-02。蛋白A的IgG结合变体的一个示例为可从美国新泽西州通用电气医疗生物科学公司获取的MabSelect SuRe?配体。蛋白G的一个示例可从美国新泽西州通用电气医疗生物科学公司获取，产品号为17-0619-09。
[0030]在下文中，将根据【专利附图】
【附图说明】本发明的实施方式，将不会详细描述众所周知的功能和结构，以避免因不必要的细节而使本发明变得令人费解。
[0031]请参考图1和图2，根据本发明的一个实施例提供的一个装置的一个测试条I包括:用于接收包含标记蛋白的样本溶液的样本接收区2 ;包含能够与标记蛋白的标记结合的标识结合剂的结合区3 ;和包含可与未和标记结合的标识结合剂相结合的结合物的检测区4。
[0032]在一些实施例中，可将样本溶液扩散通过结合区3和检测区4以与标识结合剂和结合物相接触。相应地，标记蛋白的浓度可根据包含标记蛋白的样本溶液扩散通过检测区4前后，检测区4的信号变化予以确定。
[0033]样本接收区2可能是样本溶液能够添加并由此扩散的任何形状或结构。样本接收区2可能是测试条I的一部分或者是一个样本垫。
[0034]在一些实施例中，样本接收区2可能是通过将一个玻璃纤维条浸入一种包含诸如牛血清白蛋白、吐温20的磷酸盐缓冲溶液中，并在饱和后将该玻璃纤维条干燥而制得的一个样本垫。
[0035]可通过诸如将样本溶液滴在样本溶液接收区2或将样本接收区2浸入样本溶液中等方式，从而使样本溶液与样本接收区2接触。
[0036]样本溶液从样本接收区2通过毛细作用向前扩散。当样本溶液扩散通过结合区3时，标识结合剂从结合区3释放出来以与样本溶液一起向前扩散。标记蛋白的标记与一些标识结合剂结合。[0037]结合区3可能是样本溶液能够由此扩散的任何形状或结构。结合区3可能是测试条I的一部分或者是一个结合垫。
[0038]在一些实施例中，结合区3可能是通过用一个玻璃纤维条吸收结合溶液后干燥而制得的一个结合垫。该结合溶液包含标识结合剂。
[0039]当样本溶液扩散通过检测区4时，一些未与标记结合的标识结合剂与结合物结合，并停留在检测区4。
[0040]检测区4的标识物产生的信号可通过裸眼观察或使用光学仪器进行检测。
[0041]在一些实施例中，标识结合剂为彩色，样本溶液中标记蛋白的浓度根据检测区4的颜色变化确定。在一些实施例中，检测区4的颜色随着样本溶液中标记蛋白的浓度的增加或减少而变化。因此，标记蛋白的存在和/或数量可通过检测颜色的变化来确定。
[0042]例如，如果样本溶液中没有标记蛋白，检测区4的颜色增至最强，因为来自结合区3的标识结合剂能停留的都停留在检测区4。相似地，如果第一测试条的检测区的颜色比第二测试条的检测区的颜色深，则用第一测试条检测的第一样本溶液中标记蛋白的浓度低于用第二测试条检测的第二样本溶液中标记蛋白的浓度，反之亦然。颜色的变化可通过视觉观察或使用光谱学进行检测。
[0043]在一些实施例中，检测区4中标识物的信号强度可通过光学仪器进行检测。检测区4的信号强度可能是该光学仪器的输出。在一些实施例中，信号强度是测试条阅读器输出信号最高点的高度。
[0044]将已知标记蛋白浓度的溶液在测试条上扩散并检测相应检测区的信号强度，可建立标记蛋白的浓度与检测区信号强度之间的函数公式。待测样本溶液中标记蛋白的浓度可通过使用该函数公式与测得的检测区4的相应信号强度而计算得出。
[0045]在一些实施例中，测试条I包括包含控制物的控制区5。样本溶液通过检测区4后向前扩散，未在检测区4停留的标识结合剂与控制区5的控制物结合，停留在控制区5。
[0046]控制区5中标识物产生的信号可通过裸眼观察或使用光学仪器进行检测。一些实施例中，控制区5信号的产生表明样本溶液从检测区4向控制区5扩散的完成。一些实施例中，如果所有的标识结合剂都停留在检测区4，在控制区5将不能检测到标识物。一些实施例中，如果部分标识结合剂停留在检测区4，因为标记蛋白的浓度与控制区5的标识物数量正相关，所以控制区5测得的标识物的数量可用于提高样本溶液中标记蛋白浓度的检测精度。
[0047]检测区4与控制区5也可被分别称作T线与C线。在一些实施例中，检测区4与控制区5可能通过将一种T线溶液与一种C线溶液分别加在一个膜7的两个相互隔开的区域而形成。膜7可由如硝化纤维制得。T线溶液包含结合物。C线溶液包含控制物。
[0048]在一些实施例中，测试条I包含吸收区6，其距离控制区5比距离检测区4近。
[0049]吸收区6帮助增强样本溶液离开样本接收区2的毛细作用，以牵引样本溶液离开样本接收区2，通过结合区3、检测区4与控制区5。吸收区6可能是测试条I的一部分或者是一个吸收垫。在一些实施例中，吸收区6可能是由吸水材料如棉纸、纤维素、二氧化硅微纤维滤纸、玻璃纤维与石英纤维滤纸等制成的吸收垫。
[0050]测试条I可能是包含任何吸水材料、并能够让样本溶液扩散的长形条。测试条I的样本接收区2、结合区3、检测区4、控制区5与吸收区6可由相同或不同材料制成。测试条I的样本吸收区2、结合区3、检测区4、控制区5与吸收区6 —体成型或组装在一起。
[0051]在一些实施例中，样本接收区2、结合区3、膜7与吸收区6组装在一起。一些实施例中，结合区3与样本接收区2和膜7重叠，且膜7也与吸收区6重叠。
[0052]在一些实施例中，测试条I可能包含一个由诸如塑料材料如聚酯(Mylar? )或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)制成的支撑垫8，以支撑置于其上的样本接收区2、结合区3、检测区4、控制区5和吸收区6。
[0053]在一些实施例中，可能提供一个塑料壳体(没有图示)以将测试条I包在其中。在一些实施例中，样本接收区2可能位于塑料壳体之外。
[0054]通过本发明的方法，将样本溶液与标识结合剂和结合物接触，并根据接触结合物前后的标识信号变化确定标记蛋白的浓度，用时很短。因此，本方法简单迅速。标识结合剂与结合物至少对包含特定标记的一系列蛋白普遍适用，故当需要检测包含该特定标记的任意该系列蛋白时，测试条I无需更换；因此可节省设计与制造测试条I的成本。
[0055]示例
[0056]下述实验示例为本【技术领域】内的技术人员实施本发明提供进一步的指导。示例并不限定权利要求书中界定的本发明的范围。
[0057]例I
[0058]结合垫的制备
[0059]将金-纳米颗粒溶液(I毫升，金-纳米颗粒，40纳米)(来自中国上海市上海快灵生物科技有限公司)注入一个1.5毫升的微离心试管，然后加入5微升0.2摩尔/升碳酸钾溶液(来自中国上 海市国药集团化学试剂有限公司)，振荡以充分混合。再加入另外的4微升小鼠寡聚组氨酸标记单克隆抗体(寡聚组氨酸抗体)(5毫克/毫升，来自中国上海市艾比玛特生物医药(上海)有限公司)后，立即振荡该溶液，然后等待10分钟以得到结合溶液。
[0060]然后，结合溶液以每分钟11000转的速度离心分离10分钟。去除上层清液后，将100微升含有1/1000牛血清白蛋白(来自比利时Acros Organics)的0.01摩尔/升的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液(由磷酸氢钠、磷酸二氢钠与氯化钠在水中制得)的再悬浮溶液注入微离心试管中，再次溶解与胶体金颗粒结合的寡聚组氨酸抗体(即纳米金颗粒-寡聚组氨酸抗体)。在包含20微升纳米金颗粒-寡聚组氨酸抗体与180微升结合稀释液(含有3%海藻糖、0.5%牛血清白蛋白与1%吐温20的0.01摩尔/升磷酸盐缓冲溶液)的微离心试管中置入一根3361&^玻璃纤维(0.8厘米宽X4厘米长，从美国新泽西州的通用电气医疗生物科学有限公司获得)，1-2分钟后所有溶液被该33Glass玻璃纤维均匀吸收。将其在干燥炉中以37摄氏度干燥3小时后，得到可供后续测试条组装使用的结合垫。
[0061]例2
[0062]样本垫的制备
[0063]将一根3361&88玻璃纤维(1.5厘米宽X4厘米长)浸入由含有1%牛血清白蛋白与0.5%吐温20的0.1摩尔/升磷酸盐缓冲溶液组成的样本垫溶液中，直至充分渗透。将其在干燥炉中以37摄氏度干燥3小时后，得到可供后续测试条组装使用的样本垫。
[0064]例3
[0065]含有T线与C线的膜的制备
[0066]C线溶液为通过将20微升3毫克/毫升蛋白A (来自中国杭州市隆基生物技术有限公司)与40微升0.01摩尔/升磷酸盐缓冲溶液(pH7.2)混合而制得的I毫克/毫升蛋白A溶液。
[0067]寡聚组氨酸标记绿色荧光蛋白(I毫克/毫升，在大肠杆菌中过量表达)被用作T线溶液。
[0068]将硝化纤维膜7(FF120HP，来自美国新泽西州通用电气医疗生物科学有限公司)粘在一个具有粘性的塑料支撑垫8 (DB-6，来自中国上海市上海杰一生物技术有限公司)上。
[0069]用分配平台(美国加利福尼亚州欧文市BioDot Inc.)将T线溶液与C线溶液以
0.5微升/厘米的速度分别加在FF120HP膜上，以分别形成检测区4与控制区5。
[0070]例4
[0071]条的组装
[0072]将棉质可吸水的垫6 (470，来自美国新泽西州通用电气医疗生物科学有限公司)贴在具有粘性的支撑垫8上，并与例3中粘在支撑垫8上的FF120HP膜7重叠1_2毫米。
[0073]例I中制备的结合垫3装在膜7的另外一边、与膜7有1-2毫米的重合，而样本垫2与结合垫3有1-2毫米的重合。
[0074]组合条被金标割刀ZQ2000 (中国上海市上海金标生物科技有限公司)切割成如图1和图2所示的4毫米宽的长条，用于后述实验。
[0075]例5
[0076]寡聚组氨酸标记绿色荧光蛋白的检测
[0077]纯化的寡聚组氨酸蛋白样本(在大肠杆菌中过量表达)分别被10毫摩尔/升磷酸盐缓冲液稀释至O晕克/晕升，0.268晕克/晕升,0.536晕克/晕升，1.072晕克/晕升。150微升的稀释所得的每种标准溶液被加入96孔板的一孔，然后向四个孔中分别插入一条测试条并竖立，使样本溶液可以沿测试条向上扩散。这些测试条和例4中所制备的相似，但是膜上没有C线。
[0078]10分钟后，这些测试条被取出，其照片如图3所示。在图3中，测试条I是放入不含寡聚组氨酸标记蛋白的0.01摩尔的磷酸盐缓冲液孔中的那条，测试条II是放入0.268毫克/毫升寡聚组氨酸标记蛋白的0.01摩尔的磷酸盐缓冲液孔中的那条，测试条III是放入0.536毫克/毫升寡聚组氨酸标记蛋白的0.01摩尔的磷酸盐缓冲液孔中的那条，而测试条IV是放入1.072毫克/毫升组氨酸标记蛋白的0.01摩尔的磷酸盐缓冲液孔中的那条。可以从图3看出，测试条中T线4的颜色随着寡聚组氨酸标记蛋白浓度的增加而变浅，也就是，测试条I的T线的颜色最深，而测试条IV的T线颜色最浅。
[0079]测试条被放置于金标测试条阅读器DT2030(中国上海市上海金标生物科技有限公司)，读取基于T线信号强度的定量信号。图4所示为测试条上T线峰值相对于寡聚组氨酸标记蛋白样品浓度的校正曲线。
[0080]例6
[0081]例5中的实验在本例中重复，但是扩散至测试条V，VI和VII的样本溶液的浓度与例5不同，且本例中测试条均含C线。
[0082]图5中展示了含有3个测试条的照片，其中，测试条V浸入的是完全不含寡聚组氨酸标记蛋白的0.01摩尔/升磷酸盐缓冲溶液，测试条VI浸入的是含有3克/升寡聚组氨酸标记蛋白的0.01摩尔/升磷酸盐缓冲溶液，测试条VII浸入的是含有5克/升寡聚组氨酸标记蛋白的0.0l摩尔/升磷酸盐缓冲溶液。图5的结果表明在实验条件下，寡聚组氨酸标记绿色荧光蛋白的检测上限可超过3毫克/毫升。
[0083]尽管在【具体实施方式】中对本发明的部分特征进行了详细的说明和描述，但在不脱离本发明精神的前提下，可以对本发明进行各种改变和替换。同样的，本领域熟练技术人员也可以根据常规实验获得本发明公开的其它改变和等同物。所有这些改变，替换和等同物都在本发明所定义的权利要求的构思和范围之内。
【权利要求】
1.一种检测标记蛋白的方法，其特征在于，包括: 将包含标记蛋白的样本溶液和能够与该标记蛋白的标记相结合的标识结合剂接触； 将该样本溶液与结合物接触，该结合物可与未和标记结合的标识结合剂相结合；并且，根据该样本溶液和结合物接触所引起的标识信号变化，确定该样本溶液中标记蛋白的浓度。
2.如权利要求1所述的检测标记蛋白的方法，其特征在于，其包括: 提供具有样本接收区、结合区与检测区的测试条，其中，结合区包含该标识结合剂，检测区包含该结合物； 将该包含标记蛋白的样本溶液扩散并通过样本接收区、结合区与检测区；和根据该包含标记蛋白的样本溶液扩散并通过检测区所引起的标识信号变化，确定该样本溶液中标记蛋白的浓度。
3.如权利要求2所述的检测标记蛋白的方法，其特征在于，所述根据标识信号变化确定该样本溶液中标记蛋白的浓度是指根据检测区的颜色变化。
4.一种检测标记蛋白的装置，其包括: 测试条，其包含: 样本接收区，以接收包含标记蛋白的样本溶液； 结合区，其包含能够与该标记蛋白的标记结合的标识结合剂；和 检测区，其包含可与未和标记结合的标识结合剂相结合的结合物。
5.如权利要求4所述的检测标记蛋白的装置，其特征在于，所述测试条包括包含能够与标识结合剂结合的控制物的控制区，所述控制物是蛋白A或其IgG结合变体、蛋白G或其IgG结合变体、蛋白L或其IgG结合变体、及针对人体抗体可结晶片段的结合剂的非人体抗体的结合剂中的至少一种。
6.如权利要求4所述的装置，其特征在于，所述标识结合剂包含来源于胶体金、乳胶珠、荧光微球、磁珠、量子点和升频转换磷中的至少一种的标识物。
7.如权利要求4所述的装置，其特征在于，所述标识结合剂包括包含抗体、抗体片段或适体中的至少一种的结合剂。
8.如权利要求4至7中任一权利要求所述的检测标记蛋白的装置，其特征在于，所述标记是寡聚组氨酸、谷胱苷肽硫基转移酶、多肽标记物、链霉结合肽I1、麦芽糖结合蛋白、血球凝集素、原癌基因、T7标记、S标记、钙调蛋白结合肽、抗体的可结晶片段、类弹性蛋白多肽、硫氧还蛋白、NusA和白蛋白结合域中的至少一种。
9.如权利要求8所述的检测标记蛋白的装置，其特征在于，所述测试条包括包含能够与标识结合剂结合的控制物的控制区，所述控制物是蛋白A。
10.如权利要求9所述的检测标记蛋白的装置，其特征在于，所述标记是寡聚组氨酸，标识结合剂包含寡聚组氨酸抗体。
11.如权利要求10所述的检测标记蛋白的装置，其特征在于，所述标识结合剂包含来源于胶体金的标识物。
12.如权利要求8所述的检测标记蛋白的装置，其中标记是人体抗体的可结晶片段，而且标识结合剂包括人体抗体的可结晶片段的抗体，所述测试条包括包含可与标识结合剂结合的控制物，其中控制物是针对人体抗体可结晶片段的结合剂的非人体抗体的结合剂。
【文档编号】G01N21/78GK103852465SQ201210505981
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2012年11月30日
【发明者】贡纳.马姆奎斯特, 阿克.丹尼尔森, 陆梁华, 侯嵘, 陈林 申请人:通用电气公司
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